O riginal r nvestigaci
Terapia de endodoncia
Rafaela Fernandes Zancan ( una)
Lyz Cristina Furquim CANALI ( una)
Talita TARTARI ( una)
Flaviana Bombarda de ANDRADE ( una)
Rodrigo Ricci VIVAN ( una)
Marco Antonio Hungaro DUARTE ( una)
(una) Universidad de Sao Paulo - USP, Facultad de Odontología de
Bauru, Departamento de Odontología Restauradora, Bauru, SP,
Brasil.
Declaración de interés: Los autores certificar que no
tienen ningún interés comercial o asociativo que
representa un conflicto de intereses en relación con el
manuscrito.
Autor correspondiente:
Rafaela Fernandes Zancan E-mail:
rafaelazancan@yahoo.com.br
https://doi.org/10.1590/1807-3107bor-2018.vol32.0046
Enviado: 23-ago 2017
Aceptado para su publicación el 15 marzo, 2018 Última
revisión: 13-abr, 2018
Hacer diferentes cepas de E. faecalis tener el mismo
comportamiento con medicamentos intracanal en in
vitro ¿investigación?
Resumen: El objetivo de este estudio fue evaluar la acción antimicrobiana de diferentes
pastas de endodoncia contra Enterococcus faecalis ATCC
29212, aislado del tracto urinario, y comparar la acción con
E. faecalis ATCC 4083, aislado del conducto radicular. Para este propósito, los bloques de
dentina se infectaron durante 21 días con ambas bacterias a diferentes intervalos de tiempo para
asegurar que no habría ninguna contaminación cruzada. Después de este período, los bloques
se sumergieron en los medicamentos de prueba para 7 días, de acuerdo con los siguientes
grupos: CH / S, CH / P, CH / CMCP, CH / CHX, CH / DAP y TAP. Las imágenes de las muestras
fueron capturadas con un microscopio confocal y el porcentaje de células vivas se calculó por
medio del programa de BioImage. La cepa ATCC 29212 ha demostrado ser más resistentes a
CH / SS, Calen, CH / DAP, y TAP que la cepa ATCC 4083. La acción antimicrobiana de los
medicamentos contra cada cepa se divergente relativa a la orden de susceptibilidad. Los autores
concluyeron que las cepas se comportaban de una manera diferente: en general, los extraídos a
partir del tracto urinario eran más resistentes a los medicamentos probados. Por lo tanto, cuando E.
faecalis debe ser utilizado para in vitro la investigación en endodoncia, se sugiere el uso de ATCC
4083 cepa para obtener resultados más próximos a la realidad clínica.
palabras clave: Enterococcus faecalis; Hidróxido de calcio; clorhexidina; Agentes
Antibacterianos; Endodoncia.
Introducción
Las lesiones inflamatorias de los tejidos peri-radicular son el resultado de una infección causada
por la invasión agresiva de microorganismos del sistema de conductos radiculares que resistió los
anticuerpos y células inmunes del huésped. 1 Enterococcus faecalis son las bacterias que se
encuentran con mayor frecuencia en los conductos radiculares de los casos la infección persistente
re-tratamiento y, ya que son capaces de adaptarse a entornos adversos y tienen un alto nivel de
patogenicidad que lleva a la perpetuación de la infección endodóntica. 2
La aplicación de los medicamentos intracanal es una de las estrategias utilizadas para la antisepsia de canal de la
raíz y el medicamento más frecuentemente usado es hidróxido de calcio (CH), que libera iones hidroxilo en una
solución acuosa, proporcionando un ambiente altamente alcalino que afecta a la mayoría de los microorganismos en
canales de la raíz infectados . Sin embargo, los microorganismos resistentes a CH tales como E. faecalis, 3 especies de
Candida, 4
y Actinomyces radicidentis 5 se han asociado con fracaso endodóntico.
Braz. Res orales. 2018; 32: e46 1
 Hacer diferentes cepas de E. faecalis tienen el mismo comportamiento hacia los medicamentos intracanal en la investigación in vitro?
Por lo tanto, para mejorar su efecto antimicrobiano, las sustancias
activas se mezclan con CH. paramonoclorofenol alcanforado (CMCP)
se sugirió como un vehículo en 1966, 6 que se extiende la acción CH
para bacterias facultativas y anaerobias y mejorar su capacidad de
penetrar en los túbulos dentinarios. 7 El gluconato de clorhexidina (CHX)
se utiliza como irrigante intracanal y el medicamento debido a su
amplio espectro de actividad contra las bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas que se encuentran en las infecciones endodónticas. 8 Los
estudios han demostrado la eficacia de CHX contra los
microorganismos que son resistentes a CH, y los beneficios
antimicrobianos de la mezcla de los dos productos (CH + CMCP). 9,10
En los casos de insuficiencia de endodoncia, se ha sugerido la Pega
antibiótico triple (TAP) que contiene metronidazol, minociclina, y
ciprofloxacina. Esta composición proporciona una acción poderosa contra
microorganismos de la cavidad oral, 11 Sin embargo, la minociclina puede
causar decoloración de los dientes. Por lo tanto, su exclusión de la pasta
se ha indicado, y el producto se llama antibiótico doble Pasado (DAP). 12 Una
alternativa que no se ha estudiado ampliamente es la interacción de la
acción antimicrobiana de DAP con los beneficios biológicos de CH.
La facilidad de inducir E. faecalis biopelícula in vitro 13
ha aumentado el interés en el estudio de la resistencia de esta bacteria a
las diferentes sustancias usadas en el tratamiento del canal de la raíz. 14,15,16 Sin
embargo, la cepa utilizada más a menudo es ATCC 29212, aislado del
tracto urinario. 17,18,19,20 Con la preocupación de llevar a cabo in vitro la
investigación lo más cercano posible a la realidad clínica, el objetivo de
este estudio fue evaluar la susceptibilidad de ATCC 29212 a diferentes
pastas intracanal y comparar con la de ATCC 4083, que se aísla de la
endodoncia.
La hipótesis nula probado fueron:
a. Las cepas tienen el mismo comportamiento hacia la
diferentes pastas;
segundo. Las pastas presentan acción antimicrobiana similar.
Metodología
La obtención de bloques de dentina
Catorce incisivos centrales de la especie bovina con raíces
completamente desarrollados fueron colocados en el banco en una posición
lateral para proporcionar acceso a su porción más plana. Las raíces fueron
luego perforadas en los tercios cervical y medio por medio de una fresa de
trépano 4 mm
2 Braz. Res orales. 2018; 32: e46
(Neodent, Curitiba, Brasil) acoplado a un contra-ángulo colocado
perpendicular al diente para obtener 4 bloques de dentina por diente.
Posteriormente, las superficies de dentina se pulieron con una
máquina de pulido (Arotec, Sao Paulo, Brasil) y 300 y 600 de grano
papeles abrasivos (Buehler, Lake Bluff, EE.UU.). residuos orgánicos y
raspados de dentina desde el procedimiento de corte se eliminaron
con hipoclorito de sodio al 1% (Rioquímica Ltda., Sao José do Rio
Preto, Brasil) durante 15 minutos, seguido de 17% de EDTA
(biodinámica, Ibiporã, Brasil) durante 5 minutos y la esterilización en
autoclave a 121 ° C.
Crecimiento bacterial
Las pruebas de actividad antimicrobiana se llevaron a cabo bajo
condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar (VecoFlow Ltda,
Campinas, SP, Brasil). Cada bacteria fue manipulado a diferentes
intervalos de tiempo de modo que no habría ninguna contaminación entre
cepas. Para activar las bacterias, 15! L de cada cepa (American Type
Culture Collection [ATCC] 4083 y [ATCC] 29212) fueron insertados en 3 ml
de infusión de cerebro-corazón estéril (BHI) (Oxoid, Basingstoke, Reino
Unido) y se mantuvieron en un horno (modelo Q816M20; Composto de
Quimis Científicos Ltda, Diadema, SP, Brasil) a 37 ° C para el crecimiento
durante la noche. Posteriormente, la densidad bacteriana se ajustó a 10 8
células / ml con un espectrofotómetro (Bel Photonics hacen Brasil Ltda,
Osasco, Brasil) a una densidad óptica de 1 a 600 nm de acuerdo con el
estándar MacFarland 0,5.
La contaminación de las muestras
Cada pocillo de placas de 24 pocillos contenía 1 bloque de dentina
+ 0,9 ml de BHI estéril + 0,1 ml de inóculo; placas se mantuvieron en
un horno (modelo Q816M20; Composto de Quimis Científicos Ltda,
Diadema, SP, Brasil) a 37º C durante 21 días. Para evitar la deficiencia
de nutrientes, el medio de cultivo BHI (Oxoid, Basingstoke, Reino
Unido) fue reemplazado completamente cada 48 horas, sin la adición
de nuevos microorganismos.
El tratamiento de las muestras
Después de la maduración de biopelículas, las muestras infectadas se
lavaron con 1 ml de agua destilada para eliminar las bacterias de baja
adherencia y planctónicas. Posteriormente, los bloques de dentina se
sumergieron en los medicamentos de prueba (n = 5) y se mantuvo en un horno
a 37 ° C durante un período de 7 días. El grupo de control no recibió
tratamiento.
 Zancan RF, Canali LCF, tártaro T, Andrade FB, Vivan RR, Duarte MAH
aderezos intracanal
a. G1 (CH / S): CH (hidróxido de calcio) (Merck &
Co, Kenilworth, NJ, EE.UU.) / solución salina (1 g / 0,8 ml);
segundo. G2 (CH / P): CH y polietileno glicol (Calen; SS
Artigos blanco dentarios Ltd, Río de Janeiro, Brasil);
do. G3 (CH / CMCP): CH, polietilenglicol y
paramonoclorofenol alcanforado (CMPC) (Calen PMCC, SS
White Artigos dentarios Ltd Río de Janeiro, Brasil);
re. G4 (CH / CHX): CH (Merck & Co), 2%
gluconato de clorhexidina (MGF, Joinville, Brasil) y
propilenglicol (1 g / 0,5 ml / 0,3 ml);
mi. G5 (CH / DAP): CH (Merck & Co), Doble Antibiótico
Pegar (metronidazol, ciprofloxacina) - Brainfarma Indústria
Química e Farmacêutica SA, Sao Paulo, Brasil) y Saline (500
mg de cada / 500 mg CH / 1 ml antibiótico);
F. G6 (TAP): Pega antibiótico triple (metronidazol,
Ciprofloxacin, Minocycline - Brainfarma Indústria Química e
Farmacêutica SA, Sao Paulo, Brasil) y Saline (500 mg de
cada antibiótico / 1 ml).
Análisis microbiológico
Las muestras se lavaron con PBS (solución tampón de fosfato) para
eliminar las pastas y los residuos y después se tiñeron con 15 l de SYTO9 y
solución de yoduro de propidio (Live / Dead BacLight Viabilidad Kit; Molecular
Probes, Eugene, EE.UU.) durante 15 minutos. SYTO9 11 es una mancha
fluorescente de ácido nucleico selectivo, indicado para la tinción de células
vivas y muertas (tinción general) y yoduro de propidio identifica las poblaciones
microbianas con una membrana celular afectada o células muertas, y presenta
una fluorescencia roja. Al entrar en las células, la fluorescencia roja disminuye
la fluorescencia de SYTO9 dejando las células muertas con una fluorescencia
de color rojo o de color amarillento. Después de la tinción, 4 imágenes por
bloque dentina por un total de 20 imágenes por grupo fueron capturados por
medio de un láser confocal de barrido microscopio (LSCM) (Laica, Mannheim,
Alemania) a un aumento de 40x. El porcentaje de bacterias vivas y muertas se
obtuvo por medio de un software V2-1 BioImage (www.bioImageL.com).
resultados
La Figura muestra microscopía confocal de barrido con láser de los
biofilms tratados con los apósitos intracanal probados: solución (/ S CH)
hidróxido + solución salina de calcio, (CH / P)
hidróxido de calcio + polietileno glicol, (CH / CMCP) de hidróxido
de calcio + polietilenglicol + CMCP, (CH / CHX) de hidróxido de
calcio + propilenglicol + clorhexidina, (CH / DAP) de hidróxido de
calcio + Pega Antibiótico Doble, (TAP) Pegar antibiótico triple y
(CG) grupo de control. Enterococcus faecalis biofilm (ATCC
29212) y Enterococcus faecalis biofilm (ATCC 4083) se identifican por los
números 1 un 2, respectivamente. Las células vivas se indican en verde, y las
células muertas se indican en rojo.
La Tabla 1 muestra el porcentaje de células viables de diferentes
biofilms después de un tratamiento de una semana con los
medicamentos. La cepa ATCC 29212 mostró una mayor resistencia a
la CH / S, CH / P, CH / DAP, y pastas de TAP que la cepa ATCC
4083, sin diferencias estadísticas entre los otros grupos.
El orden de la susceptibilidad a los medicamentos de alto a
bajo era TAP, CH / S, CH / CMCP, CH / CHX, CH / P, y CH / DAP
para ATCC 29212 y TAP, CH / S, CH / CHX, CH / P, CH / CMCP,
y CH / DAP para ATCC 4083.
Discusión
Las hipótesis nulas fueron rechazadas debido a que:
a. No se observaron diferencias en la susceptibilidad
de E. faecalis ATCC 4083 y ATCC 29212 a las pastas
estudiadas;
segundo. Las pastas presentan diferente acción antimicrobiana.
Enterococcus faecalis es un Gram-positivo, bacteria anaerobia
facultativa que presenta en pares en forma de cocos, o en cadenas cortas
en forma planctónica. 2,21,22 También es capaz de fácilmente organizarse en
un biofilm, lo que aumenta su resistencia a los tratamientos del canal de la
raíz químico-físicas y ambientes alcalinos, como en el caso de los
medicamentos intracanal con CH. dieciséis Cuando estas bacterias se exponen
a condiciones desfavorables, tales como la limitación nutricional, entran en
“fase de inanición / modo” y son capaces de resistir durante un máximo de
12 meses dentro de los túbulos dentinarios, incluso después del llenado
del sistema de conductos radiculares. 23,24
patógenos endodónticos son microorganismos capaces de penetrar en el
esmalte, la dentina y la pulpa, y establecer y sobrevivir en el espacio del
conducto radicular. 25 La capacidad de las
E. faecalis para adaptarse a factores externos 1 y su alta virulencia como
resultado un alto grado de patogenicidad, 13,26
con una ventaja sobre otros microorganismos que se encuentran
Braz. Res orales. 2018; 32: e46 3
 Hacer diferentes cepas de E. faecalis tienen el mismo comportamiento hacia los medicamentos intracanal en la investigación in vitro?

A1 A2 D1 D2

B1 B2 E1 E2

C1 C2 F1 F2

G1 G2

Figura.- láser confocal de barrido microscopía de biofilms tratados con (A) de hidróxido de calcio + solución salina, (B) hidróxido de calcio + polietileno glicol, (C) de hidróxido
de calcio + polietilenglicol + CMCP, y (D) de hidróxido de calcio + propilenglicol + CHX, ( e) DAP + CH, (F TAP), y G grupo de control (). Número 1 corresponde a Enterococcus
faecalis biofilm (ATCC 29212) y el número 2 a Enterococcus faecalis
biofilm (ATCC 4083). Las células vivas se indican en verde, y las células muertas se indican en rojo. Cada cuadro representa un área de 275 x 275 m.

Mesa. La mediana (Med), los valores del porcentaje de células vivas de diferentes biofilms después del contacto con los medicamentos experimentales para una semana mínimo y

máximo (Min-Max). ATCC

Controlar CH / S CH / P CH / CMCP CH / CHX 2% CH / DAP GRIFO

75.59 13.15 44.64 52.94 35 (8,44 a 59.98 0.06

4083 77,6) a B C
(42,9-96,5) Automóvil club británico (0,21-53,10) bCD (4,08-92) BABC (8,14-82,4) aAB (11,46-80,3) Bab (0,001 1.23) bD
86.75 34.52 71.9 58.26 45.8 83.73 10,42
29212
(26,9-99,9) Automóvil club británico (3,99-92,9) ACD (5,54-96,91) AAC (0 a 98,95) a B C D (7,1 a 98) a B C (24,02-93,4) aAB (0,2 a 47,84) anuncio

* Kruskal-Wallis con post-hoc de Dunn. Valor de p <0,05; Diferentes letras mayúsculas en filas indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en el mismo biofilm. Diferentes letras minúsculas
en las columnas indican diferencias estadísticamente significativas entre intragrupo biopelículas.

4 Braz. Res orales. 2018; 32: e46

 Zancan RF, Canali LCF, tártaro T, Andrade FB, Vivan RR, Duarte MAH
durante las diferentes etapas del tratamiento de endodoncia; por lo
tanto, se considera “el malo” de la endodoncia. 2
De hecho, aunque la infección endodóntica primaria es causada por una
comunidad mixta de microorganismos tales como Firmicutes,
Bacteroidetes, espiroquetas, Fusobacterias, Actinobacteria,
Proteobacteria, Synergistes, TM7 y
SR1, 27,28 el microorganismo principal aislado en casos de fracaso del
tratamiento endodóntico es E. faecalis, con una prevalencia del 24 al
77%. 29,30,31
Dada la resistencia de E. faecalis para el tratamiento de endodoncia,
este microorganismo se ha utilizado frecuentemente en in vitro la
investigación en la forma planctónica o biopelícula. 16,17 Una biopelícula es una
capa delgada de microorganismos que se adhieren a la superficie de una
estructura cerrada en una matriz extracelular (ECM) que aumenta su
resistencia a las tensiones de entorno. Todas las cepas de E. faecalis
producir ECM en condiciones aeróbicas; sin embargo, la cantidad
producida varía dependiendo del aislamiento, el medio ambiente, la
complejidad biofilm, y el sustrato. 25 La ATCC (American Type Culture
Collection) enumera 69 cepas disponibles en el mercado de E. faecalis. Una
cepa es una subdivisión descriptivo de una especie y cuando se sufre
mutaciones significativas o ya que se adapta a las nuevas condiciones
ambientales, los descendientes puede formar nuevas cepas, que son
clonalmente aislamientos relacionados, ya que tienen fenotipos y
genotipos comunes. 32,33
Cada uno de estos aislados tiene un número ATCC y diferentes
características hereditarias derivados de absorción de moléculas
o sus fragmentos de ADN dispuestas en sus respectivos
entornos. 2
patrones de prevalencia distintas de genes de virulencia de
Enterococcus spp. se han aislado de los conductos radiculares con el
fracaso del tratamiento. Los diferentes perfiles de expresión de estos
factores de virulencia con resistencia intermedia / totales a varios agentes
antimicrobianos pueden ser explicadas por los factores ambientales tales
como las diferencias geográficas y los hábitos alimenticios. 34,35
Por otra parte, las especies bacterianas de endodoncia están dispuestos
cerca uno del otro, que es muy propicio para establecer interacciones
como las cadenas de alimentos, sistemas de detección de quórum, y el
intercambio de genes relacionados con la virulencia y la resistencia a los
antibióticos. 36 Por lo tanto, la infección de los dientes puede tener una
influencia en la microbiota y en consecuencia del tipo de la virulencia
intercambiado por bacterias. Asociaciones se han reportado entre las
especies bacterianas de endodoncia
y resistencia a los antibióticos, incluyendo las especies Prevotella de
abscesos dentoalveolares 37 y Enterococcus faecalis
de los dientes con el post-tratamiento de la periodontitis apical. 38
Esto es importante para la comprensión de la patogenicidad de los factores
de virulencia y sus efectos sobre el anfitrión.
Debido a la preocupación relacionada con la exactitud de in vitro
genes de investigación y los diferentes patrones de virulencia y
resistencia de E. faecalis cepas, su seguimiento deben ser alentados
para establecer el fármaco más eficaz. En este estudio, el
comportamiento de una E. faecalis linaje aislado originalmente de la
infección del conducto radicular - ATCC 4083 15,16 - se comparó con la
de ATCC 29212 (aislada de orina), que se utiliza en la mayoría de los
estudios. 17,18,19,39
En general, se observó que ATCC 29212 era más resistente que
el ATCC 4083. (Tabla). Uno de los principales mecanismos de acción
antimicrobiana CH - dentro de un vehículo inerte - es la alcalinización
del medio. 6
Muchas enfermedades, dietas, y medicamentos hacen orina ácido o
básico, que puede justificar la mayor resistencia de ATCC 29212 (aislado
de la orina) a los cambios de pH causados ​por las pastas de CH / SS y
CH / P en comparación con ATCC 4083 (aislado de el conducto
radicular).
Alcanforado paramonoclorofenol (CMCP) es un vehículo utilizado
ampliamente que aumenta el espectro CH pasta de acción, mejorar la
capacidad de Ca 2+ y OH- iones para penetrar túbulos dentinarios. 40 Clorhexidina
(CHX) presenta un amplio espectro antimicrobiano y tiene una
excelente actividad antimicrobiana a un pH de entre 5,5 y
7. 14 Sin embargo, en un ambiente alcalino, CHX puede descomponer en
reactivo subproductos tales como compuestos de oxígeno reactivos, que
también pueden matar E. faecalis. 41
En los grupos con vehículos activos (paramonoclorofenol alcanforado
y clorhexidina) añadió a CH pastas, no hubo diferencia estadística
entre las dos cepas bacterianas en relación con el porcentaje de
células vivas. Sin embargo, cuando se comparó la sensibilidad de las
bacterias a las diferentes pastas, los resultados fueron divergente, ya
que la acción antimicrobiana de la pasta de CH / CMCP era mejor que
CH / CHX para ATCC 29212, y la asociación de CHX mostraron
ventajas sobre CMCP para ATCC 4083 .
Se encontró una mayor prevalencia de células vivas para ATCC
29212 cuando se compararon los dos bacterias con respecto a las
pastas de antibióticos. El uso indiscriminado de agentes
antimicrobianos es responsable de la
Braz. Res orales. 2018; 32: e46 5
 Hacer diferentes cepas de E. faecalis tienen el mismo comportamiento hacia los medicamentos intracanal en la investigación in vitro?
desarrollo de la resistencia microbiana. 42 Los antibióticos se toman con
frecuencia por vía sistémica y se excretan por la orina, lo que puede
justificar los resultados. 43 La pasta TAP se utiliza en la forma tópica en
los sistemas de canal radicular, y contiene la ciprofloxacina,
metronidazol y minociclina. Está indicada en casos de resistencia a los
antibióticos debido a su amplio espectro de acción. 44
Como minociclina puede causar decoloración de los dientes, la
combinación de metronidazol y ciprofloxacino, llamado DAP, ha resuelto
este problema. 45 Los investigadores no han encontrado ninguna diferencia
entre las actividades antimicrobianas de estas pastas antibióticos. 44,46
Sin embargo, en este estudio, la pasta de DAP se utilizó en
asociación con CH. Cuando comparamos el orden de la resistencia
bacteriana en relación con las pastas, se encontró que TAP y CH / DAP
tenido el mejor y el peor antimicrobiano resultado, respectivamente.
TAP redujo significativamente la viabilidad celular, a diferencia de CH /
DAP que mostró resultados similares al control. El alcalina
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6 Braz. Res orales. 2018; 32: e46
ambiente proporcionado por la adición de CH a DAP probablemente
influyó en la capacidad del antibiótico para penetrar en las células
bacterianas.
Sin embargo, los autores concluyeron en general que la cepa
aislada del tracto urinario (ATCC 29212) era más resistente que la
aislada de la canal de la raíz (ATCC 4083) y se comportaba de una
manera diferente en relación con el orden de la resistencia a los
medicamentos, como fue el caso de CH / CHX y CH / tratamientos
CMCP. Por lo tanto, la evaluación de la susceptibilidad a los antibióticos
es importante entender y controlar la propagación de enfermedades
endodónticas. por in vitro investigación, se recomienda el uso de cepas
aisladas del canal de la raíz, ya que diferentes cepas de la misma
especie pueden diferir debido a las características adquiridas.
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