Ek A - 01

Toplam Mezofil Aerob Bakteri Sayýmý

1 mL
10 g (mL) gýda, 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile
homojenize edilir. Gerekli seyreltmeler yapýlýr. Sývý gýdalar
doðrudan analize alýnabilir. PCA (Merck 1.05463)
besiyerine ekim yapýlýr.

Petri kutularý amaca göre 28 ºC ya da 37 ºC'da 48 saat

inkübasyona býrakýlýr.

Ýnkübasyon sonunda besiyerinde oluþan tüm koloniler

sayýlýr, gýdadaki toplam mezofil aerob bakteri sayýsý
hesaplanýr.

Petri kutularý otoklavlandýktan sonra yýkanýr/atýlýr.

335
Ek A - 02
Koliform Bakterilerin Sayýlmasý; Katý Besiyeri (ISO 4832)

10 g (mL) gýda, 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile homojenize

edilir. Sývý gýdalar doðrudan analize alýnabilir.

VRB Agar (Merck 1.01406) besiyerine ekim yapýlýp, ikinci kat

VRB ilave edilir.

o o
Petri kutularý 30-32 C ya da 35-37 C'da 24 saat inkübasyona
býrakýlýr.

1-2 mm çapýnda kýrmýzýmsý bir presipitat zonu ile çevrili koyu

kýrmýzý koloniler sayýlýr.

Sterilizasyondan sonra petri kutularý yýkanýr/atýlýr.

336
Ek A - 03
Koliform Bakterilerin Sayýlmasý; EMS Yöntemi (ISO 7725)

10 g (mL), gýda 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile homojenize

edilir. 10-2 ve katý gýdalarda 10-3 seyreltiler hazýrlanýr.

Ýçlerinde Durham tüpü bulunan LST Broth (Merck 1.10266)

besiyerinden; katý gýdalarda 10-1 ; 10-2 ve 10-3 , sývý gýdalardan
100 ; 10-1 ve 10-2 seyreltilerden olmak üzere 3'er tüpe 1'er mL
ekim yapýlýr.

o
Tüpler 35-37 C'da 24 saat inkübasyona býrakýlýr.

Bulanýklýk ve Durham tüplerinde gaz oluþumu pozitif olarak

deðerlendirilir. EMS tablosu kullanýlarak gýdadaki koliform
grup bakteri sayýsý hesaplanýr.

Sterilizasyondan sonra tüpler yýkanýr.

337
Ek A - 04
100 mL Suda Koliform Bakteri ve E.coli Aranmasý

100 mL su örneði steril bir kaba alýnýr.

Üzerine 1 poþet Readycult Coliforms (Merck 1.01298)

ilave edilir.

Çalkalanýp, 35-37 oC'da 24 saat inkübasyona býrakýlýr.

Besiyeri renginin yeþile dönüþmesi koliform pozitif olarak

deðerlendirilir.

Koliform pozitif olan örnek, loþ bir yerde kýsa dalga boylu
UV lambasý (Merck 1.13203) ile incelenir. Bunlardan
floresan ýþýma verenler E. coli olarak deðerlendirilir.

Sterilizasyondan sonra kullanýlmýþ malzeme yýkanýr.

338
Ek A - 05
Membran Filtrasyon Yöntemiyle Sularda Koliform Bakteri Aranmasý

100 mL Su
100 mL su, membran filtrasyon sisteminden geçirilir, filtre
Lactose TTC Agar with Tergitol 7 (Merck 1.07680) üzerine
VAKUM
yerleþtirilir.

Filtrenin, bakterilerin tutulmuþ olduðu üst kýsmý Petri

kutusuna yerleþtirmede yine yukarýda olmalýdýr.

o
Petri kutusu tabaný üzerinde olacak þekilde 30-32 C ya da
35-37 oC'da 24 saat inkübasyona býrakýlýr.

Sarý-portakal renkli koloniler koliform grup bakteri olarak

deðerlendirilir ve su örneðindeki koliform grup bakteri
sayýsý hesaplanýr.

339
Ek A - 06
E. coli Sayýlmasý; Katý Besiyeri

10 g (mL), gýda 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile

homojenize edilir. Sývý gýdalar doðrudan analize
alýnabilir.

Fluorocult VRB Agar'a (Merck 1.01406) ya da

Chromocult Coliform Agar'a (Merck 1.10426) ya da
Chromocult TBX Agar'a (Merck 1.16122) ekim yapýlýr.
VRB Agar ekiminde ikinci kat VRB Agar ilave edilir.

Her ikisi de 35-37 oC'da olmak üzere Fluorocult VRB

Agar 18 saat ve Chromocult Coliform Agar 24 saat
inkübasyona býrakýlýr. Chromocult TBX Agar ise 44 oC'da
18-24 saat inkübe edilir.

Fluorocult VRB Agar'da 1-2 mm çapýnda kýrmýzýmsý bir

U.V. presipitat zonu ile çevrili koyu kýrmýzý ve kýsa dalga
boylu UV lamba (Merck 1.13203) ile loþ bir yerde
floresan veren koloniler, Chromocult Coliform Agar'da 1-
2 mm çaplý mavi-menekþe koloniler, Chromocult TBX
Agar'da mavi-yeþil koloniler sayýlýr ve gýdadaki E. coli
sayýsý hesaplanýr.

Sterilizasyondan sonra petri kutularý yýkanýr/atýlýr.

340
Ek A - 07
E. coli Sayýlmasý; Hýzlý EMS Yöntemi

10 g (mL), gýda 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile

homojenize edilir. 10-2 ve katý gýdalarda 10-3 seyreltiler
hazýrlanýr.

Ýçlerinde Durham tüpü bulunan Fluorocult LST Broth

(Merck 1.12588) besiyerinden; katý gýdalarda 10-1 ; 10-2
ve 10-3, sývý gýdalardan 100 ; 10-1 ve 10-2 seyreltilerden
olmak üzere 3'er tüpe 1'er mL ekim yapýlýr.

Tüpler 35-37 oC'da 24 saat inkübasyona býrakýlýr.

Bulanýklýk ve Durham tüplerinde gaz oluþumu görülen

U.V. U.V. U.V.
koliform pozitif tüpler loþ bir yerde kýsa dalga boylu UV
lambasý (Merck 1.13203) ile incelenir. Bunlardan floresan
ýþýma verenler E. coli olarak deðerlendirilir (bakýnýz; ek
ABC). Floresan ýþýmadan emin olunmazsa tüplere 1 mL 1
N NaOH eklenip tekrar incelenir. EMS tablosu kullanýlarak
gýdadaki E. coli sayýsý hesaplanýr.

Sterilizasyondan sonra tüpler yýkanýr.

341
Ek A - 08
Singlepath® E.coli O157 Test Kiti Uygulama Þemasý

342
Ek A - 09
Singlepath® Verotoxins Test Kiti Uygulama Þemasý

343
Ek A - 10
Salmonella Aranmasý (ISO 6579)

25 g (mL) gýda, 225 mL TPS (Merck 1.07228) ile homojenize edilir.

Homojenizat 35-37 ºC'da 16-20 saat inkübasyona býrakýlýr.

Ýnkübasyondan sonra Selenit Sistin (Merck 1.07709) ve RVS Broth

(Merck 1.07700) selektif zenginleþtirme besiyerlerine ekim yapýlýr.
Selektif zenginleþtirmede 10 mL RVS Broth'a ön zenginleþtirme
o
kültüründen 0,1 mL eklenir ve inkübasyon 42-43 C'da 24 saat
olarak yapýlýr. SS Broth kullanýmýnda ise 100 mL besiyerine 10 mL
o
ön zenginleþtirme kültürü ilave edilir ve 37 C'da 24 saat
inkübasyona býrakýlýr.

Her 2 selektif zenginleþtirme kültüründen ayrý ayrý olmak üzere

Brilliant Green Fenol Red (BGFRL; Merck 1.10747) Agar ile
laboratuvarýn tercihine býrakýlan baþka bir selektif katý besiyerine
sürme yapýlýr. Rambach Agar (Merck 1.07500), Xylose Lysine
Deoxycholate (XLD) Agar (Merck 1.05287) ve özellikle XLT 4 Agar
(Merck 1.13919 ve Merck 1.08981) önerilmektedir.

Petri kutularý 37 ºC'da 24 saat inkübasyona býrakýlýr.

Tipik koloniler varsa bunlardan 5 adedi ayrý ayrý olmak üzere Triple
Sugar Iron (TSI) Agar (Merck 1.03915), Urea Broth (Merck
1.08483) ve Lysine Iron Agar (Merck 1.11640) besiyerinde
tanýmlanýr. Salmonella için tipik koloniler; BGFRL Agar'da etrafý
parlak kýrmýzý bir zon ile çevrili, pembe kýrmýzý renkli, XLD Agar'da
besiyeri ile ayný renkte, yarý saydam, bazen siyah merkezli, XLT4
Agar'da siyah renkli ve Rambach Agar'da kýrmýzý renklidir. Singlepath
Salmonella da kullanýlabilir (bakýnýz; ek ABC).

Çalýþmada kullanýlan bütün malzeme otoklavlandýktan sonra

yýkanýr/atýlýr.

344
Ek A - 11
Singlepath® Salmonella Test Kiti Uygulama Þemasý

25 g (mL) gýda 225 mL TPS (Merk 1.07228)

besiyerine ilave edilir. Gerekirse homojenizasyon

345
Ek A - 12
Listeria Aranmasý (ISO 11290)

25 g (mL) gýda, 225 mL 1/2 Fraser Broth (Merck 1.10398 ve Merck

1.10399) ile homojenize edilir.

Homojenizat 30 ºC'da 24 saat inkübe edilir. Gýdadaki Listeria'nýn

hasar görmüþ olduðu düþünülüyorsa selektif katkýsý ilave edilmemiþ
Fraser Broth besiyerinde homojenize edilip, 30 ºC'da 4 saat kendi
halinde býrakýlýr. Daha sonra selektif katký ilave edilip ayný sýcaklýkta
20 saat daha inkübe edilir.

Bu sürenin sonunda 10 mL tam Fraser Broth besiyerine 0,1 mL

inoküle edilir, paralel olarak PALCAM Agar (Merck 1.11755 ve
Merck 1.12122) ile Oxford Agar (Merck 1.07004 ve Merck
1.07006) besiyerlerine öze ile sürme yapýlýr.

Tam kuvvette Fraser Broth 35-37 ºC'da 48 saat, PALCAM ve Oxford

Agar 35-37 ºC'da 24 saat inkübe edilir.

Tam kuvvette Fraser Broth besiyerinden 24 ve 48 saatlerde ayný

besiyerlerine sürme yapýlýr. 1/2 Fraser Broth besiyerinden yapýlmýþ
ilk Petri kutularý deðerlendirilir.

Listeria için tipik koloniler; PALCAM Agar'da 1,5-2 mm çapýnda, zeytin

yeþili gri renkli, bazen siyah merkezli ancak her zaman siyah zonlu,
Oxford Agar'da ise 2-3 mm çapýnda, siyahýmsý yeþil kahverengi, siyah
zonlu, çökük merkezlidir. Tipik kolonilere hemoliz, CAMP testi, ramnoz
ve ksiloz testleri yapýlýr, Singlepath Listeria da kullanýlabilir (bakýnýz; ek
ABC).

Kullanýlmýþ tüm malzeme otoklavlandýktan sonra yýkanýr/atýlýr.

346
Ek A - 13
Singlepath® Listeria Test Kiti Uygulama Þemasý

347
Ek A - 14
Singlepath® Campylobacter Test Kiti Uygulama Þemasý

25 g gýda 225 mL ya da 25 mL gýda 200 mL Bolton

Broth (Merck 1.00068 ve Merk 1.00069) besiyerine
ilave edilir. Gerekirse homojenizasyon yapýlýr.

348