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INFORME DE INVESTIGACIÓN:
“PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y
MONOCLONALES”
ALUMNAS:
Andrea Isabel Díaz Arroyo
Ana Isabel Serrano Páez
Emili Cuevas Ramírez
MATRÍCULAS:
1170667
1770598
1170536
GRUPO: 5.3
LUGAR Y FECHA: Fresnillo, Zac. 09/04/19
INTRODUCCIÓN
Esta tecnología supuso un importante avance, ya que permitió obtener anticuerpos específicos
capaces de reconocer a un único epítopo o determinante antigénico y producirlos de forma ilimitada.
El procedimiento comienza con la inmunización de un ratón con el antígeno de interés, tras la cual,
se extraen los linfocitos B a partir del bazo del animal y se fusionan con células neoplásicas de
mieloma. De esta manera se obtiene una célula de fusión, un hibridoma, que combina ciertas ventajas
de sus progenitores, la capacidad de producir grandes cantidades de un único anticuerpo, propia de
los linfocitos B y la capacidad de multiplicarse indefinidamente, característica de las células
neoplásicas, en continuación, se seleccionan los hibridomas capaces de producir los anticuerpos
deseados y se produce la expansión del clon de mayor interés. Finalmente se procede a la purificación
de los anticuerpos obtenidos. De esta manera se obtiene una fuente casi inagotable de anticuerpos
producidos por un clon celular, que derivan de un único linfocito B, y que son por tanto idénticos y
específicos de epítopos individuales.
Con el fin de evitar estos problemas, graves, y gracias a las técnicas de ingeniería genética, se
desarrollaron nuevas técnicas moleculares que dieron lugar a la obtención de los anticuerpos
monoclonales de segunda generación, los anticuerpos monoclonales recombinantes (Sanz L, 2009),
en los cuales se reemplazaron porciones del anticuerpo murino por proteínas humanas. En primer
lugar se obtuvieron los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los que la región Fab es de origen
murino mientras que la fracción cristalizable Fc es de origen humano, y posteriormente los
anticuerpos monoclonales humanizados, en los que la región Fc sigue siendo de origen humano y la
región Fab es parcialmente humana y parcialmente murina. Los anticuerpos monoclonales quiméricos
contienen aproximadamente un 65-90% de cadena humana mientras que los humanizados contienen
aproximadamente un 90-95%. En 1997 se aprobó el primer anticuerpo monoclonal quimérico,
rituximab, y en 1999 el primero humanizado (Sanz L, 2009).
Por otra parte, la tecnología Phage Display (presentación de proteínas en la superficie de fagos
filamentosos) permite obtener anticuerpos monoclonales sin utilizar ratones. Los fagos son partículas
víricas que infectan bacterias, sin producir enfermedades en los seres humanos. Mediante técnicas de
ADN recombinante es posible introducir genes de cualquier organismo, sin importar la complejidad,
en el genoma de los fagos. Estos fagos modificados genéticamente pueden expresar en su superficie
diferentes proteínas terapéuticas. En líneas generales, lo que se pretende con esta tecnología es
obtener una molécula que posea la máxima afinidad por una determinada diana terapéutica. Y para
ello, el primer paso es obtener todas las posibles combinaciones genéticas que produzcan la molécula
que se está buscando y cada una de estas secuencias se fusiona con el gen que codifica las proteínas
de la cápside del fago, para lograr que sean expresadas en su superficie. De esta forma se obtienen
clones de fagos, cada uno de los cuales produce una variante diferente de la secuencia de la proteína
que se desea obtener. Posteriormente, se eligen aquellos fagos que expresen en su superficie la
molécula con las mejores propiedades de unión a la molécula diana.
Los anticuerpos policlonales son aquellos producidos por más de una clona delinfocitos B. Cada uno
reconoce un antígeno distinto o diferentes epítopes de un mismo antígeno.
Los antígenos que pueden provocar una respuesta inmune de forma natural son complejos e incluyen
varios epítopes por lo que las respuestas de anticuerpos que inducen siempre son policlonales.
Los anticuerpos policlonales para uso en investigación y medicina pueden obtenerse inmunizando un
animal con el antígeno de interés (incluyendo una proteína transportadora y un adyuvante de ser
necesarios) y purificando los anticuerpos que produce.
Se puede utilizar muchos tipos de animales pero los más comunes son ratón, conejo y cabra.
Los anticuerpos policlonales obtenidos serán una mezcla de los producidos por todas las clonas de
linfocitos B activadas por la inmunización por lo cual su especificidad y afinidad son heterogéneas
Cuando se administran a humanos pueden ser reconocidos como proteínas extrañas y producir
respuestas inmunes que los inactivan o generan enfermedades por inmunocomplejos
(hipersensibilidad tipo III) en nuevas administraciones.
También se producen preparaciones de anticuerpos policlonales a partir de suero de humanos o por
producción de proteínas recombinantes (Murphy, K, 2012).
La inmunocitoquímica, que es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante
el empleo de anticuerpos. Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la
estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente.
Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas
y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con
sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G,
producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B durante la respuesta
inmune. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una
molécula que reconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo, el cual se extrae
del animal inmunizado, y del que posteriormente se purifican. Dichos anticuerpos purificados se
usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica.
Las moléculas complejas como las proteínas pueden tener en su estructura varios determinantes
antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Cuando se
emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando
anticuerpos policlonales. Por otra parte, existe una técnica que permite aislar y cultivar en el
laboratorio (in vitro) de forma invidualizada a cada uno de los clones de linfocitos B activados
durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un solo tipo de inmunoglobulina
G que reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A los
anticuerpos obtenidos de cada uno de esos cultivos se les denomina monoclonales ya que proceden
de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas (Atlas, 2019)
Fig.1 Esquema
resumido de las
diferencias en la
obtención de
anticuerpos
policlonales
(izquierda) y
monoclonales
(centro y
derecha).
ELISA es una de las técnicas más utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los
anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Además, por
su fácil estandarización, manejo y variedad de antígenos disponibles, ha desplazado notablemente a
otras técnicas como el radioinmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-DNAcd (conocido
también como prueba de Farr), ya que no utiliza radionúclidos, lo que hace que sea una técnica
accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio
de diagnóstico de autoinmunidad es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento
de los anticuerpos específicos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo
dirigido contra la región Fc humana de cualquier isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier
subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2) (M.J. Fritzler,2006).
En los últimos años el ensayo luminométrico múltiple (ELM) se ha vuelto popular, debido a que
permite la detección de hasta 100 diferentes auto anticuerpos que reconocen el mismo número de
antígenos en una sola determinación y con un volumen pequeño de muestra (aproximadamente 50μL).
Estas son las ventajas más importantes del ensayo comparado con el ELISA, ya que para realizar el
mismo número de determinaciones específicas por ELISA se requerirían 100 placas y 5mL de
muestra. La técnica es una variante del ELISA indirecto, pero la detección es distinta: en el ELISA
se utiliza un compuesto cromogénico, en tanto que en el ELM la detección se realiza por
fluorescencia, con lo que la sensibilidad del ensayo es mayor) (M.J. Fritzler,2006).
Hibridomas
Ya que los anticuerpos monoclonales, son un conjunto de moléculas de anticuerpos idénticas, todas
con la misma especificidad, producidas por un único clon de linfocitos B. Se obtienen mediante la
técnica de los hibridomas, que consiste en fusionar in vitro linfocitos B, provenientes de un ratón
sensibilizado con el antígeno, con células tumorales procedentes de un mieloma (tumor linfocitario),
capaces de proliferar de forma indefinida. Se obtiene una célula llamada hibridoma, que hereda del
linfocito B la capacidad de producir un determinado anticuerpo, y de la célula tumoral la capacidad
de reproducirse indefinidamente. Posteriormente el hibridoma se clona, consiguiendo gran cantidad
de células que producirán el mismo anticuerpo en grandes cantidades (M.J. Fritzler,2006).
Hibridoma
Es una línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito B productor del anticuerpo
específico de interés, con una línea celular de mieloma (linfocito B canceroso) que no produce
una inmunoglobulina propia. Se obtiene así una línea celular inmortal capaz de producir el anticuerpo
monoclonal de interés, que puede recuperarse del medio (Clinica universidad de Navarra, 2018).
Para producirlos se necesita aislar la clona de linfocitos B en el laboratorio. Esto se puede lograr por
varios métodos pero el principal es la fusión de los linfocitos B de un animal inmunizado para el
antígeno de interés con células de un mieloma múltiple (tumor de células plasmáticas, que provienen
de los linfocitos B) para producir una célula híbrida llamada hibridoma que puede vivir
indefinidamente y puede ser aislada y caracterizada (Barriento, s.f.)
Esta tecnología puede hacerse con varios tipos de animales e incluso células humanas, pero las
células más usadas son de ratón y conejo.
Ilustración 1 Representación esquemática de la obtención de anticuerpos monoclonales mediante la
técnica de hibridomas.
Las células de mieloma múltiple son una línea celular para uso en investigación. Pueden crecer en
cultivo indefinidamente. Para la producción de hibridomas, se induce pormutaciones en estas células
las siguientes características:
Los anticuerpos monoclonales han sustituido a los sueros policlonales para las investigaciones
llevadas a cabo en las que se requiere ensayos de alta afinidad, sensibilidad, y precisión, o bien donde
se necesita trabajar en condiciones que permitan aumentar la detectabilidad de una táctica.
Metodología
Se utilizan resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas
netas en un determinado buffer (a un determinado pH) (Abyntek, 2016).
Permite separar anticuerpos (˃140kDa) de componentes con un menor pero molecular (MW)
presentes en la muestra, como pequeñas proteínas y péptidos (Abyntek, 2016).
Habitualmente se utiliza como paso previo a una purificación por afinidad, y no como un método de
purificación de anticuerpos definitivo en sí mismo.
Utiliza quelatos de iones metálicos divalentes inmovilizados para unirse a proteínas o péptidos que
contengas clusters de histidina (por ejemplo, las IgG de mamíferos) o más de tres residuos de
histidina consecutivos. (También es un método de purificación habitual para proteínas
recombinantes con cola de histidina) (Abyntek, 2016).
Como se observa en la Ilustración 2 se tienen bastantes diferencias entre los dos tipos de anticuerpos,
de las más relevantes, es el costo que lleva la producción de estos, también el rendimiento hay una
gran diferencia ya que los policlonales tienen un concentración media de 1mg/mL en cambio los
monoclonales 20mg/ml. Y la afinidad es fija en los monoclonales y varia en los policlonales.
Fundamento
El antisuero de un animal inmunizado o el sobrenadante de un cultivo de hibridomas podrían llegar a
utilizarse directamente como reactivo en determinados casos, aunque habitualmente es necesario
aplicar previamente alguno de los métodos de purificación de anticuerpos para la realización y el
correcto desarrollo de la mayoría de inmunoensayos.
Las inmunoglobulinas suponen aproximadamente el 20% del total de proteínas plasmáticas, por lo
que no aplicar métodos específicos de purificación de anticuerpos podría resultar en reacciones no
deseadas entre otros componentes del plasma/medio y la muestra diana.
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS
Foltz IN, Karow M, Wasserman SM. Evolution and emergence of therapeutic monoclonal
antibodies. What cardiologists need to know. Circulation 2013.
Sanz L, Álvarez-Vallina L. Anticuerpos monoclonales. Biotecnología y Biofármacos. Consejo
General de Colegios Oficiales de Farmacéuticos. 2009
Murphy, K. (2012) Janeway’s Immunobiology New York, NY: Garland Science
Atlas de Histología Vegetal y Animal. (Actualizado 30-01-19). Imnunocitoquimica. 8-4-19, de
Universidad de Vigo España Sitio web: https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/5-inmuno.php