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El metabolismo, es definido brevemente, como la suma total de las reacciones enzimáticas que
tienen lugar en la célula. Cuatro son las funciones específicas del metabolismo:
1. Obtener energía química del entorno de los elementos orgánicos nutritivos o de la
luz solar
2. Convertir los elementos nutritivos exógenos en los precursores de los componentes
moleculares de las células.
3. Reunir los precursores para formar proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otros
componentes celulares.
4. Formar y degradar aquellas biomoléculas necesarias para las funciones celulares
especializadas.
Las secuencias reaccionales del metabolismo son semejantes en todas las formas de vida
especialmente las que se conocen como rutas metabólicas centrales.
Catabolismo y anabolismo
El metabolismo se divide en catabolismo y anabolismo:
- El catabolismo es lo degradación enzimática, mediante reacciones de oxidación, de
moléculas nutritivas relativamente grandes (carbohidratos, lípidos y proteínas)
procedentes del entorno de la célula o de sus propios depósitos de reservas nutritivas,
hasta transformarlas en moléculas simples y menores, por ejemplo, ácido láctico, ácido
acético, CO 2 , amoníaco o urea. El catabolismo va acompañado de liberación de
energía libre, la cual se conserva en el ATP.
- El anabolismo es la síntesis enzimática de componentes celulares relativamente
grandes de la célula, ejemplo: polisacáridos, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos a partir
de moléculas precursoras sencillas. Puesto que los procesos sintéticos provocan un
aumento en el tamaño y la complejidad de las estructuras, se necesita la energía
proporcionada por el enlace fosfato del ATP.
- Fase I: en esta fase las grandes moléculas de los elementos nutritivos se degradan hasta
los principales componentes. Los polisacáridos son degradados a pentosas o hexosas,
los lípidos a ácidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteínas a sus veinte
aminoácidos constitutivos.
- Fase II: los numerosos productos distintos de la Fase I son recogidos y convertidos en un
número pequeño de moléculas más sencillas. Así, las hexosas, las pentosas y la glicerina
se degradan en el azúcar fosforilado de tres átomos de carbono, el gliceraldehído-3-
fosfato y después hasta un compuesto sencillo de dos átomos de carbono, la acetil-
coenzima A. Los aminoácidos diferentes son también degradados a: acetil-coenzima A,
alfa-cetoglutarato succinato, fumatato y oxalacetato.
- Fase III: Los productos formados en la fase II pasan a la fase III que es el camino común
final en el cual se oxidan a CO 2 + H 2 O .
El anabolismo tiene lugar también en tres fases, comenzando por las pequeñas moléculas
originadas en la tercera fase del catabolismo. Por ejemplo, la síntesis proteica comienza en La
Fase III, a partir de los alfa-cetoácidos que son los precursores de los aminoácidos. En la Fase II
los alfa-cetoácidos son aminados por donadores de grupos aminos y se forman los alfa-
aminoácidos y en la Fase I se reúnen los aminoácidos para producir cadenas peptídicas.
Aunque los caminos del catabolismo y el anabolismo no son idénticos la Fase III constituye un
camino central accesible a ambos. Esta senda central, que recibe el nombre de anfibólica,
desempeña una doble función (amphi: ambos). La ruta anfibólica puede utilizarse
catabólicamente para lograr la degradación completa de pequeñas moléculas producidas en la
Fase II del catabolismo o puede utilizarse anabólicamente como precursora de moléculas para la
Fase II del anabolismo.
Lípidos Polisacáridos Proteínas
Fase I
Ácidos grasos Hexosas
Aminoácidos
glicerina Pentosas
Gliceraldehído
3-fosfato
Fase II
Fosfoenol
piruvato
Piruvato
Acetil - C o A
citrato
oxalacetato
isocitrato
Fase III malato
LA ENERGÍA EN LA CÉLULA
Las moléculas orgánicas complejas, tales como la glucosa contienen mucha energía potencial
a causa de su elevado grado de ordenación estructural; poseen una entropía relativamente
pequeña. Cuando la molécula de glucosa se oxida y forma seis moléculas de CO 2 y
seis de H 2 O , sus átomos experimentan un aumento en el desorden. Como resultado de esta.
transformación, la molécula de glucosa experimenta una pérdida de energía libre que es energía
útil y capaz de realizar trabajo. La energía libre se conserva, como energía química,
específicamente como ATP. Dado que el ATP formado puede difundirse hacia aquellos lugares
en la célula en que se necesite su energía, constituye una forma de transportar la energía. La
energía química del ATP se libera después, durante la transferencia de su grupo o grupos
fosfatos terminales, a determinadas moléculas de un aceptor especifico, que adquiere un nivel
superior de energía y puede realizar trabajo. Un segundo camino para transportar la energía
química de las reacciones de óxido-reducción del catabolismo a las reacciones anabólicas, que
necesita de energía, es en forma de electrones. En la síntesis de algunas biomoléculas ricas en
hidrógeno, tales como los ácidos grasos y el colesterol, se requieren electrones e hidrógeno para
la reducción de los enlaces dobles a simples. En La célula los electrones son transportados
enzimáticamente desde las oxidaciones productoras de electrones tales como los dobles
enlaces carbono-carbono o carbono-oxígeno, mediante coenzimas transportadoras de
electrones, la más importante es la nicotinamida-adenin-dinucleótido fosfato (NADP). El NADP
desempeña de este modo, el panel de transportador de electrones ricos en energía desde las
reacciones catabólicas hasta las reacciones anabólicas que los necesitan.
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El sistema ATP - ADP actúa como transportador de energía química, ya que el ADP es capaz de
aceptar un grupo fosfato en las reacciones acopladas productoras de energía del catabolismo, y
el ATP así formado puede ceder su grupo fosfato terminal, en otras reacciones acopladas que
requieren energía.
En este capítulo examinaremos los principios químicos y termodinámicos en que se basa el
funcionamiento del sistema ATP - ADP.
NH2
N
N ATP
N N
O O O
HO P O P O P OH2 C O
OH OH OH
H H
H
H : hidrógenos que cede en su disociación
OH OH
El ADP posee tres protones ionizables, dos de ellos están completamente disociados a pH 7,0 y
el tercero que posee un pK' de 7,2 a pH 7,0 se halla disociado alrededor del 39%. La elevada
concentración de cargas negativas en torno al grupo trifosfato del ATP constituye un factor
importante en su naturaleza de compuesto de alto contenido energético. En la célula intacta
existen muy pocas cantidades de ATP y de ADP en forma de aniones libres, se hallan presentes
en su mayor parte en forma de complejos Mg ATP y Mg ADP a causa de la gran afinidad de los
grupos pirofosfato para enlazar cationes divalentes y de la elevada concentración de ión Mg + +
en el fluido intracelular. La afinidad del ATP por el Mg + + es unas diez veces mayor que la del
ADP.
mg
-
O O O
-
Adenina Ribosa O P O P O P O mg-ATP
O O O
mg
O O
-
Adenina Ribosa O P O P O mg-ADP
O O
En muchas de las reacciones enzimáticas en que participa el ATP como dador de fosfato, su
forma activa es la del complejo mg-ATP. El ADP y el ATP pueden separarse y medirse con
facilidad mediante electroforesis o por cromatografía en capa fina.
Estado de equilibrio
La primera ley de termodinámica es el principio de conservación de la energía. La energía no se
crea ni se destruye, sino que se transforma en una u otra forma (ej. calorífica, química,
mecánica, etc.).
La segunda ley establece algunas limitaciones en los tipos de transformaciones energéticas que
ocurren en los procesos físicos-químicos, y predice la dirección en que es probable que ocurra
un proceso determinado. Establece que todos los procesos tienden a evolucionar en una
dirección tal que la entropía del sistema más la del entorno, aumenta hasta alcanzar un estado
de equilibrio.
- entropía: se define como el grado de desorden.
- equilibrio: se define como aquel estado en que no ocurre ningún cambio físico o químico
ulterior, y en el que la temperatura, la presión y la concentración son uniformes en todo el
sistema.
UN SISTEMA DE EQUILIBRIO
1. Ha agotado su capacidad de realizar trabajo sobre su entorno,
2. El proceso no puede invertirse de modo espontáneo y volver a su estado inicial, lo cual
requerirá una disminución de entropía. Un sistema desordenado al azar no se reordena por
si mismo espontáneamente.
Los procesos que se realizan con aumento de entropía se denominan irreversibles. Los procesos
que tienen lugar sin cambio de entropía son reversibles.
Ejemplo: si tenemos bloques de piedra dispuestos al azar y queremos disponerlos de tal modo
que formen un arco la entropía o sea el grado de organización disminuye y es reversible porque
espontáneamente sin cambio de entropía puede pasar del orden al desorden (arco a bloques al
azar).
entropía (∆S) elevada (desorden) (∆S) disminuye
irreversible
reversible
espontáneo
endotérmico
exotérmico
En los sistemas biológicos las reacciones químicas tienen lugar en disoluciones acuosas
diluidas, en las que la temperatura, presión y volumen permanecen constantes. En estas
condiciones, ∆PV es cero, por lo tanto:
∆H = ∆E
Si sustituimos en la ecuación (1)
∆G = ∆E - T.∆S
reordenamos la ecuación:
∆E = ∆G + T.∆S
Con esta ecuación vemos que a temperatura y presión constantes la variación de energía total
del sistema ( ∆E ) (que es equivalente al cambio calórico ∆H ) es la suma de T.∆. más la
variación de la energía libre.
La variación de energía libre puede definirse corro aquella fracción del cambio de energía total
del sistema disponible para realizar trabajo a medida que el sistema evoluciona hacia su estado
de equilibrio, a T y P constantes. Mientras el sistema se aproxima al equilibrio, la energía libre
disminuye hasta un valor mínimo.
[C]c .[D]d
∆G = ∆Gº + RT ln (4)
[A ] .[B]
a b
en la que los términos A, B, C y D son las concentraciones molares de A, B, C, y D y a, b, c y d
son ahora los exponentes de sus concentraciones. R es la constante de los gases (1,987 cal
mol-1 grado-1); T la temperatura absoluta y ∆Gº la variación de energía libre estándar. Cuando la
reacción (3) se halla en equilibrio, independientemente de las concentraciones iniciales de A, B,
C y D prevalece la condición que la energía libre es mínima y no es posible ningún cambio
ulterior; por tanto ∆G = 0 . Entonces:
[C]c .[D]d
0 = ∆Gº + RT ln
b
(5)
[A ] .[B]
a
De donde:
[C]c .[D]d
∆Gº = − RT ln a b (6)
[A ] .[B]
Puesto que la constante de equilibrio K'eq para la ecuación (3) es:
[C]c .[D]d
K' eq = a b (7 )
[A ] .[B]
Esta ecuación nos muestra que ∆Gº , la variación de energía libre estándar de una reacción
química, puede calcularse a partir de su constante de equilibrio. La ∆Gº constituye, por lo tanto,
una constante termodinámica para una reacción química dada. Puede definirse de otro modo,
que indica claramente su verdadero significado. La variación de energía libre estándar de una
reacción constituye, en realidad, la diferencia existente entre la energía libre estándar de los
reactivos y la energía libre estándar de los productos, hallándose cada término ajustado a la
estequiometría de la ecuación de reacción:
∆Gº = ∑ Gº productos − ∑ Gº reaccionantes
Para la reacción (3) será:
∆Gº = (c G º C + d G º D ) − (a G º A + b G º B )
La energía libre estándar de un compuesto constituye la medida de la cantidad total de energía
libre que puede proporcionar por descomposición completa. Es importante comprender la
diferencia que hay entre ∆Gº , que es la variación de energía libre estándar, y ∆G que es la
variación de energía libre medida o real. Esta diferencia puede explicarse mejor utilizando una
analogía. ∆Gº es un valor constante para una determinada reacción a una temperatura también
determinada. Por otra arte, ∆G varía con las concentraciones de los reaccionantes y de los
productos. El valor de ∆Gº únicamente es igual al de ∆G cuando todos los reactivos y todos los
productos están presentes a concentración 1,0M. El valor de ∆G es el que determina si una
reacción química ocurrirá en la dirección escrita, partiendo de unas concentraciones de
reaccionantes determinadas.
Reacuérdese que una reacción química solamente ocurrirá si ∆G es negativo, es decir, si la
energía libre del sistema disminuye. Las reacciones químicas con un ∆Gº negativo reciben el
nombre de exergónicas; se realizan espontáneamente en la dirección en que están escritas. Si
recordamos el ejemplo de los bloques:
ordenado
desordenado
Las reacciones con un cambio de energía libre estándar positivo reciben el nombre de
endergónicas o endotérmicas, no se realizan de modo espontáneo en la dirección en que se
escriben. Volviendo al ejemplo:
desordenado
ordenado
hexoquinasa
ATP + glucosa ADP + glucosa_6_fosfato
K'eq = 661
fosfatasa
glucosa_6_fosfato + H2O glucosa + fosfato Pi
K'eq = 171
fosfatasa
glucosa_6_fosfato + H2O glucosa + fosfato Pi
Puesto que los valores de ∆Gº de las dos reacciones son aditivas, la ∆Gº de la hidrólisis del
ATP puede calcularse a partir de ellos:
Sin embargo el único grupo fosfato del AMP tiene un valor mucho menor:
Lo que sucede es que los enlaces entre grupos fosfatos adyacentes son enlaces del tipo de
anhídrido, mientras que el enlace entre el fosfato y la ribosa en el AMP es un enlace éster.
∆Gº (kcal)
Fosfoenol piruvato ………………………. - 14.80
1-3 difosfoglicerato ……………………... - 11.80
∆Gº = > ATP
Fosfocreatina …………………………….. - 10.30
Fosfoarginina …………………………….. - 7.70
O sea que la función del sistema ATP-ADP, consiste en servir como transportador obligatorio
intermedio de grupos fosfato desde los compuestos con enlaces fosfato de elevado nivel
energético, situados por encima del ATP en la escala termodinámica, hasta las moléculas
aceptoras que forman compuestos con enlaces fosfato de bajo nivel energético situados en la
escala por debajo del ATP.
Fosfoenol piruvato
Dadores de P de alta energía
P
Reservorio de fosfocreatina
1-3 difosfoglicerato
P
P
ATP
P
Aceptores de P Glucosa_6_fosfato
de baja energía P
Glicerol_3_fosfato
La figura es un esquema de las reacciones enzimáticas de transferencia de fosfato en la célula.
Constituye un rasgo importante que el sistema ATP-ADP sea el nexo de unión obligado entre los
compuestos fosfato de elevado y de bajo nivel energético. Los grupos fosfato se transfieren, en
primer lugar, mediante la acción de fosfotransferasas específicas, desde compuestos de alto
nivel energético al ADP, como en el ejemplo:
piruvato -
fosfoenol piruvato + ADP piruvato + ATP
quinasa
El ATP así formado se transforma entonces en el dador de fosfato específico de una segunda
reacción enzimática, para formar compuestos fosfato de baja energía.
hexoquinasa
ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa_6_fosfato
A + B C + D
D + E F + G
ambas reacciones están ligadas por un intermediario común, en este caso el componente D. El
único camino mediante el cual la energía química puede ser transferida desde una reacción a
otra en condiciones isotérmicas es el de que ambas reacciones posean un intermediario de
reacción común. Casi todas la reacciones metabólicas de la célula se realizan mediante
secuencias de esta clase. En las reacciones consecutivas, responsables de la transferencia de
energía a través del ATP, la energía química se transfiere desde un dador fosfato de elevada
energía hasta el ADP, y se conserva en forma de ATP como producto de reacción. En la
reacción subsiguiente, el ATP se comporta como un sustrato, y cuando pierde su grupo fosfato
terminal, que cede a la molécula del aceptor, ésta última aumenta su contenido energético. Por
lo tanto, el ATP es el intermediario común. En realidad, la transferencia de intermediarios
comunes constituye un atributo general de las reacciones químicas y no necesita por fuerza, ni
grupos fosfatos, ni ATP. En efecto, veremos que muchos grupos funcionales distintos del fosfato,
por ejemplo, átomos de hidrógeno, grupos acetilo, se transfieren enzimáticamente mediante
reacciones consecutivas que poseen intermediarios comunes, tales reacciones pueden
analizarse termodinámicamente por los mismos métodos que se han desarrollado para el caso
especial de las transferencias del grupo fosfato.
ATP
P UTP
Polisacáridos
ATP
P GTP
Proteínas
ATP
P CTP
Lípidos
ATP
P CTP
P GTP
ARN
P UTP
ATP
P d ATP
P d GTP
ADN
P d TTP
P d CTP
Todas estas canalizaciones conectan con el ATP mediante la enzima nucleósidos difosfoquinasa
presente en las mitocondrias y en el citoplasma de la célula, cataliza las reacciones del tipo
mostrado en el esquema. Cada tipo de nucleósido trifosfato posee una función especializada.
Por ejemplo: el UTP es el dador de fosfato inmediato, y por lo tanto el donador de energía de
reacciones que conducen a la síntesis de polisacáridos.
PAPEL DEL AMP Y DEL PIROFOSFATO
Aunque el ADP constituye el producto de muchas reacciones celulares que emplean el ATP, y el
ADP es el aceptor directo del fosfato en las reacciones productoras de energía de la glicólisis y
de la fosforilación oxidativa de la mitocondria; en muchas de las reacciones que utilizan el ATP
en la célula los dos grupos fosfato terminales de éste se separan conjuntamente en forma de
pirofosfato y se libera AMP como producto.
El pirofosfato inorgánico es un compuesto fosfato de nivel energético elevado que posee un ∆Gº
de hidrólisis comparable al fosfato terminal del ATP. ara regenerar el ATP a partir de PPi y AMP
intervienen dos enzimas auxiliares: la pirofosfatasa inorgánica y la adenilato-quinasa. La primera
cataliza la hidrólisis del pirofosfato inorgánico (PPi).
PPi + H2O 2 Pi
Esta hidrólisis secundaria del pirofosfato constituye una etapa valiosa de liberación de energía, la
cual se utiliza para asegurar que ciertas reacciones biosintéticas se realicen por completo. El Pi
formado se utiliza para la regeneración del ATP a partir de ADP. La adenilato-quinasa cataliza la
refosforilación del AMP a ADP.
FERMENTACION Y RESPIRACION
Los organismos inferiores que viven en condiciones anaerobias (ciertas bacterias, invertebrados
inferiores) obtienen su energía de la fermentación de la glucosa. Los organismos que viven en
condiciones aerobias (hongos, bacterias, mayoría de los animales y plantas superiores)
degradan sus combustibles por la ruta anaerobia pero después oxidan los productos de la
fermentación utilizando el oxigeno molecular. En esta fermentación el oxidante final o aceptor
final es una molécula orgánica producida en el proceso fermentativo. En los organismos
superiores la ruta anaerobia es una primera etapa de la fase aerobia de la respiración.
glucosa glucosa
sin O2 fermentación
CO2 + H2O
triosas triosas
C C C C C C C C C C C C
En estas reacciones tenemos que hablar de las reacciones de óxido reducción que se producen
en todo organismo donde el agente oxidante recibe los electrones y el agente reductor entrega
electrones. En este caso de la fermentación alcohólica el etanol es una molécula relativamente
reducida rica en H 2 , pobre en O 2 . La molécula de CO 2 es relativamente oxidada, pobre en H 2 .
En el caso de la fermentación homoláctica el grupo metilo se halla más reducido que el grupo
carbonilo. Veamos la reacción completa:
O
C
H CH3
HC OH
HO C H + 2 Pi + 2 ADP 2 CH OH + 2 ATP + 2 H2O
HC OH COOH
HC OH
CH2 OH
Se deduce de estos datos que la transformación de glucosa en lactato proporciona energía para
producir la fosforilación de 2 moléculas de ADP a ATP. Esta reacción es irreversible. Lo
demuestra el ∆Gº negativo.
ETAPA DE LA GLUCOLISIS:
La glucólisis es catalizada por la acción de un grupo de 11 enzimas. Se cree que están
localizadas en la porción soluble del citoplasma. Se pueden considerar dos etapas o fases. En la
primera fase la glucosa se fosforila y se esciende pare formar gliceraldehído 3 P; y en la
segunda fase éste se convierte en ácido láctico.
- LA FASE I: constituye un proceso preparativo o de congregación en el que cierto número
de hexosas penetran en el esquema, después de fosforilarse a expensas del ATP, y dan
un producto común, el gliceraldehído 3 P.
- LA FASE II: es la ruta común para todos los azúcares, se produce la fosforilación del
ADP y se llevan a cabo las reacciones de óxido reducción, obteniéndose el lactato.
FASE I glucosa-1-P
galactosa ADP
manosa glucosa-6-P
Congregación de azúcares sencillos y pentosa
su conversión en fosfato de fructosa-6-P
gliceraldehído; entrada de ATP ATP ADP
fructosa-1-6-di P
glicealdehído-3-P (2)
2 NAD+
Pi
fosfoenolpiruvato (2)
2 ADP
2 ATP piruvato (2)
2 NAD+
2 lactato
1. Fosforilación de glucosa por el ATP: catalizada por dos enzimas: la hexoquinasa y
glucoquinasa.
Mg++
ATP + glucosa ADP + glucosa-6-P ∆Gº = −4 kcal
O O
H H H H
H H
+ ATP ADP + ∆Gº = -4 kcal
OH H OH H
OH OH OH OH
H OH H OH
glucosa glucosa-6-fosfato
CH2 OPO3=
CH2 OPO 3=
O O
H H CH2 OH
H
H OH H OH
glucosa-6-P fructosa-6-P
H OH H OH
4. Escisión de la fructosa 1 - 6 difosfato por una aldosa (la fructosa-1-6-difosfato
gliceraldehído 3-liasa) dando fosfato de dihidroxiacetona + gliceraldehído-3-fosfato.
1. CH2 OPO 3=
2. C O H
1. CH2 OPO 3= 4. C O
3. HO CH
∆Gº = + 5.73 kcal
2. C O + 5. H COH
4. H COH
3. CH2 OH 6. CH2 OPO 3=
5. H COH
6. CH2 OPO 3=
CH2 OPO 3= C
H
∆Gº = 1.83 kcal
C O H C OH
SEGUNDA FASE
1. Oxidación del gliceraldehído 3 P a 1-3 difosfoglicerato. La enzima que actúa es
G_3_fosfato deshidrogenasa, o gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa.
C O PO 3=
H
C O HC OH
CH2 OPO 3=
O
1. C 3. CH2 OPO 3=
O PO 3=
- -
COO COO
3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato
CH2 OH CH2
enolasa
H COPO 3=
C O PO 3= + H2O ∆Gº = + 0.44 kcal
- -
COO COO
2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato
5. Transferencia de fosfato desde el fosfoenolpiruvato al ADP. El fosfoenolpiruvato da
piruvato por una enzima piruvato quinasa en presencia de ADP y Mg + + .
CH3
CH2
∆Gº = − 7.5 kcal
C O PO 3= + ADP ATP + C O
(reacción irreversible)
- -
COO COO
fosfoenolpiruvato piruvato
CH3
CH3
-
- COO
COO
piruvato lactato
BALANCE GLOBAL
2 ADP
I. OBJETIVOS
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
1. Dosar glucosa en sangre realizando en forma práctica una curva de tolerancia a la
glucosa.
2. Interpretar una curva de tolerancia a la glucosa en condiciones normales.
3. Establecer si en el organismo existen o no trastornos o alteraciones en el metabolismo de
los Hidratas de Carbono.
II. INTRODUCCIÓN
Los principales Hidratos de Carbono del organismo animal son la glucosa y el glucógeno.
La glucosa existe libre en los tejidos y en la sangre en aproximadamente la misma
concentración.
El glucógeno representa el hidrato de carbono de reserva y se encuentra en todos los tejidos
en concentración muy variable.
Los hidratos de carbono que se ingieren, se absorben y son utilizados por el organismo
previa conversión en glucosa y glucógeno.
En el individuo normal la concentración de glucosa en sangre muestra valores constantes si
se la determina después de varias horas de ayuno y reposo. Estos valores oscilan entre 75 y
100 mg. por 100 ml de sangre (glucemia normal).
La ingestión de alimentos hidrocarbonados produce una elevación de la glucemia que
alcanza su máximo valor entre la media y una hora siguiente a la ingesta. Los mecanismos
de regulación que se ponen en juego ante el ingreso en el torrente sanguíneo de la glucosa
absorbida en intestino, consiguen sustraer sus. excesos de la circulación y restablecer los
valores a sus límites previos al cabo de 2 a 3 horas.
Los tejidos, en especial hígado y músculo esquelético, contribuyen en esa acción oxidando
más glucosa y/o depositándola en forma de glucógeno.
El estudio de la evolución de la glucemia después de la administración de glucosa puede
indicar la eficiencia de los procesos mediante los cuales el organismo utiliza la glucosa. Ello
permite obtener la llamada curva de tolerancia a la glucosa.
El tipo de curva obtenido puede revelar ciertos trastornos del metabolismo hidrocarbonado.
B T D
Agua destilada 0.05 ml ----------- -----------
Testigo ----------- 0.05 ml -----------
Muestra ----------- ----------- 0.05 ml
Reactivo 5 ml. 5 ml 5 ml
Llevar los tubos a B. M. hirviente de 4 1/2 a 5 minutos. Retirar y colocar en agua fría de
2 a 5 minutos. Leer en espectrofotómetro a 630 mm llevando a cero el aparato con el
blanco. El color es estable 45 minutos.
IV. INFORME
1. Escriba el fundamento de los métodos empleados para determinar glucosa en sangre y
orina.
2. Realizar una curva colocando en las abscisas los miligramos por ciento de glucosa en
sangre y en las ordenadas los tiempos.
V. REACTIVOS
Cinta de Dextrotix
Reactivo Cromogénico: solución 990 mmol/l de acetato de 0-toluidina y 10 mmol/l de
tiocarbamida en ácido acético al 88% como catalizador.
Standard o testigo: solución estabilizada de glucosa (concentración 1 gr/litro).
Reactivo de Benedict:
Sulfato de cobre 17,3 gr
Citrato de sodio 173 gr
Carbonato de sodio anhidro 100 gr
Carbonato de sodio cristal 270 gr
Agua destilada hasta 1000 ml
Disolver en caliente el citrato y el carbonato en 800 ml de agua, se enfría y se filtra si es
necesario. Disolver el sulfato en 150 ml de agua y añadir en la solución anterior por
pequeñas porciones, agitando constantemente. Completar con agua destilada hasta 1000 ml.
VI. BIBLIOGRAFÍA
- AIQUIEL, V. Manual de Análisis Clínicos, 1969
- BLANCO, A. Guía de Trabajos Prácticos de la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional de Córdoba, 1972.
TEMA XV: CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXILICOS Y VIA DEL FOSFOGLUCONATO
Energética de la fermentación y respiración. Plan de organización de la respiración. Oxidación
del piruvato a acetil CoA. Ciclo de Krebs. Vías del fosfogluconato.
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Las células aerobias obtienen la mayor parte de su energía de respiración, esto es, gracias a
una transferencia de electrones desde les moléculas orgánicas combustibles hasta el oxigeno
molecular. La respiración es mucho más compleja que la glicólisis.
En este tema se esboza el plan general de le respiración y después se considera con
detenimiento el ciclo del ácido tricarboxílico de Krebs, que es la ruta catabólica común por la que
finalmente se degradan todas las moléculas combustibles de la célula (carbohidratos, ácidos
grasos y aminoácidos).
También se describe la ruta del fosfogluconato de oxidación de la glucosa, mecanismo que
genera potencial de reducción para las reacciones biosintéticas.
Cuando las células fermentan a la glucosa anaerobiamente, los productos que ya no son
susceptibles de ulterior empleo, y por ello abandonan la célula, todavía contienen la mayor parte
de la energía de la molécula de glucosa original. Por esta razón, las células que viven
anaerobiamente, para obtener una misma cantidad de energía utilizable tienen que consumir
mucho más cosa que cuando viven en condiciones aerobias.
Acetil-CoA
oxalacetato citrato
cis-aconitato
Ciclo del ácido malato
isocitrato
tricarboxilo CO2
fumarato -oxoglutarato
CO2
succinato
2H 2H 2H 2H
NAD
flavoproteina
ADP + Pi ATP
coenzima Q
Transporte electrónico
y fosforilación citocromo c
oxidativa ADP + Pi ATP
citocromo b
citocromo a + a3
+
ADP A Pi ATP
2 H+ + 1/2 O2 H2O
Oxidación del Piruvato a acetil CoA
O
Piruvato
CH3 C COOH
NAD+ NADH2
HS-CoA CO2 O
CH3 C S CoA + CO 2
Acetil-CoA
S
CH2
CH
(CH2)4
COOH
La decarboxilación oxidante del piruvato a acetil CoA + CO 2 necesita tres enzimas diferentes y 5
coenzimas que constituyen el:
Piruvato-deshidrogenasa
enzimas dihidrolipoil-transacetilasa
dihidrolipoil-deshidrogenasa
Sistema de la
piruvato-deshidrogenasa Coenzima A
ácido lipoico
coenzimas Pirofosfato de tiamina (TPP)
NAD
FAD
O
CH3 C S CoA CoA SH
COOH
COOH CH2
Acetil-CoA citrato
C O HO C COOH
oxalacetato
CH2 CH2
COOH COOH
En esta reacción el grupo metilo (CH3 − ) de la acetil CoA se condensa con el átomo de
carbono carbonílico del oxalacetato con la hidrólisis del enlace tioéster y formación de la
CoA − SH libre.
O
C
2. Actúa una enzima, la aconitasa que cataliza la formación de isocitrato con formación de un
compuesto intermedio el cis-aconitato. En esta reacción se produce pérdida, y posterior
adición de agua.
OH H2O
COOH COOH
citrato cis-aconitato
H2O
COOH CH2 CH CH COOH
COOH OH
isocitrato
CO2 O
COOH CH2 CH CH COOH COOH CH2 CH2 C COOH
COOH OH NAD+
NADH2
isocitrato alfa-cetoglutarato
La reacción transcurre con gran descenso de ∆Gº es una reacción altamente exergónica.
COOH CH2 CH2 COOH + FAD COOH CH2 CH2 COOH + FADH2
succinato fumarato
6. Se produce una hidratación del fumarato dando malato, actuando coma catalizador la
fumarasa.
OH
COOH CH CH COOH + H2O COOH C CH2 COOH
H
OH O
+
COOH C CH2 COOH + NAD COOH C CH2 COOH + NADH2
H
Podemos ahora resumir los productos producidos en una vuelta del ciclo del ácido tricarboxílico.
Dos átomos de carbono aparecen en forma de CO 2 equivalentes, aunque no idénticos, a los
dos átomos de carbono del grupo acetilo que ingresa en el ciclo. Por deshidrogenación
enzimática se producen cuatro pares de átomos de hidrógeno, tres pares se utilizan para reducir
el NAD y uno para reducir el FAD. En último término, estos cuatro pares de átomos de hidrógeno
y electrones se combinan con el oxígeno, una vez realizado su transporte a lo largo de la cadena
respiratoria.
H C OH C O COOH
H C OH H C OH H C OH
+ +
O + NADP O + NADP
HO C H HO C H HO C H
H C OH H C OH HC OH
H C H C HC OH
glucosa-6-fosfato 6-fosfogluconato-lactona
CH2 OH
COOH C O
H C OH
H COH
H C OH
+ NADP+ H COH + NADPH2 + CO2
HO C H
CH2OPO 3=
H C OH
CH2OPO 3=
6-fosfogluconato ribulosa-5-fosfato
3. Por acción de la fosfo-pentosaepimerasa la ribulosa-5-fosfato se transforma
reversiblemente en xilulosa-5-fosfato, su epímero en el átomo de carbono 3. Por acción
de la fosfo-pentosa-isomerasa, la ribulosa-5-fosfato, puede convertirse, también
reversiblemente, en su isómero aldo, la ribosa-5-fosfato que puede emplearse en la
síntesis de los nucleótidos que contienen pentosa y el ARN.
CH2 OH
C O
HO C H xilulosa-5-fosfato
CH2 OH
HC OH
C O sa
era
im CH2OPO 3=
ep
H C OH
CHO
H C OH
iso HC OH
me
CH2OPO 3= ras
a
H C OH ribosa-5-fosfato
ribulosa-5-fosfato
H C OH
CH2OPO 3=
El resultado neto es la producción del NADPH necesario para las reacciones biosintéticas de
reducción en el citoplasma extramitocondrial, y la formación de ribosa como precursor para la
síntesis de nucleótidos. En otras circunstancias, sin embargo, la ruta del fosfogluconato continúa
más allá, ya que las pentosas-5-fosfato pueden experimentar otras transformaciones que son
posibles gracias a dos enzimas adicionales: la transcetolasa y la transaldolasa.
- La transcetolasa que contiene pirofosfato de tiamina íntimamente unido como coenzima y
Mg + + , realiza la transferencia de un grupo glicoaldehído desde la xilulosa-5-fosfato a la
ribosa 5 fosfato. En este proceso el grupo glicolaldehído ( CH 2 OH − CO − ) se transfiere en
primer lugar al pirofosfato de tiamina unido e la enzima, que actúa como transportador
intermediario del grupo glicolaldehído, que a continuación es transferido a la molécula del
aceptor, la ribosa-5-fosfato. El resultado neto consiste en la formación de un ceto-azúcar de 7
átomos de carbono, la sedo heptulosa-7-fosfato, y un azúcar de 3 átomos de carbono, el
glicer aldehído-3-fosfato.
CH2 OH CHO CH2 OH
C O HCOH C O
HO C H + H C OH HO C H + CHO
H C OH H C OH HC OH HC OH
HC OH
CH2 O PO 3=
CH2 OH CH2 OH
C O C O
HO C H CHO HO C H CHO
H C OH + H C OH H C OH + HC OH
H C OH CH2 O PO 3= H C OH HC OH
CH2 O PO 3=
H C OH CH2 O PO 3=
CH2 O PO 3=
-------------------------------------------------
Veremos en este capítulo que los pares de electrones derivados de los intermediarios del ciclo
del ácido tricarboxílico fluyen a lo largo de una cadena de varios eslabones, constituidos por
enzimas de transporte electrónico, con niveles de energía sucesivamente inferiores hasta reducir
al oxígeno molecular, que es el último aceptor electrónico, en la respiración. Durante este
proceso se conserva gran parte de la energía libre de estos electrones en forma de energía del
enlace fosfato del ATP; el proceso se denomina fosforilación oxidativa.
El transporte electrónico y la fosforilación oxidativa suceden en casi todas las células aerobias;
las enzimas que catalizan estas reacciones se hallan localizadas en la membrana interna de las
mitocondrias.
Zn Zn++
carga 0 carga 2
Se produce una oxidación del Zn porque de carga 0 pasa a carga 2. A su vez el ión Cu + +
capta los electrones.
carga 2 carga 0
Resumiendo:
1. la pérdida de electrones se denomina oxidación
2. la ganancia de electrones se denomina reducción
c. En compuestos orgánicos el proceso de oxidación se acompaña de pérdida de hidrógeno o
ganancia de oxígeno.
H H H H
H2O -2H H2O -2H
H C H H C OH H C O H C O CO2
-2H -2H
H H
ácido anhídrido
metano metanol metanal carbónico
metanoico
ganancía de oxígeno
oxidación pérdida de electrones
pérdida de hidrógeno
pérdida de oxígeno
reducción ganancia de electrones
ganancia de hidrógeno
Las reacciones de oxidación-reducción son aquellas en que tiene lugar una transferencia de
electrones, desde un dador electrónico (el reductor) hasta un aceptor electrónico (el agente
oxidante u oxidante). Es decir que siempre que hay pérdida de electrones por un átomo se
produce una transferencia de electrones a otro átomo. O sea que la oxidación y la reducción son
simultáneas.
Al equilibrio entre la forma reducida y oxidada se llama sistema de óxido reducción o sistema
redox. La tendencia de un agente reductor a perder electrones se puede expresar mediante el
potencial de reducción estándar. Es decir colocando la especie oxidante y reductora a
concentración 1.0 M, pH = 7, y a 25º C. Para medir el potencial se establece como patrón de
referencia el potencial de reducción del H 2 en la siguiente reacción.
H2 2H+ + +2e-
El cual por convención se ha establecido que es igual a 0,0 voltios, cuando la presión de H 2
gaseoso es de 1,0 atmósfera, la concentración 1,0 M, el pH 0,0 y temperatura 25º C. Cuando se
corrige este valor a pH 7,0 el potencial estándar del sistema hidrógeno-ión hidrógeno es de -0,42
voltios.
Potenciales de reducción estándar de algunos pares redox
Los sistemas que poseen un potencial estándar de reducción más negativo que el del par
+
H2 2H muestran mayor tendencia a perder electrones que el hidrógeno; los que poseen
potencial más positivo tienen menor tendencia a perder electrones. Obsérvese la pareja agua-
oxígeno: posee un potencial estándar de reducción fuertemente positivo.
H2 1/2 O2 + 2 H+ + +2e-
Por dicha razón el agua muestra muy poca tendencia a perder electrones y a formar oxígeno
molecular. Dicho de otro modo, el oxígeno molecular tiene gran afinidad por los electrones,
superior que la de aceptores biológicos de electrones tales como el NAD + , las flavoproteínas y
los citocromos.
Cadena respiratoria:
cit. b c a+ a3
Enzimas de óxido-reducción: Tres son las clases principales de enzimas que participan de la
corriente del transporte electrónico desde los sustratos orgánicos hasta el oxigeno molecular. De
acuerdo al orden en que participan son los siguientes:
1. Deshidrogenasas ligadas a la piridina que requieren NAD o NADP como coenzima.
Participan en la primera parte del eslabón:
2. Deshidrogenasas ligadas a la flavina que tienen como grupo prostético al FAD o al FMN.
Participan en la segunda parte del eslabón
FADH + H CoQ
FAD CoQH + H
cit. b c a+ a3
HO P O H2C O adenina
H H
OH OH
CONH2
+
HO P O H2C O N
H H
O
OH OH
H H
CONH2 CONH2
+ 2H + H+
+
N N
R R
Deshidrogenases ligadas a la flavina:
Esta clase de enzimas contienen flavin-adenin-dinucleótido (FAD) o bien flavín-mononucleótido
(FMN) como grupos prostéticos. En la mayor parte de las flavín-deshidrogenasas el nucleótido
flavínico se halla firmemente unido y no se separa de la enzima durante el ciclo catalítico.
Veamos la estructura del FMN:
6-7 dimetil-iso-aloxacina
CH2
CH2
CH2
riboflavina CH2
(vitamina B2)
CH2
FDN
O OH
HO P OH O P OCH2 O adenina
H H
O O
H
OH OH
FDN: resulta de la unión pirofosfórica entre el FMN y el AMP. La parte activa del FAD y del FMN
es el anillo de isoaloxacina.
O H O
H N H
N
CH3 N CH3 N
CH3 CH3
N N O N N O
R R H
Estructura: los citocromos tienen grupos prostéticos hierro porfirínicos. El anillo porfirínico deriva
del compuesto tetrapirrólico llamado porfina que se designa según sus cadenas laterales
sustituyentes.
HC CH
N
N HN
N
HC CH
Forman quelatos (literalmente, cuatro dientes) con iones metálicos como el hierro, por ejemplo.
En los citocromos, el átomo de Fe experimenta cambios reversibles entre las formas Fe (II) y Fe
(III); su función real es la de desempeñar el papel de transportadores electrónicos.
Energética del transporte electrónico-Fosforilación oxidativa: hemos visto que el ∆Gº que
se produce en el transcurso de cualquier reacción química es función de su constante de
equilibrio.
∆Gº = −RT Ink eq
puede utilizarse una forma modificada de esta expresión para calcular la ∆Gº que se produce
cuando reaccionan entre sí dos pares de óxido-reducción cuyos potenciales de reducción
estándar son conocidos.
∆Gº = − nFT ∆E' 0
En cada uno de ellos se produce una disminución de energía libre suficientemente grande para
que se origine la formación acoplada del ATP a partir de ADP y de fosfato. Las ∆Gº en otros
puntos de la cadena son pequeñas y, por ello resultan insuficientes para provocar la formación
de una molécula de ATP.
y de su componente endergónico:
La fosforilación oxidativa acoplada de tres moléculas de ATP conserva por lo tanto 21,9/52,7 x
100, es decir, alrededor del 40% del descenso total de energía libre. Sólo se formarán 3
moléculas de ATP si el sustrato se oxida a nivel del NAD. Puede ocurrir que el sustrato entregue
sus electrones a la flavoproteina (por ej. succinato) en este caso se producen 2 moléculas de
ATP; y si entrega sus electrones al citocromo a, (por ej. ácido ascórbico) se forma solamente una
molécula de ATP.
Balance energético de un proceso de respiración: es decir, el ∆Gº , cuando la glucosa se
oxida completamente hasta CO 2 + H 2 O por la secuencia glicocolítica y el ciclo del ácido
tricabroxílico.
1.
a
glucosa 2 piruvato
2.
2 piruvato 2 acetil CoA
Resumiendo:
a ………….. 6 ATP
b ………….. 6 ATP
c ………….. 6 ATP
d ………….. 4 ATP
e ………….. 2 ATP
24 ATP
4. El NAD + H + que se produce en la glicólisis en el pasaje de gliceraldehído
3 P → 3 P glicerato , cuando el proceso es anaerobio se reoxida en el pasaje de
piruvato → lactato .
Cuando el proceso es aerobio el NADH + H + se reoxida en la cadena respiratoria, por lo tanto se
producen 2 ATP x 2 (porque son dos moléculas de NADH + H + ) = 4 ATP. O sea que el balance
global será:
1. ………….. 2 ATP
2. .………….. 6 ATP glucosa + 6 O2 + 36 Pi + 36 ADP
3. ………….. 24 ATP
6 CO2 + 36 ATP + 42 H2O
4. ………….. 4 ATP
36 ATP
componente endergónico
NADH + H+ NAD+
DIHIDROXICETONA-P GLICEROL-FOSFATO
NAD
FAD
ATP
ATP
O2
TRABAJO PRACTICO Nº 14
OXIDACIONES BIOLÓGICAS
I. OBJETIVOS
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
a). Definir oxidación y reducción
b). Realizar un esquema de la cadena respiratoria (oxidación biológica)
c). Reconocer prácticamente reacciones de óxido-reducción
d). Discutir un articulo de revista y sacar las conclusiones del mismo.
II. INTRODUCCION
Como los conceptos de oxidación y reducción en química general son aplicables a las
reacciones biológicas, es necesario fijar las siguientes nociones elementales:
Una oxidación puede considerarse como:
a). ganancia de oxigeno
b). pérdida de hidrógeno
c). pérdida de electrones
La reducción indica lo inverso de la oxidación, es decir:
a). pérdida de oxigeno
b). ganancia de hidrógeno
c). ganancia de electrones
Si bien se ha definido separadamente oxidación y reducción, es imposible que se produzca una
oxidación aislada, sin la correspondiente reducción simultánea. Los electrones que se
desprenden del elemento o compuesto que se oxida no pueden existir al estado libre y se fijan a
otro elemento o compuesto que, en consecuencia, se reduce.
La mayoría de las oxidaciones biológicas se cumplen en la llamada cadena respiratoria, a través
de una serie de reacciones catalizadas por sistemas enzimáticos presentes en las mitocondrias y
cuya función es la producción controlada de energía. Esta puede ser acumulada en compuestos
de alto contenido energético (ATP) gracias a los procesos de fosforilación acoplados a aquellas
oxidaciones.
La primera parte de la cadena respiratoria comprende una serie de pasos en los cuales los
hidrógenos del sustrato se transfieren sucesivamente a través de varios sistemas o etapas . A
partir de los citocromos se continúa con la transferencia de electrones hasta un aceptor final, el
oxigeno. El esquema siguiente representa la secuencia de etapas y los puntos de entrada de
algunos sustratos. También se observa los sitios de inhibición del transporte de electrones
ISOCITRATO PIRUVATO
MALATO
GLUTAMATO FLAVOPROTEINA 5
NAD
3-HIDROXIACIL CoA
rotenona succinato
FLAVOPROTEINA 3 barbitúrico
FLAVOPROTEINA 3
COENZIMA Q
Glicerofosfato
FLAVOPROTEINA 3
CITOCROMO b
Antimicina A ATP
CITOCROMO C1
CITOCROMO C
CITOCROMO a + a3 ATP
Cianuro
SO4 Cu + Zn SO4 Zn + Cu
Interpretación:
Zn - 2 e- Zn++ (oxidación)
Cu++ + 2 e- Cu (reducción)
2 I- - 2 e- I2 (oxidación)
IV. PANEL
A continuación se discutirán dos artículos básicos (ver bibliografía), sobre mitocondria y
cadena respiratoria, cuyos autores son investigadores de gran relevancia.
V. INFORME:
a. Explicar las reacciones de óxido-reducción realizados en el laboratorio.
b. Escribir las conclusiones de cada uno de los artículos comentados en el Panel.
VI. REACTIVOS
1.- Ácido nítrico diluido (2N): mida 133 ml de NO 3 H concentrado y diluya hasta 1000 ml con
agua destilada.
2.- Sulfato de cobre 1,5%: disuelva 15g de SO 4 Cu en 1000 ml de agua destilada.
3.- Ioduro de potasio 2%: disuelva 20 g IK en 1000 de agua.
4.- Cloruro férrico 0.5%: disuelva 5 g de Cl 3 Fe en 1000 ml de agua.
VII. BIBLIOGRAFIA
1. Blanco A. Guía de Trabajos Prácticos de la Facultad de Ciencias Médicas de la
Universidad Nacional de Córdoba . Capitulo 8º, 1972.
2. Green David. La Mitocondria en la Célula viva (Selecciones de Scientific American), pp.
105 - 113. Ed. Blene, 1970.
3. Racker, Efrain. La Membrana de la Mitocondria en: la célula viva (Selecciones de
Scientific American), pp 150 - 158. Ed. Blene 1970.
TEMA XVIII: Oxidación de los ácidos grasos
Hidrólisis intracelular de los lípidos. Ciclo de oxidación de los ácidos grasos: activación y entrada
de los ácidos grasos a la mitocondria. Primera deshidrogenación. Hidratación. Segunda
deshidrogenación. Clivaje tiolico. Oxidación de los ácidos grasos insaturados. Cuerpos cetónicos
y su oxidación. Oxidación de los ácidos grasos de carbono impar.
------------------------------------------
Ácidos grasos a
oxidarse provienen 1. grasa de depósito constituida
por triacilgliceroles.
b. fuente endógena
2. fosfoglicéridos de las
membranas
A. Hidrólisis intracelular:
Los ácidos grasos deben hallarse en forma libre, es decir no esterificados, para que puedan
experimentar el proceso de activación y oxidación. Para ello, deben en primer lugar, hidrolizarse
por la acción de lipasas intracelulares para rendir ácidos grasos libres y glicerina. Se sabe
relativamente poco acerca de la secuencia y detalles de la hidrólisis intracelular de los lípidos.
Sin embargo, en general, no tiene lugar acumulación significativa de ácidos grasos o de otros
productos de hidrólisis que serían tóxicos para la estructura de la membrana. Evidentemente, la
velocidad y la ruta de hidrólisis de los lípidos intracelulares esta ajustada a la velocidad de
utilización de los ácidos grasos.
B. Ciclo de los ácidos grasos:
Activación y penetración de los ácidos grasos en el interior de la mitocondria: existen 3
fases en la entrada de los ácidos grasos procedentes del citoplasma extramitocondrial, en el
interior de la mitocondria.
1. Esterificación enzimática del ácido graso libre con la CoA extramitocondrial, a expensas
del ATP, que tiene lugar en la membrana exterior.
2. Transferencia del grupo acilo graso desde la CoA a la molécula transportadora
carnitina, la cual lo conduce a través de la membrana interior.
3. Transferencia del grupo acilo graso desde la carnitina a la CoA intramitocondrial.
Activación de los ácidos grasos: tres enzimas diferentes catalizan la formación de ésteres
acil-CoA graso; cada una de ellas se especifica para un determinado intervalo de longitud de
cadena de ácido graso.
Las últimas dos tioquinasas activan tanto los ácidos grasos saturados como los no saturados.
Las tres se encuentran en la membrana exterior de la mitocondria. Las propiedades y
mecanismos de las tres tioquinasas, son mas o menos idénticos. La reacción global
catalizada por las tioquinasas ligadas al ATP es la siguiente:
A medida que el enlace tioéster se forna entre el grupo carboxilo del ácido graso y el grupo
tiol de la CoA, el ATP experimenta ruptura pirofosfórica y rinde AMP + PPi . A su vez el PPi
formado resulta hidrolizado por la pirofosfatasa inorgánica.
PPi + H2O 2 Pi
El efecto neto de esta hidrólisis es la utilización de dos enlaces fosfato de elevada energía
para impulsar el equilibrio global de la etapa de activación a la formación de acil CoA graso.
Transferencia de carnitina: Los ácidos grasos superiores poseen una capacidad limitada
para atravesar la membrana interior de la mitocondria en forma de ésteres de CoA; pero su
entrada es estimulada por la carnitina. En el proceso actúa una enzima la acil-CoA graso:
carnitin transferasa de ácido graso, que cataliza la transferencia del grupo acilo graso desde
su enlace tioéster con la CoA, a un enlace éster con la carnitina que es un enlace de elevada
energía.
CH3 O
+
CH3 N CH2 CH CH2 COOH + R C S CoA
CH3 OH
CH3
+
CH3 N CH2 CH CH2 COOH + CoA SH
CH3 O
C O
2 3
R CH2 CH2 C SCoA acil-graso CoA
E FADoxi.
H O
El enlace no saturado ∆ 2,3 formado en esta reacción es el isómero geométrico trans. Los
electrones del FAD red. son cedidos a la cadena respiratoria.
D. Etapa de hidratación: La hidratación reversible del doble enlace de los ésteres ∆ 2,3
enoílicos del CoA para formar beta-hidroxiacil-CoA es catalizada por la enzima enoil-
hidratasa.
H O
OH O
H
O O
+
R CH2 C CH2 C SCoA + NADH + H
O O
O
O
R CH2 C SCoA + CH3 C SCoA
Ahora podemos escribir la ecuación para las siete vueltas del espiral necesarias a fin de
convertir una molécula de palmitoil-CoA en 8 moléculas de acetil CoA (el ácido palmítico
tiene 16 átomos de carbono). Cada molécula de FADH2 cede un par de equivalentes
electrónicos a la cadena respiratoria a nivel de la CoA y se generan 2 moléculas de ATP. De
modo análogo, la oxidación de cada molécula de NADH da por resultado la formación de 3
moléculas de ATP. Por lo tanto, se forman un total de 5 moléculas de ATP por molécula de
acetil-CoA escindido. Podemos escribir ahora la ecuación que también comprende las
fosforilaciones:
Las 8 moléculas de acetil CoA formadas en el ciclo del ácido graso pueden incorporarse
ahora al ciclo de Krebs
(2) 8 acetil CoA + 16 O2 + 96 Pi + 96 ADP
Oxidación de los acidos grasos no saturados: Los ácidos grasos no saturados, son
oxidados por las mismas rutas generales que los ácidos saturados; pero se plantean dos
problemas:
1. Los dobles enlaces de los ácidos grasos no saturados existentes en la naturaleza
se hallan en la configuración geométrica cis, mientras que los ésteres ∆ 2,3
insaturados del acil CoA que actúan como intermediarios en la oxidación de los
ácidos grasos saturados, son trans.
2. Los dobles enlaces de la mayor parte de los ácidos grasos no saturados aparecen
en posiciones tales que la eliminación sucesiva de fragmentos de 2 átomos de
carbono rinde un acil-CoA graso ∆ 3,4 en lugar de ∆ 2,3 .
Se ha resuelto este problema con el descubrimiento de una enzima auxiliar, la ∆ 3,4 -cis- ∆ 2,3 -
trans-enoil CoA-isomerasa que cataliza el desplazamiento del doble enlace desde la
configuración ∆ 3,4 -cis a la ∆ 2,3 -trans que es el sustrato normal de la siguiente enzima de la
secuencia de oxidación del ácido-graso.
CH3 O
OH
Oxidación de ácidos grasos de número impar de carbonos: Estos ácidos grasos raramente
se encuentran en la naturaleza. Son oxidados por el ciclo de oxidación del ácido graso. Se
separan sucesivamente restos de acetil CoA hasta que se llega a un resto terminal de tres
átomos de carbono: propionil-CoA. El propionil CoA experimenta una carboxilación enzimática
que lo transforma en metil-malonil CoA que es isomerizado a succinil CoA, que pierde la CoA
para rendir succinato que se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico.
TRABAJO PRACTICO Nº 16
METABOLISMO LIPIDICO
I. OBJETIVOS:
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará en condiciones de:
a. Reconocer sueros lipémicos y no lipémicos;
b. Esquematizar un lipidograma con las fracciones de transporte de los lípidos;
c. Interpretar los mecanismos principales del metabolismo lipídico;
d. Reconocer cuerpos cetónicos en orina.
B. TRANSPORTE
Los lípidos son insolubles, en agua, a pesar de ello los lípidos plasmáticos están en
solución porque están combinados con una proteína que los transporta. La gran molécula
resultante, una lipoproteína es soluble en agua. Todas las lipoproteínas contienen
proteína, colesterol, fosfoglicéridos y triacilglicéridos. Esta "micela" está dispuesta de tal
modo que la proteína y los grupos hidrosolubles se hallan en la parte externa, en
contacto con el plasma acuoso, mientras que los grupos no solubles están en el centro.
Debido a la parte proteica de la molécula, las lipoproteínas pueden separarse por
electroforesis. Se reconocen cuatro bandas:
- alfa-lipoproteína: que contiene principalmente fosfoglicéridos;
- prebeta-lipoproteína: contiene principalmente triacilgliceroles;
- betalipoproteína: contiene principalmente colesterol;
- quilomicrones: contiene principalmente triacilgliceroles.
En el plasma normal tomado en ayunas, las bandas alfa y beta son las únicas visibles.
Las prebetalipoproteína son visibles cuando existe excesiva síntesis endógena de
triacilgliceroles y en personas que tienen una dieta con elevado contenido en hidratos de
carbono. Los quilomicrones aparecen después de una comida rica en grasas. Se
mostrarán lipoproteínogramas pura observar como se transportan las grasas unida a la
proteína.
Glucosa
Por el ciclo
glicolítico α glicero fosfato
Quilomicrones
Ácidos grasos
Prebetalipoproteína Triacilgliceroles
Los ácidos grasos libres son transportados por la albúmina. La vida media de los ácidos
grasos es corta por eliminación del plasma por una de las dos vías siguientes:
a). Los ácidos grasos son la fuente principal del organismo en ayunas.
b). El exceso de ácidos grasos puede ser captado por hígado, reesterificado a
triacilglicerol y liberado como triacilglicerol endógeno que forman las
prebetalipoproteínas y son metabolizadas en tejido adiposo.
Cuando una gran cantidad de ácido graso alcanza el hígado, parte de los mismos es
convertida en cuerpo cetónico. Se comprobará químicamente la existencia de cuerpos
cetónicos en la orina.
III. INFORME
Realice un informe de los puntos A, B y C.
IV. BIBLIOGRAFIA
Zilva, J.; “Bioquímica clínica en el diagnóstico y tratamiento”. Cap. XI. 1973
TEMA XIX: Degradación oxidativa de los aminoácidos
Esquema de la oxidación de los aminoácidos. Transaminación y función del piridoxal fosfato.
Desaminación oxidativa. Vías de la acetil CoA y del alfacetoglutorato, del succinato, del
oxalacetato. Formación de los productos de excreción nitrogenada. Ciclo de la urea. Excreción
de amoníaco. Formación de ácido úrico.
------------------------------------------------
Aunque la función primordial de los A.A. es la de ser precursores de las proteínas y de otras
biomoléculas, se emplean con frecuencia como fuente energética. Los animales superiores
oxidan activamente los aminoácidos tanto exógenos corno endógenos. Aún cuando no se haya
ingerido cantidad alguna de proteínas, los seres humanos pueden excretar hasta 5 grs. de N2
cada día, que corresponden a la oxidación neta de casi 30 grs. de proteína endógena. El ciclo de
los ácidos tricarboxílicos es la ruta definitiva para la oxidación de los esqueletos carbonados de
los aminoácidos.
En este capítulo describiremos la degradación oxidativa de los aminoácidos normalmente
presentes como unidades estructurales de las proteínas, lo que constituye la corriente principal
del catabolismo de los aminoácidos. Aunque las reacciones enzimáticas básicas implicadas en el
catabolismo aminoácido son en su mayor parte semejantes en todos los organismos, el ritmo
real de utilización y la proporción de los diferentes aminoácidos empleados en un organismo
determinado dependen de muchos factores que incluyen:
1. La capacidad genética para metabolizar aminoácidos;
2. La asequibilidad de aminoácidos del entorno;
3. La dependencia nutritiva del organismo respecto de los aminoácidos esenciales;
4. La disponibilidad de otros combustibles caloríficos;
5. Las necesidades de aminoácidos del organismo para la síntesis proteica;
6. La necesidad de aminoácidos específicos como precursores de ciertas biomoléculas
importantes, tales como purinas, pirimidinas, componentes de la pared celular, hormonas
y otras moléculas especializadas.
PROTEOLISIS
Antes que las proteínas puedan incorporarse a las rutas catabólicas deben experimentar
hidrólisis completa hasta transformarse en aminoácidos ya que las moléculas proteicas intactas y
la mayoría de los péptidos no pueden atravesar la membrana celular, mientras que los
aminoácidos libres son absorbidos fácilmente. Los péptidos extracelulares y las proteínas con
frecuencia son hidrolizados por acción de enzimas segregadas al entorno, por ejemplo muchos
microorganismos forman y segregan peptidasas y enzimas proteolíticas. Sin embargo, la
proteólisis extracelular ha sido estudiada con máximo detalle en el tracto digestivo de los
vertebrados (ver proceso en página 460 de Lehninger). Por acción combinada de las enzimas
proteolíticas segregadas por el estómago, el páncreas y el intestino delgado, las proteínas
ingeridas se hidrolizan por completo hasta aminoácidos, los cuales son absorbidos por las
células epiteliales del intestino delgado, mediante un transporte activo que requiere energía. Los
aminoácidos son enviados luego a los tejidos por medio de la sangre. Al entrar en las células
individuales también por transporte activo, se incorporan a los canales metabólicos. Se sabe
muy poco de la proteólisis intracelular, que en algunos tejidos como el hígado, tiene lugar a un
ritmo elevado.
ESQUEMA DE LA OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS
Para la oxidación de los 20 aminoácidos diferentes existen 20 secuencias multienzimáticas
distintas. En último término todas convergen en unas pocas rutas terminales que conducen al
ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los esqueletos hidrocarbonados de 10 de los A.A. son
convertidos finalmente en acetil-CoA, ya sea por la vía del piruvato o por la del acetoacil-CoA,
cinco se convierten en α oxoglutorato, tres en succinil-CoA y dos en oxalacetato. La fenilalanina
y la tirosina se degradan de modo que una porción del esqueleto hidrocarbonado se incorpora
como acetil-CoA y lo otra como fumarato. Sin embargo no todos los átomos de C de los 20 A.A.
se incorporan al ciclo del ácido tricarboxílico ya que algunos se pierden por el camino de la
descarboxilación. Las rutas del catabolismo no son necesariamente idénticas a las de la
biosíntesis, pero hay algunas etapas que son comunes.
Alanina
Arginina
Cisteína Glutamato
Piruvato Histidina
Glicocola
Glutamina
Serina
Prolina
Treonina
α Oxoglutarato
Isocitrato
Isoleucina
Leucina Isoleucina
Triptófano Succinil-CoA Metionina
Citrato Valina
Acetil-CoA Succinato
Oxalacetato Tirosina
Fumarato
Acetoacetil-CoA
Fenilalamina
Malato
Aspartato
Fenilalanina
Asparagina
Tirosina
Leucina
Lisina
Triptófano
Los grupos α -amino de los aminoácidos comparten un destino común, al menos en los
vertebrados, los cuales excretan el N2 amínico en forma de Urea, Amoníaco o de Ácido Úrico,
según la especie. Los mecanismos por los cuales los grupos − NH2 son eliminados de los A.A. y
luego convertidos en cualquiera de los tres productos de excreción, son completamente
semejantes. Puesto que la eliminación de los grupos − NH2 constituye la primera etapa en la
degradación de los A.A., examinaremos ahora los dos procesos principales implicados en esta
reacción, ellos son la Transaminación y la Desaminación Oxidativa.
TRANSAMINACION: Por este proceso el grupo amino de por lo menos 11 aminoácidos es
separado enzimáticamente por transaminación y transferido al carbono α de uno o tres α
oxoácidos (piruvato; α -oxoglutarato o al oxalacetato). Por lo tanto el aminoácido al perder su
grupo NH2 se transforma en el oxoácido correspondiente y el α -oxoácido que acepta el grupo
NH2 se transforma en el aminoácido correspondiente. Dos transaminasas importantes son: la
ALANIN-TRANSAMINASA; que cataliza la reacción:
Ejemplo de transaminación:
R' O O NH2
COOH H
Fosfato de piridoxal
Durante su ciclo catalítico en las transaminasas, la coenzima experimenta reacciones reversibles
entre la forma de aldehído libre (fosfato de piridoxal) y su forma aminada (el fosfato de
piridoxamina). Se produce el ciclo en dos etapas:
El complejo enzima-fosfato de piridoxal, acepta un grupo amino del dador de grupos − NH 2 con
formación de un complejo enzima-fosfato de piridoxamina; ello ocurre mediante dos bases de
Shiff intermedias.
El complejo enzima-fosfato de piridoxamina forma una base de con el aceptor entrante del grupo
NH 2 , el α -oxoácido, al que se cede a continuación el grupo NH 2 .
NH2 O H H
R1 CH COOH + E C H H2O + R1 C N C E
Base de Shiff I
enzima-fosfato de
COOH α − oxoácido piridoxamina
Base de Shiff II
α oxoácido COOH
aceptor de NH2
Base de Shiff III
H H O NH2
R2 C N C E E C H + R2 CH COOH
DESAMINACION OXIDATIVA
Este proceso ocurre en la mitocondria y los grupos NH 2 recogidos de los diferentes aminoácidos
por la acción de las transaminasas, aparecen en el último término en forma de grupos α -aminos
del L-glutamato. En algunas células, particularmente en las bacterias, el glutamato experimenta
una desaminación oxidativa rápida, catalizada por la glutamato-deshidrogenasa ligada a la
piridina.
Glutamato deshidrogenasa
Treonina
Cistina
Glicocola
Ácido Pirúvico
Acetil-CoA
El esquema muestra los portales de entrada por los que penetran en el ciclo de los ácidos
carboxílicos, los esqueletos carbonados de los diferentes aminoácidos. Las rutas de los 20 A.A.
dependen del punto de entrada. El punto principal de entrada en el ciclo es por la vía del acetil-
CoA, diez aminoácidos penetran por esta ruta, cinco de ellos se degradan al acetil-CoA por la vía
del piruvato y los restantes por la del acetoacetil-CoA.
NH2
CH3 CH CH COOH
OH
Treonina
O
Glicocola H2N CH2 COOH CH3 C
H acetaldehído
Serin-
hidroximetil
CH OH tranferasa
NH2 NAD+
ATP
Serina CH2 CH COOH CoA
OH Serina
deshidrasa
O
Acetil CoA
Arginina Prolina
Semialdehído
glutámico
Histidina Glutamina
Ácido Glutámico
α − cetoglutar ato
El esquema muestra las rutas que conducen hasta el α -cetoglutarato de los distintos A.A. para
poder entrar al ciclo de Krebs.
METIONINA
Ácido α−oxobutírico
Isoileucina
Propionil-CoA
Valina
Metilmalonil-CoA
Succil-CoA
El aspartato así formado, experimenta transaminación con el ácido α -oxoglutarato para formar
ácido oxalacético.
De esta manera los cuatro átomos de carbono de estos aminoácidos pueden incorporarse al
ciclo de Krebs. En las plantas y en algunos microorganismos el ácido aspártico experimenta una
eliminación directa de NH3 para dar fumarato, catalizada por la enzima aspartasa, que no se
encuentra presente en los tejidos animales.
CICLO DE LA UREA
La formación de urea tiene lugar casi por completo en el hígado de los organismos ureotélicos,
es catalizada por un mecanismo cíclico denominado ciclo de la urea. Penetran en este ciclo dos
grupos aminos que proceden inicialmente de los α -aminoácidos por desaminación, junto con
una molécula de CO 2 y forman arginina a partir de la ornitina, diaminoácido homólogo de la
lisina. Esta parte del ciclo de la urea tiene lugar en casi todos los organismos capaces de realizar
la biosíntesis de la arginina pero solamente los animales ureotélicos poseen grandes cantidades
de enzima arginasa, que cataliza la hidrólisis irreversible de la arginina para formar urea
regenerando ornitina. La urea molécula neutra soluble en H 2 O se excreta con la orina.
- NH2 arginina
ácido
- NH2 aspártico arginasa
- NH2 carbomil-
fosfato
C NH2 ornitina
El primer grupo NH 2 que entra al ciclo surge en forma de NH3 libre como consecuencia de la
desaminación oxidativa ligada al NAD + del glutamato en las mitocondrias.
Entonces el NH3 libre es utilizado junto con el CO 2 para formar fosfato de carbamilo en una
reacción compleja, catalizada por la carbamil-fosfato sintetasa.
-
O O
-
CO2 + NH3 + 2 ATP + H2O H2N C O P O + ADP + Pi
O
Fosfato de carbamilo
Se necesitan dos moléculas de ATP para formar cada molécula de fosfato de carbamilo que
interviene en esta reacción, la cual es irreversible. El fosfato de carbamilo es un compuesto rico
en energía. El fosfato de carbamilo originado en esta reacción, cede a continuación, su grupo
carbamilo a la ornitina para formar citrulina y fosfato; la reacción es catalizada por la ornitin-
transcarbamilasa. El segundo grupo − NH 2 penetra después en el ciclo de la urea, al que llega
en forma de aspartato que a su vez lo adquirió del glutamato por acción de la aspartato-
glutamato-transaminasa.
EXCRECION DE AMONIACO:
Se cree que en los organismos amonotélicos los grupos − NH 2 derivados a diversos α -
aminoácidos, se transaminan para formar glutamato, que experimenta después una
desaminación oxidativa mediante la glutamato-deshidrogenasa. El NH3 así formado se convierte
después en N 2 amídico de la glutamina, que es la forma de transporte del NH3 en la mayor
parte de organismos. La glutamina se forma por acción de la glutamina-sintetasa a partir de
ácido glutámico.
NH2 O NH2
Mg++
HOOC CH2 CH2 CH COOH + NH3 + ATP H2N C CH2 CH2 CH COOH + ADP + Pi
La glutamina rinde NH3 libre en los túbulos renales de la mayoría de los vertebrados, pero esta
reacción predomina en los organismos amonotélicos La reacción es:
El NH +4 así formado pasa directamente a la orina. Dado que la glutamina no es tóxica constituye
un medio de transporte eficaz del NH3 .
OH
C N C N O2
N C C N C
− NH2
Amino ácidos C H
C C Xantin
C C oxidasa
N N HO N N
H
H
O H
H C N
N C
C O
C C
O N N
H H
Acido Urico
(forma oxo)
TRABAJO PRACTICO Nº 17
METABOLISMO NITROGENADO
I. OBJETIVOS
1). Reconocer la influencia de la composición de la dieta sobre la concentración en plasma y
eliminación urinaria de algunos compuestos que son productos finales del catabolismo
nitrogenado en el organismo humano.
II. INTRODUCCION
En este trabajo práctico se requiere colaboración de tres alumnos en cada grupo de trabajo.
Los resultados de la experiencia y las enseñanzas que todos los alumnos reciban de la
misma, dependen de la seriedad y responsabilidad puestas en el cumplimiento de las
instrucciones. Por ello se ruega a quienes participan en la prueba, observar estrictamente las
indicaciones que se dan a continuación. Cada uno de los voluntarios comenzará con la dieta
que se le asigne cuatro días antes de la fecha en la cual su comisión realiza el trabajo y la
mantendrá hasta el día del práctico. Durante las 24 hs. anteriores al T.P. recogerá la orina de
todas sus micciones y la irá acumulando en un recipiente perfectamente conservado en
refrigerador. Al concurrir al laboratorio colocará en un recipiente perfectamente limpio unos
150 a 200 ml. de orina que representa una muestra del total de orina emitida durante ese
lapso. La interpretación de los resultados exige conocimientos de ciertas vías del
metabolismo nitrogenado: formación de úrea, biosíntesis de creatina, metabolismo del
triptófano y catabolismo de bases púricas. Además, es conveniente repasar conceptos
generales de nutrición y de composición de alimentos. Por ello se aconseja el estudio previo
de esos temas para un aprovechamiento racional de la experiencia.-
Leche 300 15 9 9
Queso 50 -- 10 10
Huevo 1 unidad -- 6 6
Carne 250 -- 50 12
A 200 9 2 --
B 200 20 2 --
Vegetales C 200 40 4 --
Frutas 400 60 4 --
Pan 250 150 22 --
Dulce 30 24 -- --
Azucar 50 50 -- --
Manteca 30 -- -- 24
Aceite 40 -- -- 40
368 109 101
Desayuno:
150 grs. de leche o té, café o mate
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan o galletitas
15 grs. de manteca
15 grs. de dulce
A media mañana :
1 fruta
Almuerzo y cena:
1 porción de carne : 150 grs. (vacuno, ave o pescado). A la plancha, a la parrilla
o al horno
1 porción de verduras (300 grs.). En ensalada, hervidas, al horno, en tortilla,
etc.
1 huevo (en la cena) duro, cocido blando o en preparaciones.
1 cucharada de aceite (20 grs.)
50 grs. de pan
1 fruta
Té o café
Merienda :
Té o café o 1 gaseosa
1 sandwich (100 grs. de pan, 50 grs. de queso, 30 grs. de manteca)
DIETA - HIPOPROTEICA
Leche 300 15 9 9
Queso semiduro 50 -- 25 24
Huevo 1 unidad -- 6 6
Carnes rojas 400 -- 80 20
A 200 9 2 --
B 200 20 2 --
Vegetales C 200 40 4 --
Frutas 400 60 4 --
Legumbres 50 30 10
Pan Negro 250 150 22 --
Azúcar 50 50 -- 40
Aceite 40 -- -- --
Caldo de Carne 250 -- -- 24
Extracto de carne 50 -- -- 40
374 164 99
Debe usar siempre carnes rojas, evitando las blancas (pollo o pescado). Una de las
porciones del día debe estar constituida por viseras (hígado, riñón, etc.). Preferir vegetales
de hoja. Utilizar frutas desecadas.
Desayuno:
150 grs. de leche con té, café o mate.
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan negro o galletitas integrales
1 porción de queso (50 grs.)
A media mañana:
1 huevo duro o pasado por agua almuerzo cena:
Almuerzo y cena:
1 plato de sopa preparado con caldo y legumbres enteras o sus harinas (ej.
arvejas secas, partidas; harina de lentejas o arvejas). Condimentar con
extracto de carne o tomates y queso rallado.
200 grs. de carne (de vaca o viseras) a la plancha, horno, parrilla.
300 grs. de verduras, especialmente de hojas.
1 porción de compota de frutas secas.
50 grs. de pan negro
Té o café.
Merienda:
Té o café o 1 gaseosa
Sándwich (100 grs. de pan negro – 50 grs. de queso)
Leche 300 15 9 9
Huevo 1 unidad -- 6 6
A 300 9 3 --
B 300 30 3 --
Vegetales C 200 40 4 --
Frutas 500 75 5 --
Pan 200 120 18 --
Azúcar 50 50 -- --
Dulce 80 64 -- --
Aceite 50 -- -- 60
Manteca 30 -- -- 24
403 48 99
Desayuno:
150 grs. de leche, con té, café o mate.
15 grs. de azúcar
50 grs. de pan
15 grs. manteca - 15 grs. de dulce
A media mañana:
1 fruta
Almuerzo y cena:
400 grs. de verduras (ensaladas hervidas, con aceite y sal, al horno, al vapor,
fritas, etc.) o 1 porción de cereal o pasta.
1/2 huevo (duro, cocido blando, en preparaciones)
1/2 cucharada de aceite
50 grs. de pan
1 fruta o 1 porción de dulce de batata o membrillo
Té o café
Merienda:
Té, café o gaseosa
Galletitas dulces (53 grs.)
Fundamento
El suero se desproteiniza con ácido túngstico preformado. El ácido úrico presente en el
aproteinizado reacciona con el reactivo fosfolitio túngstico en medio alcalino de carbonato de
sodio. El color del azul de tungsteno producido es proporcional a la concentración de ácido
úrico y se mide colorimétricamente a 710 mm.
Técnica en suero:
1). Desproteinización: En un tubo de centrífuga colocar 8 ml de agua destilada, 1 ml de
ácido túngstico y 1 ml de suero. Agitar vigorosamente esperar 5 minutos y centrifugar.
2). En tres tubos marcados B (blanco), T (testigo) y D (desconocido) colocar:
B T D
Desproteinizado -- -- 5 ml.
Agua destilada 5 ml. 5 ml. --
Testigo -- 0.05 ml. --
Reactivo 1 1 ml. 1 ml. 1 ml.
Reactivo 2 1 ml. 1 ml. 1 ml.
Mezclar por inversión y colocar en bario de agua entre 22º C y 28º C. Leer entre 30 y 45
minutos después en fotocolorímetro con filtro rojo o en espectrofotómetro a 710 mm.
Cálculos:
ácido úrico mg / 1 = D × f
Técnica en orina:
Se recoge orina de 24 horas y se diluye a 2 litros con agua. Efectuar la técnica de la misma
manera que en suero, reemplazando por 100 ml de dilución y completando a 5 ml con agua
destilada. Cálculos:
D
ácido úrico mg / 24 hs = × 1000
T
• Determinación de urea:
Fundamento:
La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y
amoníaco, este reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de
indofenol que se determina colorimétricamente a 540 mm.
Técnica en sangre:
En tres tubos marcados B (blanco), D (desconocido) y T (testigo); colocar una o dos gotas de
agua y agregar.
B T D
Testigo -- 20 ml. --
Suero o Plasma -- -- 20 ml.
Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota
0.60
urea gr / 1 = D ⋅ gr / 1
T
Técnica en orina:
Se sigue la misma técnica que para sangre, utilizando orina diluida cc agua o solución
fisiológica. Es conveniente diluir según el siguiente esquema.
(D − B de orina)
urea gr / 1 = × dilución
S
• Determinación de creatinina
Fundamento:
Se basa en la reacción de la creatinina con el picrato, alcalino, previa desproteinización con
el ácido pícrico. El cromógeno (picrato de creatinina) obtenido se lee a 510 mm.
Técnica en sangre:
a). Desproteinización: A 5 ml. de suero agregar 7,5 ml. de reactivo. Mezclar por inversión.
Dejar reposar 10 minutos y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mínimo.
b). En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (blanco) T (testigo) y D (desconocido)
colocar:
B T D
Sobrenadante -- -- 6.0 ml.
Testigo -- 1.0 ml. --
Agua 2.5 ml. 1.5 ml. --
Reactivo 1 3.5 ml. 3.5 ml. --
Reactivo 2 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml.
Mezclar por inversión, luego de 20 minutos leer en espectrofotómetro a 5/0 mm. Cálculos:
D
creatinina mg / 1 = × 20
T
Técnica de orina:
Se recoge orina de 24 horas y se diluye a 2 litros con agua. En tres tubos marcados B
(blanco), T (testigo) y D (desconocido).
B T D
Orina diluída -- -- 20 ml.
Testigo -- 1.0 ml. --
Agua 2.5 ml. 1.5 ml. 2.5 ml.
Reactivo 1 3.5 ml. 3.5 ml. 3.5 ml.
Reactivo 2 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml.
Calculos:
D
g / 24 hs. = ×2
T
Reactivos:
- Ureasa: solución estabilizado y tamponada de ureasa de alta proteína.
- Reactivo para urea: solución de 532 mmol/1 de fenol, 0.83 mmol/1 de nitro ferricianuro de
sodio y 0,3 mmol/1 de etilenebis-ditrocarbonato manganeso.
- Reactivo 2 para urea: solución de urea estabilizada equivale a 36.6 mmol/1 de hipoclorito
de sodio 0,625 mol/1 estabilizado.
- Testigo de urea: solución de urea estabilizada equivale a 0,60 g/1.
- Acido túngstico: desproteinizante concentrado y estabilizado de orina
- Reactivo 1 para ácido úrico: solución 1,84 mmol/1 de carbonato de sodio. Mezclar
siempre por inversión antes de usar.
- Reactivo 2 para ácido úrico: reactivo fosfo-litio-túngstico preparado con ácido fosfórico y
tungstato de sodio en relación molar 4:1. Contiene 291 mmol/1 sulfato de litio.
- Testigo de ácido úrico: solución estabilizada de ácido úrico.
- Reactivo 1 de creatinina: ácido pícrico 41,4 mmol. Estable indefinidamente a temperatura
ambiente.
- Reactivo 2 para creatinina: buffer glicina/NaOH 1 mol para pH final 12.4 estable
indefinidamente a temperatura ambiente.
- Testigo: solución de creatinina de 20 mg/1.
IV. INFORME
a). Comentar la influencia de la dieta en cada uno de los metabolitos estudiados.
b). Realizar un esquema de la formación de urea, creatinina y ácido úrico
TEMA XX: BIOSINTESIS DE CARBOHIDRATOS
Principales vías de la síntesis de carbohidratos. Formación de fosfoenol-piruvato a partir de
piruvato. Conversión de fosfoenol-piruvato a glucosa. Gluconeogénesis a partir de los
intermediarios del ciclo de Krebs, de la acetil CoA y de los aminoácidos.
--------------------------------------------
H2O
3.- El malato formado difunde al citoplasma donde es reoxidado por la forma citoplasmática de la
malato-deshidrogenasa ligada al NAD + para formar oxalacetato extramitocondrial.
Esta reacción es muy endergónica, se desplaza hacia la derecha porque los productos
finales se eliminan rápidamente.
Mg++
oxalacetato + GTP fosfoenol-piruvato + CO2 + GDP
Esta reacción global es reversible, puesto que su variación de energía libre estándar es muy
pequeña. Tenderá a desplazarse a la derecha siempre que el cociente (ATP) / (ADP) tenga un
valor elevado y que haya presente un exceso de piruvato. Para fosforilar una molécula de
piruvato se consumen dos enlaces de alto valor energético. Practicando le dirección energética
de la ecuación, se observa que el proceso endergónico que requiere energía es:
enolasa
fosfoenol-piruvato + H2O 2-fosfoglicerato
(1)
2-fosfoglicerato 3-fosfoglicerato
(2)
ATP + 3-fosfoglicerato ADP + 1,3-difosfoglicerato
(3)
1-3 difosfo-glicerato + NADH2 gliceraldehido-3-fosfato + NAD+ + Pi
(4)
gliceraldehído-3-P dihidroxiacetona-P
(5)
gliceraldehído-3-P + dihidroxiacetona-P fructosa-1-6-di P
Sin embargo la producción de glucosa libre es inducida por la glucosa -6-fosfatasa, que cataliza
la siguiente reacción exergónica de hidrólisis.
Resumiendo:
Por cada molécula de glucosa que se forme se consumen seis enlaces fosfato de alto valor
energético y se requiere dos moléculas de NADH2 como reductor.
La reacción global es exergónica.
glucógeno
UDP-glucosa
UTP
glucosa-1-P
glucosa-6-P
disacáridos
glucosa libre fructosa-6-P
monosacáridos
ATP Pi
Pi
fructosa-1-P
gliceraldehído-3-P
3-P-glicerato
2-P-glicerato
fosfoenolpiruvato
GTP
CO2
oxalacetato
malato
malato
oxalacetato
piruvato
piruvato
Gluconeogénesis a partir de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Dijimos anteriormente que la síntesis de glucosa podría tener varios precursores. Entre ellos los
principales son los productos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que pueden
experimentar oxidación a malato. Entonces el malato puede abandonar las mitocondrias y
experimentar su oxidación a oxalacetato en el citoplasma extramitocondrial; donde tiene lugar la
formación de fosfoenol-piruvato por la acción de la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa del
citoplasma. Tres átomos de carbono de los distintos intermediarios del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos se convierten, finalmente en tres átomos de carbono del fosfoenol-piruvato. Estos
carbonos proceden de los átomos alfa-carboxílicos (alfa-carboxilicos) y beta del oxalacetato.
Acido oxalacético.
COOH
β CH2
C O
α COOH
Gluconeogénesis a partir de acetil CoA: en los tejidos de los animales superiores no hay
formación neta de nueva glucosa a partir de los dos átomos de carbono del grupo acetilo del
acetil CoA. Lo que sí sucede es que la condensación de la acetil CoA con el oxalacetato de
citrato que al oxidarse para dar fosfoenol-piruvato pierde 3 átomos de C en forma de CO 2 . Se
deduce que no puede formar más glucosa que el oxalacetato. En los tejidos animales la acetil
CoA no puede convertirse directamente en piruvato o en succinato. En los animales superiores
no existe senda metabólica alguna por lo que los átomos de carbono de los ácidos grasos
puedan ser utilizados para producir nueva glucosa.
Gluconeogénesis a partir de los aminoácidos: Como se ha visto, algunos o todos los átomos
de carbono de los distintos aminoácidos derivados de proteínas son finalmente convertibles en
acetil CoA o en intermediarios del ciclo de Krebs. Aquellos aminoácidos que pueden servir de
precursores del fosfoenol-piruvato y por consiguiente de la glucosa son aminoácidos
glucogénicos. Ej: alanina, arginina, glicina, histidina, valina, prolina, etc. Los aminoácidos que por
degradación son capaces de formar acetoacetato se los denomina cetógenos. Ej.: leucina. La
fenilalanina y la tirosina constituyen ejemplos de aminoácidos que a la vez son glucogénicos y
cetogénicos puesto que por degradación se escinden para formar ácido fumárico (glucogénico) y
acetil CoA (cetogénico).
TEMA XXI: BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS
Biosíntesis de ácidos grasos saturados. Formación de malonil CoA. Pasos en la síntesis de
ácidos grasos. Prolongación de los ácidos grasos saturados en la mitocondria y los microsomas.
Biosíntesis de triacil-gliceroles. Biosíntesis de colesterol.
-----------------------------------------------
La ruta biosintética que conduce desde la glucosa a los ácidos grasos es importante en la
mayoría de los organismos. Puesto que la capacidad de los animales superiores para almacenar
polisacáridos es bastantes limitada la glucosa ingerida en exceso, respecto a las necesidades
calóricas inmediatas y a la capacidad de almacenaje, se convierte en ácidos grasos, y éstos a su
vez, en triacilgliceroles que pueden almacenarse en grandes cantidades en el tejido adiposo.
Constituye otro proceso importante la biosíntesis de fosfoglicéridos de las membranas, puesto
que la mayoría de las células experimentan un recambio relativamente veloz. También se verá la
biosíntesis de colesterol. Aunque desde el punto de vista cuantitativo se trata de una vía
secundaria, el gran número de esteroles, biológicamente activos, que derivan del colesterol le
confiere considerable importancia.
Malonil transferasa
Acil transferasa
Palmitil
transferasa
Enzima condensante
(β citonil sintetasa)
Deshidrogenasa
(2º reducción) SH (resto fosfopantotenil
con grupo SH terminal que
enlaza los intermediarios
acílicos)
Deshidrogenasa
Deshidratasa (1º reducción)
SH
El CO2 se convierte en el carbono carboxílico libre distal de la malonil CoA. Los grupos acilos
de la acetil-CoA y de la malonil CoA son transferidos al grupo tiol de la ACP por acción de dos
enzimas acil-transferasa y malonil-transferasa.
O O
acil
SH + CH3 C SCoA S C CH3 + HSCoA
transferasa
SH SH
O O O
malonil
S C CH3 + COOH CH2 C SCoA S C CH3 + HSCoA
transferasa
SH S
C O
CH2
COO H
Acetil-S-ACP y malonil-S-ACP reaccionan entre sí de manera que el grupo acetilo del primero
pasa a formar los carbonos 3 y 4 del grupos acetoacetilico, con desplazamiento del CO 2 .
SH + CO2
condensante
S
C O
CH2
C O
CH3
La acetoacetil-S-ACP se reduce por acción del NADPH.
SH SH SH
SH S
C O
acil
transferasa CH2
S
CH2
C O
SH CH3
CH2
CH2
CH3
butiril-S-ACP
La formación de butiril-S-ACP completa el primer ciclo, el cual se repite seis veces más en el
cual una molécula de malonil-S-CoA se incorpora a la ACP para dar malonil-S-ACP la cual
experimenta pérdida de CO 2 y condensación con el acilo graso que se encuentra en el otro
brazo. De esta manera el producto es el ácido palmítico de 16 átomos de carbono. Al final del
ciclo se libera la ACP por la acción de una desacilasa hidrolítica.
ácido palmitico
SH
Aunque la mayoría de los organismos tienen capacidad para formar ácido palmitoleico y ácido
oleico, la ruta y el mecanismo utilizado dependen si el organismo es anaerobio o aerobio.
En los organismo aerobios los dobles enlaces son introducidos por una oxigenasa específica
localizada en la fracción microsómica, especialmente del hígado y del tejido adiposo.
No se conocen los detalles completos del mecanismo enzimático, pero se sabe que se utiliza la
molécula de oxígeno como aceptor de dos pares de electrones, uno de los cuales procede del
sustrato acil-CoA y el otro del NADPH, que se requiere en la reacción.
1 par 1 par
Los cuales sufren ulterior alargamiento y/o desaturización. Los ácidos linoleicos y linolénicos no
pueden ser sintetizados por los mamiferos quienes tienen que tomarlos de fuentes vegetales; por
esta razón se denominan ácidos grasos esenciales.
BIOSINTESIS DE TRIACIL GLICEROLES (TAG)
Los TAG, que actúan como lípidos de depósito o de almacenamiento, son activamente
sintetizados por las células hepáticas y adiposas de los mamiferos. Para la síntesis se requieren
dos precursores principales:
1.- Glicerol 3-fosfato
2.- Acil CoA graso
El glicerol 3-fosfato procede de dos fuentes:
1.- Dihidroxiacetona-fosfato que se produce en la glicólisis.
ETAPAS DE LA BIOSINTESIS
- Primera etapa: Acilación de los grupos oxidrilos libres del glicerol-3-fosfato por dos
moléculas de acil-CoA graso, produciendo un ácido fosfatídico.
O
CH2 O C R
CH2 OH
O O
+ 2 R C S CoA CH O C R' + 2 HSCoA
CH OH
CH2 O PO 3H2
CH2 O PO 3H2
- Segunda etapa: El ácido fosfatídico experimenta una hidrólisis por acción de una fosfatasa
específica formando diacilglicérido.
O O
CH2 O C R CH2 O C R
O O
CH O C R' + H2O CH O C R' + Pi
- Tercera etapa: El diacilglicérido reacciona con una molécula de acil-graso CoA dando
triacilglicerol.
O O
CH2 O C R CH2 O C R'
O O O
CH O C R' + R'' C S CoA CH O C R'' + HSCoA
O
CH2 OH CH2 O C R'''
BIOSINTESIS DE FOSFOGLICERIDOS
Los principales fosfoglicéridos que sirven como componentes de las membranas y las
lipoproteínas de transporte se forman por ramificaciones de la ruta biosintética a partir del ácido
fosfatídico. Además intervienen los nucleótidos citidínicos. Todas estas reacciones tienen lugar
en el retículo endoplásmico.
El ácido fosfatídico con el CTP se convierte en citidín-difosfato-diacilglicérido que es el precursor
común de todos los fosfoglicéridos formados por ésta ruta.
Su porción CMP puede considerarse la portadora del ácido fosfatídico. En las reacciones
subsiguientes, cada una de las cuales es catalizada por una enzima específica la porción CMP
es desplazada por los alcoholes: serina, inositol, fosfato de glicerilo.
O
CH2 O C R
O
CH O C R'
CH2
HO P O
HO P O
CH2 O citosina
H H
H
OH OH
CTP
CO2 Pi
Fosfatidil-etanolamina Fosfatidil-glicerina
3 CH3- + CDP-diacilglicérido
Cardiolipina
Fosfatidil-colina
BIOSINTESIS DE COLESTEROL
NADPH2
β hidroxi - β metil - glutaril CoA ácido mevalónico + NADP + HSCoA
CH3 OH OH
COO H CH2 C CH2 CH2 O P O P OH
O O
O
HO P OH
O
El compuesto es muy inestable pierde H3PO 4 y se descarboxila dando isopentenil-
pirofosfato que se isomeriza y dá el 3-3'-dimetil-alil-pirofosfato.
CH2
OH OH
C CH2 CH2 O P O P OH
O O
CH3
CH3
OH OH
C CH CH2 O P O P OH
O O
CH3
- PPi
seranil-pirofosfato + isopentenil pirofosfato farnesil pirofosfato
La biosíntesis de los aminoácidos a partir de precursores sencillos, es vital para todas las formas
de vida, puesto que los aminoácidos son los precursores de las proteínas. Sin embargo los
organismos vivos difieren considerablemente en lo que se refiere a las formas de N 2 que son
capaces de utilizar con dicha finalidad.
Los animales superiores pueden utilizar NH3 como fuente de N 2 para la síntesis de aminoácidos
no indispensables, pero son incapaces de utilizar, nitritos y nitratos ó N 2 . Los rumiantes pueden
utilizar los nitritos y nitratos pero solo después que las bacterias de su panza los reducen a NH3 .
Las plantas superiores pueden producir todos los aminoácidos requeridos para la síntesis de
proteínas, a partir tanto de NH3 como de nitratos , como fuentes de N 2 . Pueden utilizar el NH3
como tal o después de su oxidación a nitrato por acción de las bacterias del suelo. Las
leguminosas son capaces de fijar N 2 atmosférico como NH3 por acción de las bacterias que se
encuentran en sus nódulos radicícolas.
Los microorganismos difieren ampliamente en cuanto a su capacidad de efectuar síntesis de
aminoácidos. Algunos no pueden crecer si no se le suministran algunos aminoácidos ya
formados. Otros como E.Coli pueden obtener todos sus aminoácidos a partir de NH3 .
Los veinte aminoácidos se sintetizan gracias a unas secuencias polienzimáticas, algunas de las
cuales son extremadamente complejas como es el caso en las mayoría de las vías biosintéticas,
las sendas de las síntesis aminoácidas son, en su mayor parte, diferentes a las seguidas en sus
degradaciones.
Por una parte los aminoácidos sirven no sólo como bloques de montajes en la síntesis de
proteínas sino también como precursores de muchas biomoléculas que poseen gran variedad de
funciones especializadas. Es frecuente que las rutas de síntesis y degradaciones aminoácidas
incluyan ciertas ramificaciones o extensiones conducentes a la formación de tales productos
especializados.
Ya hemos visto que las formas biológicas de N 2 disponibles son relativamente escasas en los
ambientes inanimados, porque el proceso de fijación de N 2 atmosférico está circunscrito a unos
pocos organismos. Por esa razón la mayoría de los organismos vivos, tienen que observar una
estricta economía en el empleo metabólico de las formas reducidas de N 2 . Nos encontramos así
con ejemplos donde los grupos NH 2 o los productos nitrogenados intermedios, son recuperados
y reutilizados para la síntesis de aminoácidos. Veremos también que la biosíntesis de la mayoría
de los aminoácidos funcionan bajo una regulación y un retrocontrol (feedback) constante gracias
a la acción de enzimas reguladoras.
Además las propias síntesis de las enzimas que catalizan la formación de los aminoácidos se
hallan también bajo control, tales síntesis pueden resultar reprimidas, si la célula dispone de un
suministro exógeno de aminoácido. Ambas formas de regulación constituyen el reflejo de una
intrínseca economía celular que prevalece en la síntesis y en la utilización de los aminoácidos.
Esta reacción es bastante compleja e implica dos o más etapas intermedias. Se ha observado
que el γ ~glutamil fosfato actúa como intermediario de alta energía ligado a la enzima.
O OH
C O P OH
CH2 O
CH2
ácido γ−glutamil-fosfórico
H C NH2
COOH
La prolina se sintetiza a partir de ácido glutámico por inversión de la ruta metabólica, antes
descrita para la oxidación de la prolina.
NH2
O
H2C CH2
inhibición
H
HC C Acido ∆1~pirrolín
N COOH 5 carboxílico
H2C CH2
H
H2C C
N COOH
H
Prolina
ALANINA
O NH2 NH2 O
CH3 C COOH + HOOC CH2 CH2 C COOH CH3 C COOH + HOOC CH2 CH2 C COOH
H H
Acido pirúvico Acido glutámico Alanina Acido oxoglutárico
ACIDO ASPARTICO
O NH2
HOOC CH2 C COOH + Acido glutámico HOOC CH2 C COOH + Acido β-oxoglutámico
Acido oxalacético H
Acido Aspártico
En algunas plantas estos dos compuestos se producen por Afinación reductora. El ácido
aspártico es el precursor directo de la asparagina. En muchos organismos ésta se forma por una
reacción similar a la catalizada por la glutamin-sintetasa.
NH2 NH2
NH2
HOOC CH2 C COOH + NH3 + ATP C CH2 C COOH + ADP + Pi
H O H
Acido Aspártico Asparagina
TIROSINA
Aunque la Tirosina es un aminoácido no indispensable, su síntesis requiere el aminoácido
esencial feniIalalina, como precursor. La tirosina se forma a partir de la fenilalanina por una
reacción de hidroxilación catalizada por la fenil-alanin-hidroxilasa. La cual como hemos visto
participa de la degradación de la fenilalanina.
O OH
H
NAD+ C CH2 OH
COOH ATP ADP C O P OH NADH NADH NAD+
O
CH2 CH2
CH2 CH2 O
apartil H C NH2 H C NH2
H C NH2 quinasa H C NH2
COOH COOH
COOH COOH
Acido aspartil Semialdehído Homoserina
aspártico fosfato aspártico
OH CH2
ATP ADP H+
CH2 O P OH - Pi CH
CH2 O C N CH ENZ.
Complejo enzimático
C N CH ENZ. -homoserin-fosfato COOH
COOH
Se cree que la secuencia completa tiene lugar con el grupo α − NH 2 del sustrato unido al grupo
aldehído del fosfato de piridoxal de la enzima como una base de Schiff, en éste complejo el
átomo de H 2 α es lábil. El producto final de la secuencia, la treonina, es un inhibidor modulador
de la primera enzima del sistema que es la enzima regulador aspartil-quinasa.
METIONINA
La conversión de la homoserina en metionina comienza con la formación enzimática de la
O~succinil homoserina por transferencia de un grupo succinilo del succinil-CoA. En la reacción
siguiente se forma cistationina a partir de la O succinil-homoserina y de la Cisteína la cual, a su
vez escinde, para dar homocisteína ácido pirúvico y NH3 . La Cisitationina puede experimentar
dos tipos de escisión, uno a cada uno de los lados del átomo de azufre, así puede servir como
intermediario de la conversión de Metionina en Cisteína en los mamíferos y de la transformación
de Cisteína en Metionina en las plantas y bacterias.
O
CH2 OH Succinil CoA CH2 O C CH2 S CH
Cisteína
CH2 CH2 CH2 CH2 H C NH2
H C NH2 H C NH2 CH2 H C NH2 COOH
COOH COOH COOH COOH
CH3
SH S
CH2 CH2
Piruvato DA ~ Cobalanina
CH2 CH2
N5 ~ Metil
+ NH2 H C NH2 H C NH2
tetrahidroflorato
COOH COOH
Homocisteina Metionina
La metilación de la Homocisteína a Metionina en E. Coli tiene lugar por transferencia del grupo
Metilo de N5 ~ metil tetrahicrofolato .
D. A. ~ Co
N5 metil tetrahidrofolato + homocisteína tetrahidrofolato + metionina
balamina
La biosíntesis de las Porfirinas cuyo principal precursor es la Glicina requiere especial atención
por la importancia central del núcleo porfirínico en la función de la hemoglobina, de los
citocromos y de la clorofila. Los tetrapirroles se construyen a partir de cuatro moléculas del
derivado monopirrólico Porfobilinógeno, que a su vez se sintetiza según las siguientes etapas:
HSCoA COOH
CH2 CH2 NH2 CH2 CH2
+
CH2 COOH CH2 CH2
C S CoA C O C O
Glicina
O
H C NH2 CH2
Succinil~CoA
COO H NH2
Acido δ−amino
Acido α−amino levulínico
oxoadípico
En la primera reacción la glicina reacciona con el succinil-CoA para dar ácido α -amino β
oxoadípico quien luego se descarboxila para dar ácido amino-levulínico reacción que es
catalizada por la δ amino~levulínico~sintetasa; enzima que requiere fosfato de piridoxal y se
encuentra en el retículo endoplásmico de las células hepáticas. Luego dos moléculas de amino-
levulínico se condensan para formar porfobilinógeno bajo la acción de la δ aminolevulínico
deshidrasa.
COOH COOH
HOOC CH2 COOH
CH2 CH2
2 H2O CH2 CH2
H C H + CH2
C C
C O C O
CH2 C C H
CH2 H C H N
NH2
NH2 N H H
Porfobilinógeno
H
Como precursores. de la Protoporfirina actúan cuatro moléculas de porfobilinógeno, a través de
una serie compleja de reacciones, la primera de las cuales la cataliza la
porfobilinógeno~desaminasa. Algunas de las etapas de la serie permanecen aún oscuras. El
hierro no se incorpora hasta que se ha completado la molécula de la protoporfirina. Esta
incorporación requiere una enzima, la hemo-sintetasa o Ferroquelatasa que está localizada en
las mitocondrias.
CH3 CH CH2
C C
HOOC CH2 COOH
CH C C CH
CH2 CH2
H
CH3 C C C C CH3
C C
N H H N
CH2 C C H
N CH2 C C C C CH CH2
NH2 CH2 H
H HC C C CH
COOH
Porfobilinógeno
C C
CH2 CH3
CH2
COOH
Protoporfirina IX
Biosíntesis de nucleótidos purínicos: origen biosintético de los átomos del anillo purínico.
Proviene de los experimentos realizados por Buchanan quién administró a animales precursores
marcados y luego determinó los sitios del núcleo purínico a los que se habían incorporado los
átomos marcados. Esta experiencia se realizó en aves, que excretan el N 2 en forma de ácido
úrico que es un derivado de las purinas.
Ácido úrico:
CO2
7 Glicina
C N
6
Aspartato N C
1 5
C Formiato
8
Formiato C C
2 4
N N
3 9
amida de la glutamina
N9
NH2 de la glutamina glicina
ATP
amidotransferasa
ADP + P
NH2
PP ácido glutámico
R P
O fosforibosilamina
P P O CH2 OH
H H
H H
OH OH
fosforibosilpirofisfato (FRPP)
C4 y C5 N7
C8
NH2 NH
CH "CHO" CH2 glutamina
CHO
CoF ácido glutamínico
C C
NH NH
O O
R P R P
N3 O C6
N1
N C N
CH CO2 NH2 CH "CHO"
CH CH
C Acidoc aspártico CoF
NH2 N NH2 N
R P R P
C2
O
C N
NH
CH
CH
N N
R P
Inosina 5' - fosfato
Acido Inosínico IMP
Vías del ácido inosínico hacia los ácidos adenínico y guanílico
H N N
IMP (H+ inosínico)
N N
R P
NAD aspartato
[O]
NADH2 GTP GDP + Pi
O H
N N H N N
O
H R P
N N aspartato
AMP
glutamina H+ glutámico
R P
O
NH2
H N N
H N N
N N
NH2
N N
R P
R P
En este caso el exceso de ATP, ADP o ME o de GTP, GDP o GMP producen una inhibición a
nivel de la enzima que cataliza la reacción entre el fosforibosilpirofosfato y la 5 fosforibosilamina,
por lo tanto se frena la secuencia metabólica y se inhibe la biosíntesis. Es un caso de
retroalimentación negativa.
C
H N C H
C C COOH
O N
ácido orótico
H2O
carbamil PO≡4
Acido Aspártico Acido Carbamil Aspártico
PO≡4 Dihidrotasa
NAD PRPP PP
Acido Dihidrótico Acido Orótico Acido Orotidílico
NADH2 fosforibosil- OMP
transferasa
CO2
Acido Uridílico
OMP
descarboxilasa UMP (uridin monofosfato)
O NH2
C C
H N C H ATP ADP + Pi N C H
+ NH3
C C H C C H
O N O N
R P P P R P P P
En Escherichia Coli (bacteria) el que dona el grupo NH 2 es el NH3 libre. En los mamíferos es el
grupo amido de la glutamina.
UMP
UTP
CTP
O O
C C
N5; N10.Metilen FH2
H N C H H N C CH3
Tetrahidrofolato Dihidrofolato
C C H C C H
O N O N
Reacciones fosfotransferásicas:
Los precursores del ADN (ácido desoxiribonucléico) son desoxi-ribonucleótidos. Los precursores
del ARN (ácido ribonucléico) son ribonucléotidos.
TEMA XXIV: NATURALEZA, ESTRUCTURA Y APLICACION DEL MATERIAL GENETICO
Evidencias de que el ADN es el material genético. Estructura del ADN: Ley de Chargaff, estudios
de difracción con rayos X. Modelo de Watson y Crich. El dogma central de la Biología Molecular.
Replicación del ADN: replicación semiconservativa.
--------------------------------------------
A-T y G-C
N N
núcleo de núcleo de
AyG TyC
N N N
Si el par sería A - G serían demasiado grandes para poder encajar dentro de la doble hélice de
estas dimensiones.
Si la pareja fuera G - T las bases se encontrarían muy distanciadas para poder formar enlaces
hidrógeno estables.
A T
A T
G C
A T
T A
C G
A T
G C
Además los enlaces hidrógeno entre A – G y C – T son más débiles que A – T y G – C, o sea
que la doble hélice implica aquellas parejas que poseen el máximo de estabilidad. ¿Por que las
dos periodicidades observadas con los rayos X?. Se postuló que la periodicidad de 3,4 Å se
debe a que las bases están apretadamente apiladas al eje y mantienen una distancia de 3,4 Å
de centro a centro. En cada espira de la hélice hay 10 nucleótidos y de una espira a otra hay 34
Å.
Las bases hidrófobas están en el interior de la hélice, los restos carbohidratos y los fosfatos que
poseen carga eléctrica están expuestas al H 2 O . Así resulta que la doble hélice está estabilizada
no sólo por los puentes hidrógeno entre les bases complementarias sino también por
interacciones hidrofóbicas entre dichas bases apiladas. Las dos cadenas polinucleótidas de la
doble hélice no son idénticas ni en la composición ni en la secuencia de bases. Ambas cadenas
son complementarias una de la otra. Esta estructura conduce a un mecanismo por medio del
cual la información genética puede replicarse con precisión. Dado que las dos hebras son
complementarias una de la otra, y contienen información genética complementaria, se postuló
que durante la división celular la réplica del ADN podría ocurrir por separación de las dos hebras,
con lo que cada una haría de patrón especificador de la secuencia de bases de una nueva
hebra complementaria sintetizada. EI resultado final de este proceso consistiría en la formación
de dos moléculas hijas de un ADN de doble hélice, cada una de las cuales contendría una de las
hebras del progenitor. (Ver ilustración página 681 de Lenhinger).
O sea que éste dogma definió tres procesos fundamentales de los cuales el primero es el de
REPLICA, es decir la "copia" del ADN con formación de moléculas hijas. Veremos como sucede
éste proceso a nivel molecular. La característica más sorprendente de la hipótesis de Watson y
Crick, desde el punto de vista genético, en su postulado de que las dos hebras del ADN
duplohelicoidales son complementarias.
La réplica de cada una de ellas conduce a dos moléculas hijas de ADN; cada una contiene las
hebras del ADN progenitor. Este proceso se denomina réplica semiconservadora.
Pero ¿Cómo pueden replicarse simultáneamente las dos hebras del ADN de modo que se
formen al mismo tiempo?. Éste mecanismo requiere tres enzimas:
- ADN - polimerasa dependiente del ADN
- ADN - ligasa
- Endodesoxiribonucleasa
ADN - polimerasa
Cataliza la síntesis de enlaces internucleótidos. Posee los siguientes requerimientos:
1). presencia da ADN preformado
2). presencia de los cuatro desoxiribonucleótidos trifosforados, los mono y dífosforados son
inactivos.
3). Mg++
2. 0 bien podría ser utilizado como patrón sobre el cual la enzima podría construir una hebra
complementaria al ADN preformado.
ADN
|
nd ATP d AMP
nd GTP ADN preformado |
d GMP + 4 PPi
nd CTP Mg++ |
nd TTP d CMP
|
d TMP
Teniendo en cuenta estos requerimientos la reacción global sería así.
OH
HO P H2C
O Base
O
H H
H
O H
O Base
HO P O
H H
H
H2C
OH + PPi
O O H
Base
H H O P OH
H
OH H PPi H2C
OH
O Base
O O P
H H
H
O P O P O P OH
OH H
OH OH OH
H2C
O Base
H H
H OH
OH H
Hay un ataque al átomo de fósforo alfa del nucleótido trifosforado entrante y provoca el
desplazamiento de su crudo pirofosfato, con formación de enlace internucleótido. El PPi formado
es rápidamente hidrolizado por una pirofosfatasa por lo cual la reacción es muy exergónica. La
dirección de la síntesis es por lo tanto 5’ --- 3'.
ADN ligasa
1. Enlaza extremos de moléculas de ADN produciendo formas circulares. Ej.: bacterias.
2. Cataliza la reparación de roturas de una cadena de ADN.
O
NMN
Dinucleótido
Base CH2 O P OH NAD constituído
NMN y AMP
5' AMP
OH
H OH
3'
H
Base O
OH
O O
OH OH Adenina HO P O
O
OH
Base O
Base O
Mecanismo de replicación
Antes de hablar de la replicación es importante acotar que la cadena de ADN recién sintetizada
se prolonga en dirección opuesta a la cadena de ADN patrón, es decir, tiene una polaridad
opuesta o antiparalela.
P 3'
A
T T
5' 3' 5'
cebadora 3' P
P 3' 5' 3'
5'
T A
T
3'
P
P
Kornberg: postuló que la réplica comienza con la producción de una mella o una rotura en una
hebra por acción de una endonucleasa. Unidades de MN adicionadas por la ADN polimerasa:
5'
5'
La ADN polimerasa se fija a dicha rotura y comienza a prolongar el extremo 3' unidades de
mononucléotidos (MN). (–)
El extremo 5' se desplaza de la estructura duplex. Se sugiere que el extremo 5' puede estar
sujeto por adherencia a la membrana celular. La réplica continua durante cierto trecho mientras
que el extremo 5' se va "pelando". La ADN polimerasa se desplaza de lugar, o salta, desde la
hebra patrón intacta a la hebra mellada en el sitio donde se separan ambas hebras y comienza a
adicionar unidades de mononucleótidos utilizando como patrón la fibra mellada. La replicación
continúa hasta que el extremo se ha replicado por completo y entonces la enzima se retira.
La endonucleasa rompe en la horquilla la hebra formada y el proceso vuelve a repetirse con la
ADN polimerasa, que adiciona nuevas unidades de mononucleótidos. Los dos nuevos
segmentos formados sobre la hebra patrón son unidos por la ADN ligasa y comienza un nuevo
ciclo.
-------------------------------------------------
σ σ
La ARN polimerasa se une reversiblemente al ADN en varios sitios de éste. Sin embargo
cuando esta unión se hace en una región especifica que es el gen promotor el factor σ
reconoce la secuencia nucleotídica y estabiliza el complejo ADN-ARN polimerasa.
Esta estabilización permite que la enzima inicie la separación de las hebras de la doble hélice
del ADN permitiendo la iniciación de la trascripción.
B. Inicio de la trascripción
A T C T G A G A C T A T C T G A G A C T
T A G A T A G A
G T G T
A A
C T C C T C
G σ G A σ
3'
P P P OH P P P OH
OH
P
5'
P
A T C T G A G A C T
T A G A
G T
Se forma el primer enlace
internucleótido A
C T C
G A σ
P P P P OH + P P
5'
Una vez unida la enzima a un promotor en el ADN, se inicia la transcripción por unión de dos
nucleótidos trifosforados a la enzima. En general todos los ARN comienzan a sintetizarse por
ATP y GTP. Al tomar posición los dos primeros sustratos, el OH − 3' del nucleótido trifosforado
iniciador ataca el enlace fosfodiéster entre los fosfatos alfa y beta del segundo nucleótido y se
forma el primer enlace internucléotido.
T A G A
G T
A La enzima se desplaza
por la hebra del ADN
C T C
G A G A
P P P P P P OH
σ
Cuando el producto de la elongación llega a un tamaño critico el factor σ se libera.
Las cadenas nucleotídicas crecen por adición secuencial de ribonucleótidos al extremo 3' del
dinucleótido iniciador.
La entrada de los diferentes sustratos depende de la complementariedad con las bases de la
hebra del ADN que sirve de matriz.
Terminación de la transcripción:
1.
secuencia terminadora
reconocida por la enzima
2.
factor ρ de terminación
ρ (Ro)
---------------------------------------------
Mediante consideraciones matemáticas, parecía probable que cada aminoácido fuera codificada
por un número pequeño de nucleótidos consecutivos de la cadena ADN. Puesto que el ADN
contiene sólo cuatro bases y las proteínas contienen veinte aminoácidos, es obvio que se
requiere más de un nucleótido para codificar cada aminoácido. Si se disponen los nucleótidos en
grupos de dos, rinden 4 2 = 16 combinaciones. Las 4 bases en combinaciones de 3, pueden
codificar 4 3 = 64 aminoácidos distintos. O sea que un código de tripletes es utilizado para
codificar aminoácidos.
Composición de los Tripletes: los experimentos que se realizaron para conocer la composición
de los tripletes fueron utilizando polirribonucleótidos sintéticos como mensajeros de ribosomas
aislados de E. Coli. Incubaron ácido uridílico (poli - U) en una serie de tubos que contenían
ribosomas de E. Coli privados de mensajero, además de todo lo necesario para la síntesis
proteica, incluyendo todos los aminoácidos. Este estudio demostró que la cadena polipeptídica
recién formada contenía solamente fenilalanina. En consecuencia, sugirieron que el vocablo del
código para la fenilalanina era el triplete UUU.
Por experimentos similares hallaron que el poli C codifica prolina, el poli A lisina, etc.
Posteriormente prepararon polímeros de nucleótidos variando la relación cuantitativa de los
distintos mononucleótidos que permitió identificar la composición de 50 vocablos del código para
los distintos aminoácidos. Estos experimentos no sólo permitieron establecer como se "deletrea"
el vocablo del código de cada aminoácido, sino que permitieron comprobar que algunos
aminoácidos eran codificados por más de un triplete.
Por ejemplo:
fenilalanina es cofificada por UUU − UUC −
------------------------------------------------------
Vamos a considerar ahora la tercera gran cuestión que plantea la continuidad genética de los
organismos vivos.
¿Cómo se traslada la información genética contenida en la secuencia nucleótida del ARNm , de
tal suerte que los aminoácidos se engarcen formando una cadena polipeptídica con una
secuencia aminoácida específica?
Trataremos los mecanismos enzimáticos por medio de los cuales se constituye la cadena
polipeptídica, es decir como se realiza la síntesis proteica. Además veremos el funcionamiento
de los ribosomas asegurando la adecuada transferencia de la información del ARNm , y el papel
adaptador del ARN t .
A
| Locus de enlace aminoácido
C
|
G C
Mg++
ATP + AA ácido amino acil adenílico + PPi
O
H O
P O P O P O CH2
O
R C C OH +
OH
NH2 Adenina
H O O
R C C O P O CH2 + PPi
O Adenina
NH2 OH
Segunda fase de activación: consiste en la transferencia del grupo aminoacilo del AMP al
ARN t :
30 S
LP LA
50 S
1. El locus peptidílico: (LP) para el ARN t que tiene unido el AA iniciador de la síntesis
que es la metionina la cual tiene su grupo amino bloqueado por un grupo formilo con
el objeto.
a. que el grupo amino no forme enlace peptídico.
El ribosoma para que puedan unirse el ARNm y el ARN t − AA debe disociarse en sus dos
subunidades. Participan en este proceso factores proteicos F1 F2 F3 (llamados también
disociasaribosomal) y GTP. Estos factores permiten la disociación de los ribosomas y
además la unión del ARNm en el lugar donde se inicia el mensaje.
30 S 30 S 30 S
50 S
AA AA
50 S
LP LA
(metionina) AA AA
2.- En la segunda fase se forma el enlace peptídico por reacción entre el grupo amino del
nuevo aminoacil - ARN t captado con el grupo carboxilo del AA ya existente en el LP.
NH NH
R CH
R CH
C O LP HO LP descargado
O C
O
NH
NH2
R C H
R CH
C O
C O LA LA
O O
ARNm
Para la formación del nuevo enlace peptídico es necesaria una enzima denominada
peptidil-transferasa. El ARN t "descargado" que ya no lleva su AA, continúa unido al LP.
El peptidil ARN t recién alargado está unido al LA.
3.- En la tercera fase del ciclo de alargamiento el peptidil - ARN t se desplaza físicamente
desde el LA al LP y desaloja de este último al sitio del ARN t “descargado”. Esta
compleja reacción de translocación se cree que es resultado de un cambio de
conformación en el ribosoma, que tiene lugar a costa de la hidrólisis del GTP. Para esta
fase se requiere una proteína especifica denominada factor G. Simultáneamente con la
translocación del peptidil - ARN t tiene lugar la del ARNm que desplaza un codón a lo
largo del ribosoma.
O CH
NH
R C H
C O LP
O
LA
------------------------------------------------------
Las células vivas disponen de mecanismos que regulan la cantidad de proteínas que se
sintetizan.
Estos mecanismos de regulación fueron estudiados en células bacterianas y se observó que la
cantidad de enzimas que se acumula en el medio depende de la naturaleza de los nutrientes. En
base a todos estos estudios se distinguió dos tipos de respuestas:
1. De inducción enzimática
2. De represión enzimática
INDUCCION
Si estamos en presencia de una inducción a la enzima que se induce a que se sintetice se
denomina enzima inducible. Esta enzima inducible se encuentra en pequeña cantidad en el
medio, pero cuando se agrega un sustrato sobre el cual debe actuar su concentración aumenta
para transformar a ese sustrato en un metabolito que puede ser utilizado por la célula. Ej.: un
tipo de E. coli usa como fuente de carbono a la glucosa. Si en el medio en lugar de colocar
glucosa colocamos lactosa, la célula inmediatamente comienza a sintetizar β -galactosidasa que
desdobla la lactosa en galactosa y glucosa. Si volvemos a colocar glucosa, la enzima β -
galactosidasa deja de sintetizarse y alcanza un nivel bajo. La mayoría de las enzimas inducibles
catalizan las reacciones del catabolismo. Estas enzimas inducibles son diferentes a las enzimas
constitutivas que se forman a velocidades constantes independientemente de la presencia del
sustrato (por ej. las enzimas de la glicólisis).
REPRESIÓN ENZIMATICA
La célula tiene enzimas requeridas para la síntesis de los 20 aminoácidos. Si agregamos al
medio un aminoácido, por ej. histidina, la enzima que le sintetizaba es reprimida y desaparece de
la célula. Todas las enzimas inducibles están codificadas por genes. En los genes hay locus que
determinan la formación de las enzimas. Un locus se denomina gen estructural, que es el que
determina la secuencia de aminoácidos de la enzima. El otro locus, llamado gen regulador, es
interruptor, es decir que está determinando si el gen estructural se transcribe o no. O sea que el
gen estructural codifica una enzima que se sintetiza normalmente siempre que el gen regulador
no reprima su síntesis.
Regulador
Estructural
¿ Cómo funciona el gen regulador tanto en la represión como en la inducción?
Jacob y Monod formularon una hipótesis general respecto a la función de los genes estructural y
regulador) en los 2 procesos.
- Inducción: el gen regulador transcribe un ARN mensajero que codifica una proteína
denominada represor.
ARNm
regulador
operador
estructural
Este represor tiene un locus de unión específico próximo al gen estructural. Este locus se
denomina operador.
¿Qué sucede en una inducción, es decir cuando se agrega al medio un sustrato que debe
degradarse?. El sustrato, que sería el inductor, se combina con el represor formando un
complejo inductor-represor inactivo, que no puede unirse al operador.
represor
inductor
El gen estructural queda libre y comienza a transcribirse y por lo tanto se sintetiza la enzima.
La unión represor-inductor es reversible, o sea que cuando se elimina el inductor la síntesis
de la enzima que lo degrada es reprimida.
ARNm
regulador
operador
estructural represor
En este caso, la histidina se une al represor y forma un complejo represor-correpresor que se
combina al operador; el gen estructural no se transcribe y por lo tanto no se sintetiza
histidina.
operador z x a b
Este grupo de genes relacionados constituyen un operón; o sea que el operón se encuentra
codificando todas las enzimas que participan en la biosíntesis de histidina.
2. DEULAFEU, V. y MARENZI, A.D. “Curso de química biológica” El Ateneo. Bs. As. 1972.
6. VILLANUEVA, J.R. “La célula viva” (selecciones de Scientific American). Ed. Blume,
Madrid, 2º Ed. 1970.
7. WEST, E.S. TODD, W., MASON, H. y VAN BRUGGEN, J. “Bioquímica médica, Ed.
Interamericana S.A., México, 4º Ed. 1969.