ELECTROFORESIS

KEVIN LEDESMA1, KATIANA POLO1, MARCELA ROMERO1

1. UNIVERSIDAD DE SUCRE, FACULTAD EDUCACION Y CIENCIAS,
PROGRAMA BIOLOGIA Y QUIMICA, 6TO SEMESTRE.

RESUMEN

La electroforesis es un procedimiento importante para el análisis de DNA, su

principio básico consiste en la migración de las moléculas a través de un gel de
naturaleza porosa, el cual por acción de un campo eléctrico serán separadas de
acuerdo a su tamaño o peso molecular. El método consistió primeramente en
preparar el gel en una superficie completamente plana; para esto se licuo la agarosa
y posteriormente se dejó que bajara su temperatura para servir asegurando tener
los peines debidamente insertados; luego cuando la agarosa se solidifico
completamente se agregó el tampón TBE 0,5X. Para sembrar en los pozos se usó
ORANGE G como buffer de carga y se mezcló con la muestra de DNA, también se
usó un marcador estándar para usarlo de referencia. Una vez colocados en los
pozos se procedió a colocar la tapa e iniciar la electroforesis; al pasar 60 minutos
se desmonto la muestra y el resultado se llevó al transluminador para su
observación y posterior análisis.

PALABRAS CLAVE: Electroforesis, transluminador, buffer, tampón, DNA, agarosa

ABSTRACT.
Electrophoresis is an important procedure for DNA analysis, its basic principle is the
migration of molecules through a gel of porous nature, which by the action of an
electric field will be separated according to their size or molecular weight. The
method consisted primarily in preparing the gel on a completely flat surface; for this
the agarose was liquefied and later it was allowed to lower its temperature to serve
ensuring that the combs were properly inserted; then when the agarose was
completely solidified, the 0.5X TBE buffer was added. To seed in the wells ORANGE
G was used as the loading buffer and mixed with the DNA sample, a standard marker
was also used for reference use. Once placed in the wells proceeded to place the
lid and start the electrophoresis; after 60 minutes the sample was removed and the
result was taken to the transilluminator for observation and subsequent analysis.

KEYWORDS: Electrophoresis, transilluminator, buffer, buffer, DNA, agarose.

 INTRODUCCION.
La electroforesis en gel es una técnica
muy utilizada para separar moléculas
o fragmentos de moléculas de ácidos
nucleicos. Un gel de agarosa se carga
con los fragmentos de ADN y la
corriente pasa a través del gel. Dado
que el ADN está cargado
negativamente, migrará hacia el polo
positivo. Los trozos más grandes de
ADN chocan con la matriz de gel más
a menudo y se ralentizan, mientras
que las piezas más pequeñas de ADN
se mueven a través de más
rápidamente. Dado que los diferentes
genes tienen diferentes secuencias de
nucleótidos, enzimas de restricción se
cortan en diferentes lugares, la
generación de diferentes fragmentos
de tamaño ADN [1].
La electroforesis en geles de agarosa
es una de las técnicas más utilizadas
en el laboratorio en todo lo relacionado
con el trabajo con ácidos nucleicos.
Gracias a la electroforesis podemos
separar fragmentos de ADN y ARN en
función de su tamaño, visualizarlos
mediante una sencilla tinción, y de
esta manera determinar el contenido
de ácidos nucleicos de una muestra,
teniendo una estimación de su
concentración y grado de entereza. La
agarosa es un polímero lineal
compuesto de residuos alternantes de
D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa
unidos por enlaces glucosídicos α (1
3) y β (1 4).
Las cadenas del polímero de agarosa
forman fibras helicoidales, que al
solidificar forma una malla
tridimensional de canales con
diámetros entre 50 y >200 nm. La
concentración (p/v) de la agarosa es
un parámetro de gran importancia
pues determina el rango de tamaños
en los que obtendremos una buena
separación de los fragmentos de ADN.
Podemos extraer del gel los
fragmentos de ADN que sean de
interés, para posteriormente utilizarlos
en diferentes aplicaciones. La idea de
utilizar la técnica de electroforesis a
través de una matriz para analizar
muestras de ADN corresponde a Vin
Thorne, un bioquímico del Instituto de
Virología de Glasgow, quien a
mediados de los años 60 del pasado
siglo estaba interesado en caracterizar
las distintas formas de ADN que se
obtenían de partículas purificadas de
polyomavirus. Su razonamiento era
que una combinación de fuerzas
eléctricas y de fricción permitiría el
desplazamiento y separación en
función del tamaño o topología de
diferentes moléculas de ADN [1].
Éste es exactamente el principio en
que se basa la electroforesis de ácidos
nucleicos. Sometidos a un campo
eléctrico, la carga neta negativa del
ADN hará que estos se muevan en
dirección al ánodo. Si se fuerza a los
ácidos nucleicos a moverse a través
de un gel formado por una malla
tridimensional de un polímero como la
agarosa, la fricción hará que las
moléculas de mayor tamaño migren
con más lentitud, mientras las de
menor tamaño avanzan más en el gel,
permitiendo que las diferentes
moléculas se separen en función de su
tamaño. La electroforesis en geles de
agarosa es el método estándar para
separar y purificar fragmentos de ADN
cuando no requerimos un alto poder
de resolución. Los geles de agarosa
tienen un poder de resolución mucho
porque no permiten separar moléculas
de ADN que difieren en tamaño menos
PROCEDIMIENTOS
Se pesaron 0.56 g de agarosa y se
diluyeron en 100 ml de tampón
TBE 0.5X (gel de agarosa 0.8%).
Se sirvió la agarosa en el molde
nivelado, con el peine insertado y
se dejó enfriar por 20 minutos.
Luego de que la agarosa
solidificó, se llevó a la cámara de
electroforesis y se sumergió hasta
2 o 3mm en buffer TBE 0.5X.
Se cubrió el tanque con la tapa y
se conectaron los cables en la
fuente de poder.
Se encendió la fuente de poder y
se seleccionó como voltaje 90
voltios, con una duración de una
hora.
de unas 50 pb. Cuanto más baja es la
concentración de agarosa mayor es el
tamaño de las moléculas que pueden
separarse, y viceversa. Los geles de
agarosa convencionales se corren en
una cámara de electroforesis
horizontal, con un campo eléctrico
uniforme y constante [1]
Se licuó la agarosa a una temperatura de
200 °C hasta que la solución se tornó
transparente.
Se enfrió la agarosa en baño maría hasta
que alcanzó los 55 °C y se le adicionó
el SYBR safe.
Como buffer de carga se utilizaron 3 μl
Orange G, mezclándolos con 7 μl de
muestra de ADN.
Las muestras se cargaron en los
pocillos del 2 al 7, usando micropipetas
de 20 μl y en el primer pocillo se cargó
el control positivo.
Luego de transcurrido el tiempo de
corrido, se apagó la fuente de poder y se
retiró el gel de la cámara.
Se llevó la placa de gel hasta el
Transluminador para su revelado.

RESULTADOS Y DISCUSION
Cálculos matemáticos para la
preparación del buffer:
V1= 0.5X x 100 ml
20X
VARIABLE
ml de Buffer
Gramos de agarosa
Temperatura de homogenización
Tiempo de Solidificación
Tabla 1. Datos obtenidos para la preparación del gel de agarosa, en donde
posteriormente se pondría a correr las muestras de ADN (E. Coli) en la cámara
electroforética.
Figura 1. Aquí se puede observar
claramente las distintas bandas
obtenidas para cada muestra en
donde el grupo. Se muestra la placa
de agarosa (0.8%) dentro del
Transluminador, nótese las bandas de
ADN en color claro, los números del 1
al 5 representan los pozos cargados,
en donde “C” contiene el control
positivo y los números del 1 al 5
V1= 2,5 ml Buffer TBE 0.5X
Cálculos matemáticos para la
preparación del gel de agarosa:
gr: Vsln x %
100
gr: 70 x 0.8 = 0,56 gr agarosa.
100
DATOS
100 ml
0,56 g
83 oC
60 minutos
representan las muestras de ADN que
obtuvo cada grupo.
La electroforesis en gel de agarosa es
de las más utilizadas para analizar y
caracterizar ácidos nucleicos de
distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y
permiten separar moléculas cargadas
en función de su tamaño y forma. Así,
moléculas de DNA de diferente
tamaño van a emigrar de forma
distinta en una electroforesis en gel de
agarosa. Para preparar el buffer de
corrido y el gel de agarosa se utilizó
TBE 5X (Tris-borato-EDTA), que
mantiene unas condiciones de pH
adecuadas, facilita la solubilidad del
ADN y evita su degradación, así las
moléculas de ADN se mueven hacia el
polo positivo de la cámara de
electroforesis. El buffer de carga nos
indica donde va la muestra mientras
corre en la cámara de electroforesis,
esto es debido a que le da coloración
a la muestra y además peso. La
presencia del agente intercalante, en
este caso el Sybr safe, es un colorante
fluorescente que se introduce en las
bases del ADN (agente intercalante),
proporcionando una mayor
visualización al momento de someter
la muestra a los rayos UV. Finalizada
la electroforesis se llevó el gel de
agarosa con las muestras a un
transiluminador, donde se observó el
recorrido del ADN de cada carril,
mediante luz UV.
La pureza del ADN extraído por cada
uno de los métodos de extracción de
ADN se corroboró mediante
electroforesis en gel de agarosa. Se
obtuvo ADN no degradado,
correspondiéndose la intensidad de la
banda en el método dos para nuestro
caso, de todos los métodos
analizados; es necesario resaltar
también que el método de solubilidad
en fases inmiscibles es muy eficiente,
al utilizar compuestos orgánicos como
el etanol y cloroformo que aseguraron
de alguna manera la pureza del ADN
extraído.
En relación a los resultados obtenidos
en la imagen 1. Podemos darnos
cuenta que no hubo un corrido tan
pronunciado de las muestras, esto se
debe a que las moléculas o
fragmentos de DNA de longitud
superior a 20-40 kb tienden a
quedarse casi inmóvil empleando la
electroforesis convencional en gel de
agarosa. Esto se debe, en primer
lugar, a la dificultad de manejo de los
geles preparados con las bajas
concentraciones de agarosa que
requerirían (inferior al 0,4%). Además,
las moléculas de DNA, que adoptan
una conformación más o menos
globular, poseen un tamaño
excesivamente grande para atravesar
los poros del gel y no se separan en
función de su tamaño.
CONCLUSIONES
 La electroforesis es un método
de laboratorio en el que se
utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de
separar biomoléculas (como
DNA, en este caso) según su
tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa
(en este caso gel de agarosa).
Además si se quiere saber cuál
de los métodos de extracción
de DNA es el mejor, la
electroforesis es muy útil para
estos análisis. Es necesario
realizar los procedimientos de
estos métodos con supremo
cuidado.
 A diferencia de las proteínas,
las cuales pueden tener una
carga positiva o negativa, los
ácidos nucleicos están
cargados de forma negativa
 debido a su esqueleto de 5. Mujer de la Victima.
grupos fosfato. Por lo tanto, en 6. Vicepresidente.
la electroforesis, los ácidos
nucleicos migrarán hacia el
polo positivo, es decir, el El asesino es el vicepresidente, ya que
ánodo. Los geles de agarosa, el mosquito pudo picar a la víctima y al
permiten separar moléculas de sospechoso dentro del coche,
ácidos nucleicos de mayores justifique su respuesta.
rangos de tamaño.
Al trazar líneas entre todos los pozos,
se observa que los pozos de la víctima
y el vicepresidente coinciden con los
CUESTIONARIO del abdomen del mosquito, por lo que
se asume que el mosquito los picó a
ambos dentro del coche y por ende se
1. Problema forense: ADN de tres puede vincular al vicepresidente con la
sospechosos. muerte de la víctima.
 El jardinero de la casa
2. El principio básico de la
 La esposa del empresario
electroforesis consiste en la
 El vicepresidente de la
migración de las moléculas a
compañía
través de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el
cual, por acción de un campo
eléctrico, serán separadas de
acuerdo a su tamaño o peso
molecular. Para controlar el
avance de la separación de las
moléculas en la matriz y establecer
un patrón de fragmentos, las
moléculas deberán ser teñidas con
diferentes colorantes. Estos pasos
facilitan la visualización de las
moléculas a manera de simples
bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e
interpretadas [7].
1. Abdomen del mosquito
2. Ala del mosquito. 3. Tipos de electroforesis:
3. Víctima.
4. Jardinero.
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida: Los geles de
poliacrilamida se forman por
polimerización de la acrilamida por
acción de un agente entrecuzador,
es químicamente inerte, de
propiedades uniformes, capaz de
ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma, además,
geles transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles
en agua, relativamente no iónicos y
que permiten buena visualización
de las bandas durante un tiempo
prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la
concentración de polímeros, se
puede modificar de manera
controlada en el tamaño del poro,
lamentablemente cada vez se
emplea menos en diagnostico
debido a su neurotoxocidad.
 Electroforesis en geles de
gradientes: El uso de geles de
poliacrilamida que tienen un
gradiente creciente de
concentración de archilamida +
bisacrilamida, y en consecuencia
un gradiente decreciente en el
tamaño del poro, pueden tener
ventajas sobre los geles de
concentraciones uniformes de
acrilamida. En un gel en gradiente
la proteína migra hasta alcanzar
una zona donde el tamaño de poro
impida cualquier avance. Una vez
se alcanza el límite del poro no se
produce una migración apreciable
aunque no se detiene
completamente. Una de las
ventajas de este tipo de geles es
que resuelve mejor las bandas
pues las concentra en regiones
más estrechas, además de
incrementar el rango de pesos
moleculares que se pueden
resolver en un mismo gel
comparado con los de una
concentración fija.
 Electroforesis en geles de
agarosa: La agarosa es un
polisacárido (originalmente
obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composición
homogénea), cuyas disoluciones
(típicamente de 0.5 a 2 %) poseen
la propiedad de permanecer
liquidas por encima de 50 grados C
y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel está constituido
por una matriz o trama
tridimensional de fibras poliméricas
embebida en gran cantidad de
medio líquido, que retarda el paso
de las moléculas, se usa
usualmente para separar
moléculas grandes de alrededor
20.000 nucleótidos.
 Electroforesis capilar: La
electroforesis capilar se basa en
los mismos principios de las
técnicas electroforéticas
convencionales, pero utiliza
condiciones y tecnología distinta
 que nos permiten obtener una
serie de ventajas al respecto, Esta
separación de péptidos realizada
sobre un capilar de sílica fundida a
potenciales elevados 20 a 30 Kv en
un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire. La ventaja de
esta técnica es que el capilar de
sílica fundida que generalmente se
cubre con una capa de polimina
para darle mayor rigidez y
resistencia, tiene una ventaja a
través de ella que permite el pasaje
de la luz UV de tal manera que la
visualización es on-line. Con esta
técnica descripta es posible
separar cationes, aniones,
proteínas, macromoléculas y contaminada. Tomar medidas para
sustancias no cargadas en forma
simultánea.
 Isoelectroenfoque: Se basa en el
desplazamiento de las moléculas
en un gradiente de pH. Las
moléculas anfotéricas, como los
aminoácidos, se separan en un
medio en el que existe una
diferencia de potencial y un
gradiente de pH. La región del
ánodo es ácida y la del cátodo es
alcalina. Entre ambos se establece
un gradiente de pH tal que las
moléculas que se han de separar
tenga su punto isoeléctrico dentro
del rango. Las sustancias que
inicialmente se encuentran en
regiones de pH inferior a su punto
isoeléctrico estarán cargadas
positivamente y migraran hacia el
cátodo, mientras aquellas que se
encuentran en medios con pH más
bajos que su punto isoeléctrico
tendrán carga negativa y migraran
hacia el ánodo. La migración les
conducirá a una región dónde el pH
coincidirá con su punto
isoeléctrico, tendrán una carga
neta nula y se detendrán [8].
4. Principales fuentes de errores que
se cometen al realizar una
electroforesis
- Contaminación de la muestra: El
primer paso para obtener resultados
precisos es una muestra no
evitar la contaminación durante la
preparación con el uso de guantes,
utilizando sólo envases estériles, y
cambiando la punta de la pipeta
después de cada uso. También se
bebe tener cuidado de no contaminar
la pipeta por tomar la muestra.
- Problemas en el gel: Una
concentración de gel incorrecta puede
hacer que el gel corra demasiado
rápido o no corra en absoluto. Antes
de cargar las muestras, debemos
asegurarnos de que el gel no tiene
cortes o burbujas. Incluso una
pequeña imperfección puede afectar
los resultados. La matriz molecular del
propio gel y la capacidad de la muestra
para correr a través de esta matriz al
extremo cargado positivamente, son
los que demostrarán el tamaño de la
muestra. Un trastorno físico o incluso
una temperatura demasiado extrema
afectarán esta matriz molecular y
pondrán en peligro la validez de los
datos. Por último otro error común es
colocar incorrectamente el peine que
creará los pozos. Ya que un peine que
cree pozos demasiado profundos o
superficiales puede conducir a
errores. El peine no debe llegar
completamente a través del gel a la
parte inferior de la bandeja, pero debe
crear pozos lo suficientemente
profundos para cargar sus muestras
sin desbordamientos.
- Carga de muestras incorrectas: El
exceso de la muestra podría causar
que resulten manchas grandes o que
aparezcan más pequeñas de lo que
realmente son; a su vez, muy poco de
la muestra puede ser imposible de ver.
No perforar el gel al cargar las
muestras, ya que esto puede causar
problemas, al igual que las otras
imperfecciones de gel.
- Problemas en la corriente
eléctrica: Un error común es correr el
gel hacia atrás. Esto sucede cuando
las conexiones positivas y negativas
se unen a los extremos incorrectos de
la bandeja. Se puede evitar este error
recordando que la muestra se correrá
siempre al rojo, por lo que asegúrate
de que el extremo positivo esté unido
en el lado opuesto de la bandeja de los
pocillos de la muestra. También
existen problemas con el uso de un
voltaje incorrecto. Una tensión
demasiado alta puede causar que la
muestra corra al otro extremo del gel
tan rápido que se caiga del mismo,
mientras que una demasiado baja
puede significar que la muestra se
tome demasiado tiempo para correr o
no corra lo suficientemente lejos para
ser cuantificada al final. La colocación
incorrecta de la bandeja con la
corriente o interrupciones pueden
causar que la muestra para corra en
diagonal o inconsistentemente, lo que
puede hacer difícil una medición
precisa.
- Problemas en la visualización: Una
muestra demasiado pequeña puede
ser difícil de visualizar. Los problemas
con los métodos de visualización
también pueden comprometer los
resultados. Los métodos más
comunes usan tintes visibles o
bromuro de etidio (para la
visualización bajo luz ultravioleta).
Estos deben añadirse al gel en las
concentraciones correctas, o la
visualización puede ser obstaculizada.
- Mediciones variables: Es una
fuente ampliamente aceptada de error
en electroforesis en gel. Cuando se
mide la longitud del gel que la muestra
recorrió, la regla será limitada en
precisión, probablemente un
milímetro. Cuando la medida parece
situarse entre milímetros, se dificultará
especificar la medida exacta. Además,
las bandas formadas por
electroforesis pueden variar en grosor
pero medir hasta el borde de la banda
más alejada del pozo es lo más
común. Esta fuente de error
probablemente también afecte el
monto de la muestra [9].
5. No es recomendable debido a que
los geles de agarosa pueden
separar fragmentos de ADN que
van de 200 a 50.000 pares de
bases. La gama de geles de
acrilamida es mucho más
pequeña, menos de 500 pares de
base. La acrilamida es mejor para
la separación de proteínas, ya que
la resolución es mejor que la de los
geles de agarosa. También se
puede utilizar para separar ADN
que difiere únicamente por un solo
par de bases [10].
BIBLIOGRAFIA
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2. Fisher, M. P., Dingman, C. W.
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1971.
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Biochemistry. Second edition.
Saunders College
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Francisco. Electroforesis de
ADN.
4. Túnez-Fiñana, I. (¿?).
Electroforesis: electroforesis en
papel de proteínas séricas.
Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular, Facultad de
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Córdoba.
5. Yábar-Varas, C. (2003).
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PROTEÍNAS Y ADN. Instituto
Nacional de Salud.
6. http://www2.inecc.gob.mx/publi
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sis.pdf. Tomado el 01 de
octubre del 2017 a las 3:45 pm.
7. Aaij C. y P. Borst. (1972). The
gel electrophoresis of DNA.
Biochimica and Biophysica
Acta 269: 192-200.
8. http://biomodel.uah.es/tecnicas
/elfo/inicio.htm. Tomado el 01
de octubre del 2018 a las 4:01
pm.
9. http://www.ibt.unam.mx/compu
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Septiembre del 2017 a las 9:23
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10. https://www.thermofisher.com/
co/en/home/life-science/dna-
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el 01 de Septiembre del 2017 a
las 2:23 pm.