FUNDAMENTOS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

Agar de mueller hinton

USO Para pruebas se susceptibilidad antimicrobiana de bacterias patógenas de importancia clínica por el método de
difusión en disco (Kirby-Bauer).

PRINCIPIO La peptona de caseína ácida y la infusión de carne de res proporcionan los nutrientes necerarios para
favorecer el crecimiento, estos ingredientes tienen un bajo contenido en timina y timidina que evitan la interferencia en
la determinación de la CMI para el sulfametoxasol trimetoprim. El calcio y el magnesio se adicionan para una mejor
determinación de la CMI, de acuerdo a la NCCLS M07-A6. Este medio adicionado con sangre de carnero al 5% (Agar
Mueller-Hinton con sangre de carnero No. de Catálogo 1225-P), se recomienda para la sensibilidad de Streptococcus
viridans. Cuando se agrega hemoglobina y enriquecimiento (Agar Mueller HintonChocolate polienriquecido, No. de
Catálogo 1221-P), es usado para pruebas de sensibilidad de Neisserias. El procedimiento se basa en las sustancias
antimicrobianas impregnadas en discos de papel que se difunden en el agar produciendo diámetros de inhibición que se
correlacionan con un patrón de medición establecido (concentración mínima inhibitoria, CMI). La técnica estándar para
la prueba de susceptibilidad de antimicrobianos se establece en el manual de NCCLS.

Caldo nutritivo

USO Para el aislamiento y cuenta de microorganismos poco exigentes a partir de diversas muestras. En pruebas para
comprobación de esterilidad.

. PRINCIPIO El medio contiene extracto de carne, peptona y agar, siendo una formulación suficiente para el desarrollo
de los microorganismos. El extracto de carne proporciona al medio fuente de carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas. El
empleo de este medio es de acuerdo al tipo de estudio por realizar.

Gelosa sangre

USO Este medio de cultivo adicionado de sangre de carnero o conejo desfibrinada estéril es adecuado para el
aislamiento de bacterias a partir de diversas muestras e investigar su actividad hemolítica.

PRINCIPIO La base de agar sangre es un medio nutritivo en donde la infusión de músculo cardiaco y la peptona,
proporcionan las fuentes de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento. El cloruro de sodio actúa
manteniendo el equilibrio osmótico. Sembrar las placas sobre la superficie del medio de cultivo por estría cruzada y
picadura sobre las estrías, lo que permite observar con mayor claridad la actividad hemolítica como resultado de la
acción bacteriana. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.

Gelosa sangre y azida de sodio

Medio adecuado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos de diversos materiales, debido a que la azida
sódica inhibe la flora Gram negativa. Adicionado con sangre, este medio es adecuado para estudiar reacciones de
hemólisis.

Fundamento Este medio puede ser usado para los aislamientos primarios de estafilococos y estreptococos a partir de
materiales diversos de importancia sanitaria, compuestos de una flora mixta.
La presencia de pluripeptona y extracto de carne, proveen nutrientes para el desarrollo de microorganismos, aún de
aquellos con exigencias nutricionales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
A la concentración empleada, la azida de sodio ejerce un efecto bacteriostático solamente sobre los microorganismos
Gram negativos, favoreciendo el desarrollo de los Gram positivos.
Urea de crhistensen

USO Para la diferenciación de bacterias en base a su capacidad de hidrolizar la urea, principalmente de los géneros
Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter que lo realizan lentamente y del género Proteus.

PRINCIPIO La urea es hidrolizada por los microorganismos que producen la enzima ureasa formando dióxido de carbono
y amoniaco. Este último proporciona reacción alcalina al medio que puede observarse por el vire del indicador de pH
rojo de fenol que cambia de amarillo a rosa intenso. Debido a la composición del medio de cultivo, se detecta la
hidrólisis de la urea por las bacterias con actividad lenta debido a la presencia de glucosa y peptona. La presencia de
glucosa evita las reacciones falsas negativas ya que estimula la actividad de la ureasa aumentando la velocidad del
metabolismo y la reproducción bacteriana. La peptona actúa también como fuente de nitrógeno. Sembrar el
microorganismo de prueba en la superficie del medio. Incubar 24 h a 35ºC.

Caldo nutritivo

USO Es un medio de cultivo universal para microorganismos poco exigentes en cuanto a sus necesidades nutritivas con
su fórmula original o adicionado de indicadores, carbohidratos, sales, líquidos orgánicos, etc.

PRINCIPIO Los ingredientes que contiene la fórmula constituyen la fuente de nutrientes necesarios para el crecimiento
de los microorganismos. El empleo de este medio de cultivo va a depender según los fines requeridos.

Caldo todd hewitt

USO Medio para el cultivo de Estreptococos beta hemolíticos y estudios de tipificación serológica a partir de diversas
muestras.

PRINCIPIO La peptona y la infusión de corazón le proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo de
los microorganismos, la dextrosa la fuente de energía. Los fosfatos y el carbonato de sodio controlan el pH del medio
evitando la inactivación de la hemolisina por la acidez que se genera. Inocular el medio de cultivo con la muestra de
ensayo. Incubar de 2 – 5 h a 35ºC: A partir de esta muestra se puede realizar la identificación de anticuerpos de
Estreptococos del grupo A por fluorescencia. Sembrar la muestra simultáneamente para su aislamiento por estría
cruzada en placas de Gelosa Sangre. Incubar 24 h a 35ºC.

Gelatina nutritiva

USO Medio para el cultivo de Estreptococos beta hemolíticos y estudios de tipificación serológica a partir de diversas
muestras.

PRINCIPIO La peptona y la infusión de corazón le proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo de
los microorganismos, la dextrosa la fuente de energía. Los fosfatos y el carbonato de sodio controlan el pH del medio
evitando la inactivación de la hemolisina por la acidez que se genera. Inocular el medio de cultivo con la muestra de
ensayo. Incubar de 2 – 5 h a 35ºC: A partir de esta muestra se puede realizar la identificación de anticuerpos de
Estreptococos del grupo A por fluorescencia. Sembrar la muestra simultáneamente para su aislamiento por estría
cruzada en placas de Gelosa Sangre. Incubar 24 h a 35ºC.

Medio MIO

USO Para la diferenciación de Enterobacterias, basándose en las pruebas de movilidad, ornitina descarboxilasa y la
producción de indol.
PRINCIPIO Las peptonas proporcionan las fuentes de nitrógeno y carbono, el extracto de levadura proporciona
vitaminas y la dextrosa es la fuente de energía. Inocular el medio de cultivo por picadura. Incubar 18 – 24 h a 35ºC. La
prueba de movilidad se pone de manifiesto por turbidez difusa alrededor de la línea de inoculación. La ornitina
descarboxilasa tiene la facultad de descarboxilar el aminoácido ornitina formando la amina putrescina y liberando
bióxido de carbono (coloración violeta-púrpura). El triptofano por acción de la triptofanasa forma indol y otros
compuestos (escatol e indolacético), al agregar reactivo de Kovacs (p NN dimetil aminobenzaldehido), se produce un
compuesto de color rojo.

Medio VP

USO Para la diferenciación bioquímica de bacterias del grupo Escherichia-Enterobacter.

PRINCIPIO Algunas bacterias utilizan glucosa con formación de una gran cantidad de ácido descendiendo el pH del
medio a menos de 4.4, otras bacterias producen menos ácido modificándolo en menor medida.. Esta variación puede
ponerse de manifiesto a través del Rojo de metilo, que presenta color amarillo por arriba de pH 5.0 y sólo presenta color
rojo cuando el pH es menor de 4.4. A partir de la glucosa, numerosos microorganismos forman acetilmetil-carbinol, 2,3-
butandiol o diacetilo. La demostración de estos productos metabólicos se pone de manifiesto con reactivo de sulfato de
cobre. Inocular 2 tubos de Caldo MR-VP con el cultivo puro objeto de investigación. Incubar hasta 4 días a 35ºC.
Posteriormente realizar los siguientes ensayos: Prueba de Rojo de Metilo: A 5 ml de medio de cultivo incubado 4 días a
35ºC, agregar 5 gotas de solución indicadora (disolver 0.1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol al 95% y aforar a 500
ml con agua destilada). Reacción positiva: Color rojo bien definido. Reacción negativa: Color amarillo. Prueba de Voges-
Proskauer: A 5 ml de cultivo incubado 24 a 48 h, agregar 5 ml de solución de sulfato de cobre y amonio según Leifson
(disolver 1 g de sulfato de cobre en 40 ml de amoníaco concentrado y agregar 690 ml de hidróxido de potasio al 10%).
Reacción positiva: Aparición en 20 minutos de un color rojo indica la presencia de acetilmetil-carbinol. Reacción
negativa: Ausencia de color

Medio SIM

USO Medio semisólido diferencial, para estudios bioquímicos de enterobacterias. Se puede comprobar la formación de
sulfuro, indol y movilidad.

PRINCIPIO El triptofano puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos: indol, escatol e
indolacético. El indol se manifiesta con el reactivo de Kovacs formando un anillo rojo en la superficie del medio. El ácido
sulfhídrico que se libera por acción de los microorganismos sobre los aminoácidos azufrados, se combina con sales de
fierro presentes en el medio, produciendo una reacción que se manifiesta con un precipitado negro en el medio. La
movilidad se observa porque al haber una cantidad menor de agar que la normal de los medios sólidos, los
microorganismos móviles pueden desplazarse fácilmente por todo el medio produciendo turbidez alrededor de la
picadura.

Caldo maltosa

USO Para la identificación bioquímica de microorganismos basándose en su capacidad para fermentar la maltosa.
PRINCIPIO La peptona de caseína proporciona al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos, la maltosa es el carbohidrato fermentable, el rojo de fenol es el indicador de ácido, que se manifiesta
por el cambio de color del medio a amarillo. La detección de gas se observa en la campana de Durham. Los tubos con el
medio de cultivo se inoculan con cultivos puros de las bacterias a investigar. Incubar 24 – 48 h a 35ºC
Caldo sacarosa

USO Para la identificación bioquímica de microorganismos basándose en su capacidad para fermentar la sacarosa.
PRINCIPIO La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos, la
sacarosa es el carbohidrato fermentable, se manifiesta por un cambio de color del indicador el rojo de fenol que vira de
rojo a amarillo. La detección de gas se observa por la formación de vacío o burbuja en la campana de Durham. Los tubos
con el medio de cultivo se inoculan con cultivos puros de las bacterias a investigar. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.

Caldo manitol

USO Para el enriquecimiento selectivo de Estafilococos patógenos en la industria de alimentos.

PRINCIPIO Debido a su alto contenido de cloruro de sodio, permite solo el crecimiento de microorganismos del género
Staphylococcus e inhibe a la mayoría de las bacterias halo-sensibles. El rojo de fenol es el indicador para la detección de
la fermentación del carbohidrato D-manitol, cuya degradación da lugar a la producción de ácido cambiando el color del
medio, de rosado a amarillo. Esta característica está relacionada con la patogenicidad del microorganismo, y es un
indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus. Inocular el medio de cultivo con la muestra problema. Incubar 24 –
48 h a 35ºC.

Gelosa sangre con base de cassman

USO Adicionada de sangre de carnero se emplea para el cultivo de microorganismos patógenos exigentes, como
Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis y la mayor parte de los Streptococcus beta
hemolíticos a partir de muestras clínicas.

PRINCIPIO La polipeptona y el extracto de carne actúan como fuente de aminoácidos, carbono y nitrógeno. La peptona
biotriptasa No.10 y la sangre proporcionan los factores X (hemina) y V (nicotin-adenin-dinucleótido: NAD) necesarios
para el crecimiento de H. influenzae. El almidón de maíz previene la inhibición que producen los ácidos grasos a N.
gonorrhoeae, y facilita la observación de la hemólisis, neutralizando la acción inhibitoria de la dextrosa. Sembrar la
muestra sobre la superficie del medio por estría cruzada. Incubar 24 – 48 h a 35ºC en una atmósfera con 10% de bióxido
de carbono.

Caldo arabinosa

USO Para la identificación bioquímica de microorganismos basándose en su capacidad para fermentar la arabinosa.
PRINCIPIO La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos. La
arabinosa es el carbohidrato fermentable, se manifiesta por un cambio de color del indicador el rojo de fenol que vira de
rojo a amarillo. La detección de gas se observa por la formación de vacío o burbuja en la campana de Durham. Los tubos
con el medio de cultivo se inoculan con cultivos puros de las bacterias a investigar. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.

Caldo xilosa

USO Medio de cultivo para diferenciación bioquímica, basándose en la capacidad de fermentar la xilosa.

PRINCIPIO La peptona de caseína proporciona nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos, la
xilosa es el carbohidrato fermentable, el rojo de fenol es el indicador en la producción de ácido. La producción de gas se
observa en la campana de Durham. La fermentación de la xilosa se manifiesta por cambio de color del indicador rojo de
fenol que vira de rojo a amarillo. Sembrar los tubos conteniendo el medio de cultivo con la cepa pura de prueba. Incubar
24 – 48 h a 35ºC.
Agar bilis esculina

USO Para la investigación preliminar de Enterococos del Grupo D a partir de diversas muestras.

PRINCIPIO La peptona especial y el extracto de carne actúan como fuente de aminoácidos, carbono y nitrógeno. La bilis
de buey inhibe notablemente a bacterias acompañantes en la muestra problema, en tanto que los Enterococos la
toleran y pueden multiplicarse sin problema. Los Enterococos hidrolizan la esculina transformándola en glucosa y
esculetina, ésta con el citrato férrico forma un complejo de color verdoso hasta oscuro alrededor de las colonias
hidrólisis positiva. Sembrar el material de ensayo en la superficie del medio por estría cruzada para obtener colonias
aisladas. Incubar hasta 3 días a 35ºC. Cuando se encuentran Enterococos en la muestra, se observa a las 24 h una
coloración oscura del medio de cultivo alrededor de las colonias; cuando son abundantes y llegan a confluir el
oscurecimiento puede llegar a afectar prácticamente a todo el medio de cultivo. Si después de 3 días de incubación no
se ha producido oscurecimiento en el medio de cultivo, se da por negativo el cultivo para Enterococos.

Presencia de la enzima catalasa

Esta enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Es una hemo-proteína. Uno
de sus sustratos es el H2O2 que se forma durante la degradación de los azúcares. Este compuesto es tóxico si se acumula
en la célula. Su descomposición puede producirse a través de dos enzimas, catalasa y peroxidasa.

La prueba se realiza a partir de un cultivo del microorganismo en caldo nutritivo, agregando unas gotas de agua
oxigenada y observando la formación de burbujas. Es importante partir de cultivos libres de sangre ya que los glóbulos
rojos contienen la enzima.

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es capaz de activar específicamente la cascada de coagulación por activación conformacional (no
proteolítica) de la protrombina. Este proceso desencadena la conversión de fibrinógeno en fibrina lo cual da lugar a la
coagulación aún en presencia de anticoagulantes como el citrato o el oxalato. El resultado es la formación de coágulos o
grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar
microorganismos del género Staphylococcus:

(+) Staphylococcus aureus

(- ) Staphylococcus epidermis

Procedimiento e interpretación:

-Prueba rápida en portaobjetos: se prepara una suspensión bien homogénea del microorganismo sobre el portaobjetos
y se agrega una gota de plasma de conejo. Se mezclar suavemente con el ansa y después por rotación. La prueba se
considera positiva si hay aglutinación microscópica.

-Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de plasma de conejo y una ansada cargada de la bacteria a ensayar. Rotar
suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35ºC 2-4 horas y observar cada 30 minutos.

PRECAUCIÓN: no sacudir el tubo durante la observación, inclínelo suavemente para ver el coágulo. Si este no es visible al
final de las 3 horas, déjelo en la estufa por 24 hs.

La lectura a las 4 horas es fundamental porque puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el coágulo luego de
18 horas de incubación y de esta manera se produzca un test falso negativo.
 Prueba positiva: Coágulo completo o coágulo parcial (el coágulo no abarca completamente la columna del fluido)

Prueba negativa: No hay formación de coágulo, la suspensión permanece homogénea

Prueba de licuefacción de la gelatina

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo proteolítico (gelatinasas).
Para poder ingresar a la célula bacteriana las proteínas deben ser primero catabolizadas a compuestos más pequeños. Las
enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las proteínas. El
catabolismo puede ser considerado en dos etapas:

Proteinasas
Proteína + H2O polipéptidos
Peptidasas
Polipéptidos + H2O aminoácidos

Extracto de carne 3
Medio de cultivo: Gelatina nutritiva
Composición g/l Peptona 5

Se envasa y esteriliza por Tyndallización. Se siembra porGelatina 12

punción. Luego se incuba a 37ºC durante 24hs a 48 hs. Antes de la
lectura se debe enfriar los tubos. Observar la presencia de desarrollo y licuefacción comparando con un tubo control.

Prueba de reducción de Nitratos

Las bacterias pueden utilizar nitratos por asimilación (reducción del nitrato a amoníaco que se utiliza como fuente de
nitrógeno), desasimilación (cuando se utiliza como aceptor final en ausencia de oxígeno, reduciéndose a nitrito) y
desnitrificación (cuando se convierte en productos finales gaseosos, como nitrógeno, óxido nitroso u óxido de
nitrógeno).

La reducción de los nitratos ocurre generalmente en condiciones de baja tensión de oxígeno.

Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el siguiente medio:

Extracto de carne 3
Caldo Nitrato
Peptona 5
(Composición (g/l))
NO3K 1
Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. Se siembra con un inóculo denso y se incuba 24hs. Luego se
determina la presencia de N2, NH3 y NO2- .

Revelado e interpretación:

Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita.

Presencia de NH3: Agregar a una porción del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler (iodomercuriato de potasio). Este
reactivo, en presencia de iones amonio se descompone con formación de ioduro de dimercuriamonio que permite una
determinación colorimétrica de iones amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rápidamente, indica un
resultado positivo.
Presencia de NO2-: Agregar a una porción del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1 (solución acética de ácido sulfanílico) y
luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solución acética de alfa dimetilnaftilamina).

NO3- NO2- + ác. Sulfanílico Sal de diazonio

Sal de diazonio + α –dimetilnaftilamina p sulfurobenceno azo α –naftilamina (color rojo)

La aparición de un color rojo en la superficie indica reacción positiva.

En caso de que esta reacción sea negativa, se puede verificar la presencia del nitrato propio del medio agregando una
pizca de Zn. Dado que el Zn reduce el nitrato a nitrito, si el nitrato del medio no fue reducido debería aparecer el color
rojo confirmando una reacción negativa. En el caso de que el medio permanezca incoloro, la reacción es positiva
habiéndose metabolizado el nitrato hacia otros productos no detectados con las reacciones anteriores.

Prueba de Voges-Proskauer

Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un compuesto neutro, el
acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentación de la glucosa.

La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína). En presencia de O2 (atm) y álcali los
productos finales neutros acetoína y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilo, que es el reactante para el color producido
en la reacción. El diacetilo reacciona con el núcleo guanidinio de la arginina presente en la peptona, en medio alcalino,
dando un color rojizo en la superficie del medio.

La velocidad de desarrollo de color depende de la concentración de acetoína, por lo general el color se produce de los 2
a 5 minutos, obteniéndose la máxima intensidad de color luego de una hora.

El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37ºC durante 24 hs.

Revelado:

Primero: Sobre una alícuota del medio desarrollado agregar 6gotas de una solución alcohólica de -naftol al 5% (actúa
como catalizador en la oxidación de la acetoína a diacetilo). Debe adicionarse antes del álcali.

Segundo: Luego se agregan 2 gotas de una solución de KOH o NaOH al 40%. Se agita el tubo suavemente favoreciendo la
oxidación de la acetoína por el O2 atmosférico.

Interpretación:

Reacción positiva: la aparición de color rojo-rubí en la superficie del medio indica la presencia de acetoína.

Reacción negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos.

Hemólisis

Esta prueba está relacionada con la presencia de factores de virulencia llamados citolisinas que son capaces de formar
poros en la membrana citoplasmática de diferentes células eucarióticas. Un sistema indicador adecuado lo constituyen
los glóbulos rojos ya que la lisis de éstos (hemólisis) es fácilmente demostrable. Para la realización de la prueba, se
incorpora sangre de oveja o carnero al 5% en un medio nutritivo sólido estéril, fundido y templado (55º C
aproximadamente). Las placas se secan a 37ºC y se siembra el microorganismo en estudio.

Interpretación:

a)  hemólisis: destrucción parcial de los glóbulos rojos acompañada por una coloración verdosa o parduzca.

b)  hemólisis: destrucción total de los glóbulos rojos que se observa como una zona transparente alrededor de la
colonia.

c)  ausencia de hemólisis: no hay cambios visibles.

Lecitinasa

En esta prueba se investiga la presencia de lecitinasa (un factor de virulencia) que actúa sobre la lecitina (fosfatidil
colina) de la membrana citoplasmática. Para la prueba se utilizan medios sólidos a los cuales se les agrega yema de
huevo (que contiene lecitina). Las colonias con actividad lecitinásica formarán un halo opaco a su alrededor.

Para el caso de Bacillus cereus, se utilizará el medio de Mossel al cual se le habrá agregado una suspensión de yema de
huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razón de 1ml de suspensión por cada 9 ml de medio.