ENZIMOLOGÍA DE

ALIMENTOS
Dr. Santiago Gallegos Tíntore

Practica:
ZIMOGRAFIA DE PROTEINAS EN GELES

Equipo 4
Bardales Echeverría Nelly
Cortés Gutiérrez Mayra
Gamboa Castañeda Rigoberto
Pacheco Uc Nidia
 ZIMOGRAFÌA DE PROTEINAS EN GELES

Autores:

Bardales E. N., Cortés G. M., Gamboa C. R., Pacheco U. N.

Resumen

La zimografia sirve para identificar las proteínas con actividad de gelatinasas, por
lo que en tal método las alícuotas de los extractos se corrieron en geles de
poliacrilamida, copolimerizados con un porcentaje de gelatina con el objetivo del
análisis y caracterización de proteínas.
La técnica de zimografia trabaja en condiciones desnaturalizantes, es el mismo
procedimiento que la electroforesis en gel de policrilamida, las diferencias son en
la preparación del gel al 13% que se le agrega gelatina. Para la visualización de
las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción, siendo el más habitual el
azul de coomassie.
Introducción

La zimografía es una técnica electroforética que permite observar actividad de

proteasas. Se realiza con poliacrilamida y a diferencia de las electroforesis de
proteínas más simples, la polimerización de la poliacrilamida se realiza en
presencia de gelatina soluble. De esta manera el gel resultante de la
polimerización contiene gelatina (colágeno desnaturalizado) (García, 2000).

La zimografía incorpora una separación electroforética de proteínas bajo

condiciones desnaturalizantes, pero no reductoras, usando un gel de
poliacrilamida copolimerizado con una proteína (gelatina o caseína). Las proteínas
analizadas son re-naturalizadas mediante el uso de un detergente, Tritón X-100,
posteriormente el gel es incubado en una solución apropiada para el estudio de las
proteínas analizadas y teñido con azul de Coomassie, observándose las zonas de
actividad enzimática claras contra un fondo oscuro (García, 2000).

El ensayo de zimografía es una técnica útil para la detección e identificación de las

formas inactivas y activas de ciertas Metaloproteasas de Matriz Extracelular
(García, 2000).
La utilización científica es bastante utilizada en el área de la medicina mediante
la detección de metaloproteasas en el precipitado de euglobulina plasmática, ya
que las metaloproteasas (MMPs) participan en la degradación de las matrices
extracelulares durante la inavacion tumoral. De este modo la actividad de las
MMPs presentes en plasma entero y fracción euglobulina se evalúa mediante la
técnica de zimografía en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes
copoliremizados con gelatina. La determinación de las MMP es relevante en
numerosas condiciones fisiopatológicas, puesto que la actividad desequilibrada de
las MMPs está vinculada con muchas condiciones clínicas, incluidas las
enfermedades cardiovasculares, sobre todo si se asocia con la remodelación de la
matriz extracelular. (Alonso, 1994)

Las diferencias entre los métodos de electroforesis leammil, shagger y Von Jadow.
El primero radica que utiliza tampones de diferente pH y composición para generar
un gradiente de voltaje y un pH discontinuo entre el gel de apilamiento y el gel de
resolución. Mientras que el segundo tienen la particularidad de usar dos buffers
distintos. Un buffer catódico de tricina y un buffer anódico de Tris-HCl. La tricina es
utilizada como ión de arrastre en el buffer catódico, permitiendo una mayor
resolución de proteínas pequeñas a menores concentraciones de acrilamida que
en el caso del clásico buffer Tris-glicina. (Von Jagow, 2003)

Es posible realizar la cuantificación de actividad enzimática ya que observando

las zonas claras de actividad enzimática contra un fondo oscuro. La zimografía
en gelatina es usada principalmente para la detección de las gelatinasas MMP-2 y
MMP-9, esta técnica es extremadamente sensible, ya que puede detectar niveles
muy bajos de MMP-2. De igual manera se considera también que otras MMPs,
como MMP-1, MMP-8 y MMP-13, pueden digerir este sustrato, aunque con menor
especificidad que las gelatinasas. (Hawkes.S,2001)

Las metaloproteasas (MMP, de matrixmetalloproteinase) son una familia de

proteasas que incluye más de diez componentes. Estas proteasas dependen para
su accionar de la presencia de cationes bivalentes (Zn++), actuando sobre una
serie de sustratos según el tipo de MMP. Los distintos tipos de colágeno son los
sustratos principales de estas proteasas (García, 2000).

Metodologia:

Material Reactivos Equipos

 1 pipetaautomática de 0.5-10 µl  Regulador del ánodo  Cámara de
 1 pipetaautomatica de 20-200µl (fuera) electroforesis
 1 pipetaautomatica de 1000µl  Regulador del cátodo Miniprotean
 1 pipetaautomatica de 5 ml (Cámara de los geles) (Biorad)
 12 tubos Eppendorf  Regulador del Gel  Fuente de poder
 1 piseta  Glicerol (Biorad)
 1 vaso de precipitado de 50 ml  TEMED
 1 gradilla para tubos de ensaye  Persulfato de Amonio
 10 puntas de 10 µl al 10%
 10 puntas de 200µl  Solución para teñir el
 10 puntas de 1000µl gel
 4 puntas de 5 ml  Solución desteñidora
 1 gradilla para tubos Eppendorf  Regulador Fosfato de
 4 tubos falcon de 15 ml Potasio 50 mM pH
 1 gradilla flotante para tubos 7.0 a 30°C
Eppendorf  solución de
acrilamida-
bisacrilamida
 agua
 gelatina
Procedimiento :

A) Preparación de las muestras

1. Se tomaron 20 µL de extracto enzimático de bromelina sin diluir
2. Se añadieron 40 µL de regulador de muestra con mercaptoetanol (ME)
3. Se agito 30 s en vórtex la muestra

Inicio

Se tomaron

20 µL de extracto enzimático de
bromelina sin diluir

Se añadieron

40 µL de regulador de muestra

Se agitaron

30 s en vórtex la muestra

Fin

Figura 1. Diagrama de flujo de la Preparación de las muestras

B) preparacion del gel al 13 %

1. Se montaron la Cámara de electroforesis

2. Se añadieron 0.65 gr de glicerol, 1.3 ml de acrilamida-bisacrilamida, 1,35 ml de
agua, dodecil sulfato de sodio, 25 µl de persulfato de amonio, gelatina y 7.5 µl de
TEMED
3. Se dejaron reposar por diez minutos
4. Se preparó el concentrado del gel
5. Se añadieron 0.7 de acrilamida-bisacrilamida, 2ml de agua, 1,35 del regulador
del gel, 16 µl de persulfato de amonio y 7.5µl de TEMED
6. Se dejaron reposar
7. Se procedió a la electroforesis 40 mA por 2 h

Inicio

Se monto
Cámara de electroforesis y se
añadieron glicerol, acrilamida-
Fin
bisacrilamida, agua, SDS, persulfato
amonio, gelatina y TEMED
Se dejó
Se destiño

Reposar por diez minutos Durante un día (24hrs)

Se preparó
Se tiño
El concentrado del gel y se añadieron
acrilamida-bisacrilamida, agua, Con solución de azul de Coomasie al
regulador del gel, persulfato de amonio 0.01% 45 min
y TEMED
Se dejó Se procedió

Reposar por diez minutos

A la electroforesis 40 mA por 2 h

Figura 2. Diagrama de la elaboracion de gel

Resultados
No se pueden establecer, ya que en el gel no se pueden observar las bandas
trasparentes de las enzimas que se inyectaron en el gel.

Figura 3. Detección de la actividad enzimática en extracto crudo de la Bromelina por medio de

zimografia en gel con gelatina como sustrato.

Discusión

Según la técnica reportada por Hernández y Meraz , nos sirve para observar la
actividad enzimática en condiciones suaves, sin agentes que puedan
desnaturalizar, por ello no se utilizó el mercaptoetanol, sin embargo, observando el
gel después de desteñirlo, no se pudieron observar las bandas trasparentes, eso
nos puede indicar que las enzimas no poseen actividad o si la tienen es muy baja
la actividad proteolítica, ya que ya lleva varios meses desde su extracción y
siempre en cada practica se sacaba del baño de hielo y se calentaban, luego se
volvían a enfriar. Esto pudo ocasionar que al momento de que la gelatina
interactúe con la enzima, no se pudo, por ello no se pudieron observar en el gel.
Debido a que la poliacrilamida se obtiene mediante la formación de catalizadores
que inician y aceleran el proceso de la formación de gel, por lo tanto estos se
agregan iniciando con el persufato y luego seguido por el TEMED, estos últimos
actúan como un propagador de reacción de pH en un medio básico, ya que
teniendo un pH acido esto retardaría la polimerización. Debido a lo comentado
anteriormente pudo a ver afectado las concentraciones de Persulfato y TEMED ya
que estos dos reactivos controlan la velocidad de polimerización y no agregar las
concentraciones correctas esto hace que la polimerización no alcance una optima
velocidad para la formación de gel y esto afecta la lectura de los resultados finales.

Otro factor que pudo influir es en la preparación del gel se debe a que
posiblemente estuvo expuesto a presencia de oxigeno dado que esto inhíbela la
polimerización debido a esto surge la formación de burbujas esto causando la
distorsión del gel y por lo tanto causando alteraciones en el campo eléctrico.

Conclusión
El objetivo de la práctica era la determinación de la actividad enzimática, la cual no
se pudo determinar por diversos factores que pudieron interferir en la correcta
lectura del gel.

Referencias

-Fernández y otros (2003). A 39-kDa Cysteine Proteinase CP39 from Trichomonas

vaginalis, Which Is Negatively Affected by Iron May Be Involved in Trichomonal
Cytotoxicity. J. Eukaryot. Microbiol.

-García Pérez M. 2000. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad

e importancia. Universo Diagnóstico. La Habana, Cuba. Vol. 1(2):31-4.

-Meraz Noemí y otros (2006).Identificación de la metaloproteasa de matriz extracelular-3

en la membrana fetal de la rata y su posible implicación en la rotura de las membranas
corioamnióticas. Federación mexicana de ginecología y obstetricia.

-Ramirez Carlos (2012). Establecimiento de las técnicas de zimografía y zimografía

reversa para el análisis de muestras clínicas de suero y plasma en el laboratorio de
ecología y salud del instituto de salud pública. UV. Facultad de Biología.
- H.O. Alonso, J.A. Barcat (1994) Medicina, órgano de la sociedad Argentina de
la investigación Clínica, Buenos Aires, Vol. 54, numero 5/2.

- (Von Jagow, 2003) Membrane Protein Purification and Crystallization, a practical

guide, segunda edición, Elsiver Science USA.

-(Hawkes.S,2001) ,LiH, TaniguchiGT. Zymography and Reverse,Zymography for

DetectingMMPs,andTIMPs. Biomedical and Life Sciencies2001.