08-05-2017

Valdivia, 2017

¿Cómo hacer una SDS-PAGE?

¿Cómo correr una SDS-PAGE?
Electroforesis

Dr. Joel Asenjo G.

Geles de Corrida y Apilamiento

Técnica de electroforesis discontinua. Se preparan 2 geles, el gel de
corrida donde se separan las proteínas. El gel de apilamiento o gel
concentrador (stacking) que concentra la mezcla
El gel de Corrida que separará las muestras posee mayor
concentración de Acrilamida (10%) y pH más básico ( 8,3). Ofrece
mayor resistencia en la corrida
El gel de apilamiento posee baja concentración de acrilamida (4%) en
tampón ligeramente ácido (Tris/HCl 1M pH 6,8). Ofrece poca
resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a electroforesis por
tanto lo atraviesan con relativa rapidez.
Cuando las proteínas atraviesan el gel de apilamiento, se
encuentran con la resistencia ejercida por el gel de corrida de
manera que aquellas proteínas retardadas puedan alcanzar al resto
y todas inicien la separación desde el mismo punto, mejorando así
la calidad de la corrida.
El gel de apilamiento se prepara siempre a una concentración de
acrilamida del 4%, mientras que el gel de separación o gel de
corrida se prepara según el rango óptimo de resolución:

Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se prepara, en la

parte superior de éste el gel de apilamiento.

Bajo la acción del campo eléctrico, la mezcla proteica, colocada

sobre el gel de apilamiento, comienza a migrar hacia el polo positivo.

Sembrar 20μl de muestra por pocillo mediante el uso de una “pipeta hamilton”

Preparación y colocación de las muestras

Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar el cassette en el

tanque de electroforesis con aproximadamente 500 ml tampón de corrida en el
cual estén sumergidos los electrodos.

Quitar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos del gel.

Preparar las muestras. Se tomarán 20 μl de la muestra y se diluirán con 20 μl

de tampón muestra 5X por pocillo. Calentar 5 min. a 95°C para desnaturalizar.

Incluir un estándar de peso molecular.

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Corrida Electroforética aplicando corriente (100 mA) de 40 a 80 volts 2 h aprox

Tinción del Gel SDS-PAGE
Finalizada la corrida, extraer los vidrios cuidadosamente del cassette y separarlos
de manera que el gel quede posado sobre uno de los vidrios.
•La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie
Sumergir el gel en solución decolorante metanol, ácido acético glacial, agua dest.
para eliminar las asociaciones inespecíficas del gel al colorante
Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta
50 ng
Sumergir el gel en solución colorante azul de Coomassie durante 40 minutos.
•La tinción con plata incrementa la sensibilidad de
Observar las bandas proteicas. detección ( 50 veces aprox)

SDS-PAGE: determinación del peso molecular

Marcadores de Peso Molecular
Marcadores de peso molecular:

* Mezcla de diferentes proteínas pre-

teñidas de las que conocemos el peso
molecular.

* Por comparación podemos averiguar

el PM de nuestra proteína.

SDS-PAGE band profile of the Thermo Scientific PageRuler Prestained

Protein Ladder. Images are from a 4-20% Tris-glycine gel (SDS-PAGE) and
subsequent transfer to membrane.

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DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA

PROTEINA PROBLEMA

(RF)

RF = distancia recorrida por la banda

distancia total al frente de la corrida

Relación entre la movilidad electroforética y la masa ISOELECTROENFOQUE

molecular (PAGE-SDS) * Separación de proteínas según su punto isoeléctrico (pI)

kDa pI es el valor de pH en el que la carga de la proteína = 0

200 si pH > pI: carga (–) pH
si pH < pI: carga (+)
(+) (–)
Logaritmo de la
Masa molecular

100 * Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH.

50 - -
pH 10 Proteínas migran hasta la
40 A B
(básico) - - zona del gel donde
30
pH=pI de la proteína
GRADIENTE DE pH

20
A
0 - 0 pH 7
0 B
0 0 pH 6 Prot A pI=7
0 2 4 6 8 10 12 Prot B pI=6

0 0.16 0.33 0.5 0.66 0.8 1

pH 2
Movilidad electroforética (cm) (ácido)
+ +
Movilidad relativa Tiempo de electroforesis

ELECTROFORESIS 2D ELECTROFORESIS 2D
* 1ª dimensión: ISOELECTROENFOQUE  separa por pI

* 2ª dimensión: SDS-PAGE  separa por PM

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WESTERN BLOT WESTERN BLOT

* Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible) * Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible).
1. SDS-PAGE Electroforesis
SDS-PAGE:
2. Transferencia a membrana 3. Incubación con los Anticuerpos

proteínas proteínas Resultado

2dario
proteína SDS-PAGE Western BLOT
HRP interés
1ario

Resultado
WESTERN BLOT:
SDS-PAGE Western BLOT
4. Revelado
SUSTRATO Todas las Proteína
proteína proteínas de interés
HRP
interés PRODUCTO LUZ

Todas las Proteína

proteínas de interés

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

Ventajas:

* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO

* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
Las aplicaciones más comunes de esta técnica son: * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme
• Análisis del grado de pureza de una proteína
• Determinación de su peso molecular Aplicaciones:
• Verificación de la concentración de proteínas
• Detección de proteólisis * Separar proteínas
• Identificación de proteínas inmunoprecipitadas * Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
• Separación de proteínas marcadas con isótopos * Separar proteínas oligoméricas
radioactivos
* Separar proteínas en función de su pI Electroenfoque

* Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2D

* Ver si hay una proteína en concreto
Western Blot

Simulación de electroforesis de proteínas

en gel de poliacrilamida con SDS

http://biomodel.uah.es/lab/inicio.htm

http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm

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GRACIAS!!