Metodologias y herramientas de Trabajo

 La resonancia magnética nuclear (RMN)

Constituye una técnica con un amplio y reconocido espectro de aplicaciones en el campo del análisis
estructural. Es la herramienta analítica que proporciona mayor información estructural y
estereoquímica en un tiempo asequible.

Es una técnica que explota las propiedades magnéticas de ciertos núcleos. Las aplicaciones más
importantes para su uso en química orgánica son la espectrometría RMN de protones y la de
carbono-13.

Tuvo sus inicios a principios de la década de 1950, cuando se comercializaron los primeros
espectrómetros para la obtención de espectros de protones, tras el descubrimiento en 1945 de la
resonancia. Este fenómeno plantea que los núclidos sometidos a un campo magnético externo
absorben radiación electromagnética en el orden de las radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta
de esta absorción depende del entorno químico de los núclidos, el espectro de señales de absorción
de los mismos revela una valiosa información sobre la estructura de la molécula.

Las partes fundamentales de un espectrómetro de RMN son un imán, actualmente una bobina
superconductora, que suministra el campo magnético principal, un oscilador de radiofrecuencias
que suministra la energía necesaria para cambiar la orientación de los núcleos, una bobina detectora
que recibe las señales y un sistema informatizado que gobierna todo el aparato y que incluye un
sistema de amplificación y registro.

El impacto de la espectrometría RMN en las ciencias naturales ha sido sustancial. Puede utilizarse,
entre otras cosas, para estudiar mezclas de analitos, para comprender efectos dinámicos como el
cambio en la temperatura y los mecanismos de reacción, y es una herramienta de valor incalculable
para la comprensión de la estructura y función de las proteínas y los ácidos nucleicos. Este tipo de
espectrometría se puede aplicar a una amplia variedad de muestras, tanto en solución como en
estado sólido siendo esta última una técnica adecuada y cada vez más utilizada para el estudio de
las propiedades estructurales de una amplia variedad de materiales amorfos o poco cristalinos. A
diferencia de las muestras en disolución, las muestras en estado sólido dan lugar a espectros con
señales anchas, resultado de la suma de diversos factores. Estos espectros, sin embargo, contienen
información única acerca de la estructura y la dinámica de los materiales estudiados.

Las aplicaciones de la RMN de estado sólido suelen utilizarse en investigaciones sobre proteínas de
la membrana, fibrillas de proteínas, todo tipo de polímeros, análisis en química inorgánica, y
también otras más "exóticas" como las hojas de plantas y las pilas de combustible.

La RMN, aunque resulta una técnica costosa permite optimizar parámetros para cuantificar
biomoléculas de elevada complejidad. No requiere necesariamente la destrucción o transformación
de la muestra.
ESPECTROMETRÍA RMN APLICADA A PROTEÍNAS

La Resonancia Magnética Nuclear, junto con la cristalografía de rayos X, son las únicas técnicas que
permiten determinar la estructura tridimensional de las proteínas con alta resolución. El
conocimiento de la estructura tridimensional de las proteínas resulta fundamental para poder
comprender sus funciones.

Frente a otras técnicas que también se emplean para estudiar proteínas, la RMN no sólo nos permite
determinar la estructura de las proteínas con resolución atómica, sino también sus movimientos y
sus interacciones con otras moléculas en el cuerpo, datos que necesitamos para poder explicar
muchas de sus funciones.

Otra importante aplicación de la RMN es la detección de sitios de interacción. Las proteínas

interactúan regularmente con otras moléculas mientras ejecutan su tarea específica. La Resonancia
Magnética Nuclear permite determinar de manera sencilla y rápida en qué parte de la proteína se
produce esta interacción.

Algunas aplicaciones de la resonancia magnética nuclear cuantitativa en vacunas

En la última década, la aplicación de la RMNc ha tenido un creciente impacto en la industria

farmacéutica. Varios trabajos han ido solucionando diferentes problemas analíticos en la
preparación de vacunas o candidatos.

Muchos problemas analíticos comunes de la fabricación de vacunas encontraron solución en el uso

creciente de la RMNc. La misma, por su rendimiento y su versatilidad, se ha convertido en la técnica
de elección para la cuantificación de compuestos orgánicos con un creciente uso en la industria
biofarmacéutica. El ajuste certero de varios parámetros permite la obtención de métodos que dan
solución a varios requerimientos de cuantificación de materias primas, productos de alto valor
agregado o impurezas, altamente recomendados en la producción de vacunas. Mediante el mismo
experimento de RMNc, el espectro obtenido puede brindar información cuantitativa del compuesto
analizado, además de la información estructural cualitativa intrínseca del mismo.
 La resonancia paramagnética electrónica.

Desde sus comienzos, la Resonancia Paramagnética electrónica se reveló como una técnica
poderosa para obtener una información detallada de la estructura microscópica de defectos en
sólidos.
Las impurezas, o defectos químicos, juegan un papel importante a la hora de determinar las
propiedades de un material. Estas impurezas pueden, como consecuencia del proceso de
preparación o inducidas por distintos agentes externos (radiación, calentamiento en diferentes
atmósferas, etc.), modificar su configuración o estado de carga, apareciendo con valencias
inusuales desde el punto de vista químico. En múltiples ocasiones estos estados de carga
resultan ser paramagnéticos y en estos casos la espectroscopia de Resonancia Paramagnética
Electrónica es una herramienta de gran utilidad para su estudio dada su gran sensibilidad
(pequeñas trazas de estas impurezas son suficientes para modular las propiedades del material
huésped) y por su gran especificidad (los espectros de Resonancia Paramagnética Electrónica
son sensibles a pequeños cambios en la configuración de estos defectos). Así, se ha publicado
una gran cantidad de trabajos en los que se estudia la configuración electrónica y la disposición
geométrica de estos defectos extrínsecos

La espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica tiene aplicaciones, por su

capacidad analítica no destructiva, en campos diversos. Entre ellos se encuentran la Física de
Sólidos, la Química, la Geología, Paleontología, Biología, Medicina, Ciencia de los Alimentos,
Medio Ambiente, Dosimetría de Radiaciones, etc. y ámbitos tales como el Forense o el de
Control de Calidad.
Las aplicaciones de la espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica a problemas de
la Química surgen de su capacidad de suministrar información acerca de las propiedades
electrónicas y estructurales de especies paramagnéticas. De forma muy general estas
aplicaciones las podemos clasificar en tres amplios apartados: compuestos de coordinación,
radicales libres y estudios de catalizadores, en particular heterogéneos.

Una gran parte de los compuestos de coordinación contienen metales de transición, muchos de
cuyos estados son paramagnéticos. En estos casos la Resonancia Paramagnética Electrónica se
ha mostrado como una técnica eficaz para obtener información acerca del estado de carga y de
la simetría puntual del metal, tanto en experimentos realizados en muestras policristalinas
como en disoluciones congeladas y, muy especialmente, en monocristales. Es una técnica
idónea para la determinación de interacciones magnéticas débiles, que no dan lugar a orden
magnético. Detecta la formación de dímeros y permite estimar las constantes de interacción de
canje en sistemas magnéticamente concentrados.

Los centros activos de los catalizadores heterogéneos están constituidos, en ocasiones, por
entidades paramagnéticas. Uno de los factores que ha dado más relevancia a esta técnica en el
estudio de los catalizadores es su elevada sensibilidad junto con su especificidad. En estos
sistemas la concentración de centros activos es, en general, muy pequeña y además, en
ocasiones, pequeñas modificaciones en su estado o configuración alteran drásticamente su
actividad catalítica. Así, la espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica suministra
información acerca de la configuración y entorno de iones de transición en catalizadores, de las
modificaciones de la esfera de coordinación en los iones superficiales y de los procesos redox
que sufren los iones de transición activos.

En Medicina la espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica se ha utilizado en el

estudio de los efectos de las radiaciones. Mutagénesis, carcinogénesis y los efectos terapéuticos
de las radiaciones en el tratamiento de algunos cánceres no son más que manifestaciones de
los efectos de las radiaciones ionizantes sobre las distintas moléculas. La Resonancia
Paramagnética Electrónica permite identificar los radicales generados por efectos de las
radiaciones ionizantes y así aportar información acerca de los procesos moleculares
subyacentes. Aparte de esta aplicación tradicional, en los últimos años la Resonancia
Paramagnética Electrónica ha comenzado a utilizarse para la detección de distintos radicales
endógenos, cuya generación está asociada a diversos procesos de oxidación y que puede reflejar
distintas patologías: diabetes mellitus, enfermedades crónicas pulmonares y esterilidad
masculina son algunos ejemplos.

En la actualidad va extendiéndose el empleo de la espectroscopia de Resonancia Paramagnética

Electrónica en el campo de la Ciencia de los Alimentos en el control de la degradación de estos,
como es el caso de la pérdida del aroma y sabor original de la cerveza o el enranciamiento de
aceites y grasas comestibles. En líneas generales, estos procesos de degradación se deben a
oxidaciones que dan lugar a radicales libres muy reactivos. Estos radicales, al reaccionar con
componentes alimentarios, dan lugar a aldehídos y cetonas, compuestos que resultan ser los
responsables de la pérdida de las propiedades organolépticas iniciales de los alimentos. La
detección de estos radicales, de corta persistencia por su alta reactividad, se lleva a cabo
mediante el empleo de trampas de espín y permite determinar el grado de oxidación y, en
consecuencia, de degradación, de los alimentos.
 Dicroísmo circular

Esencialmente, uno de los tipos de medición comúnmente empleado para determinar el efecto
de la luz polarizada en una molécula asimétrica es el dicroísmo circular (DC) (Hammes G., 2005),
que se define como la diferencia entre la absorción de luz polarizada circularmente a la izquierda
y a la derecha por compuestos ópticamente activos.
La luz polarizada circularmente es quiral, es decir, se encuentra en dos formas no superponibles,
las cuales son imágenes en el espejo una de otra. Para discriminar entre las dos formas quirales
de la luz, una molécula debe ser quiral, lo cual incluye a la extensa mayoría de moléculas
biológicas.

Los efectos producidos por la incidencia de la luz sobre moléculas quirales son relativamente
pequeños pero pueden ser medidos fácilmente con instrumentos modernos. Por lo tanto,
medidas de dicroísmo circular proporcionan información detallada, estructural y enantiomérica
de proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, productos farmacéuticos, etc. (Fasman G., 1996).
En el caso particular de proteínas, el DC es una técnica muy valiosa, ya que permite llevar a cabo
estudios estructurales en las condiciones donde las biomoléculas funcionan normalmente: en
solución, proporcionando así medidas de cambios estructurales esenciales para su función
biológica.

El dicroísmo circular se expresa frecuentemente como la propiedad que poseen algunos

materiales de absorber la luz a diferentes grados dependiendo de la forma de polarización del
haz incidente. Se dice que un material presenta dicroísmo circular cuando la absorción de la luz
circularmente polarizada en una dirección (derecha) es diferente de la absorción de la luz
circularmente polarizada en la dirección opuesta (izquierda).

Gama de aplicaciones

 Estudios conformacionales de proteínas

 Análisis cuantitativo de productos farmacéuticos
 Estudios de formulación
 Estudios de plegado de proteínas
 Interacciones ADN / ARN
 La cinética de enzimas
 Pruebas de pureza de sustancias ópticamente activas
 Química de productos naturales
 Espectroscopia electrónica: UV-vis

La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, y

además, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia. Se utiliza de manera general en la
determinación cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de metales de transición y
compuestos orgánicos altamente conjugados. Se utiliza extensivamente en laboratorios de química
y bioquímica para determinar pequeñas cantidades de cierta sustancia, como las trazas de metales
en aleaciones o la concentración de cierto medicamento que puede llegar a ciertas partes del
cuerpo.

En soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz
visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado
electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia
de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solución diluida
de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y cambia la longitud de
onda de absorción máxima.

En el caso de los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación,
también absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los
disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en
agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una
significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en
espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La
polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico.
La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción molar
cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional

a la concentración de la solución. Por tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse para determinar
la concentración de una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la absorbancia con la
concentración. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de
extinción molar) o, con más exactitud, determinándolo a partir de una curva de calibración.

El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la
concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse
con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta
(por ejemplo, el pico de altura) para un concentración particular se conoce como factor de
respuesta.
 Espectroscopía Vibracional

La espectroscopía vibracional engloba a la espectroscopía de absorción infrarroja, y a la

espectroscopía de dispersión Raman. Ambas espectroscopías permiten extraer información acerca
de la naturaleza química de un determinado material o de los distintos componentes del material
mismo, de manera no-destructiva, rápida y sin preparación previa de la muestra.

 Espectroscopía Raman

La espectroscopía Raman permite analizar la composición química de muestras de distinta

naturaleza (compuestos orgánicos e inorgánicos, minerales, pigmentos pictóricos, etc.) así como la
caracterización de las mismas. Para ello se emplea como fuente excitatriz una radiación láser
monocromática que se hace incidir sobre la muestra. Esta interacción luz-materia está en el origen
de las bandas Raman las cuales son características de una determinada sustancia. La especificidad
del patrón Raman dota a la técnica de una gran potencialidad para la identificación de sustancias en
mezclas de materiales. Además, una de las grandes ventajas de esta técnica es que proporciona
información molecular de los materiales a caracterizar y que puede ser considerada como una
técnica de análisis no destructiva.

El estudio de materiales de naturaleza orgánica y/o inorgánica mediante espectroscopía Raman se

fundamenta en el análisis espectral de la luz dispersada por dicho material al hacer incidir sobre él
un haz de luz monocromático, es decir, una radiación láser. La dispersión inelástica Raman nos
proporciona información precisa acerca de las vibraciones moleculares que experimentan los iones
y átomos enlazados químicamente para formar moléculas y redes cristalinas (vibraciones
moleculares que se producen además a frecuencias características para cada compuesto químico),
permitiendo obtener así información química y estructural sobre el material objeto de estudio.

La espectroscopía Raman es especialmente útil para la caracterización de anillos y enlaces apolares

o poco polares como por ejemplo C≡C, C=C, N=N, C-C, O-O, S-S, vibraciones que, sin embargo, son
mucho menos intensas en el espectro IR.

Se trata de una espectroscopía aplicable a cualquier estado de agregación. En disoluciones acuosas

presenta ventajas sobre la espectroscopía IR ya que solamente están implicadas las longitudes de
onda de la región visible o del infrarrojo cercano (NIR) del espectro, con lo que únicamente se
precisan células y elementos ópticos de vidrio convencional. Además, el agua produce señales
Raman muy débiles con lo cual, al contrario que en experimentos de IR, no interfiere prácticamente
en el espectro. Otras ventajas destacables son que la cantidad de muestra necesaria es mínima y
que no produce alteraciones significativas en ella, además de que permite utilizar un amplio rango
de concentraciones
 Espectroscopía IR

La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las sustancias tienen
frecuencias de vibración específicas, que corresponden a los niveles de energía de la molécula. Estas
frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía potencial de la molécula, la geometría
molecular, las masas atómicas y, posiblemente, el acoplamiento vibracional.

Cuando se analiza una muestra mediante espectroscopía IR, se producirá absorción de la radiación
si la vibración activada modifica el momento dipolar de la molécula. Es decir, para que una banda
en cuestión se observe, es necesario que varíe el momento dipolar permanente con respecto al
correspondiente modo normal de vibración. De esta forma se pueden identificar grupos funcionales
por su frecuencia de aparición. Este hecho unido a la sencillez y robustez experimentales de la
técnica, hacen de la espectroscopía IR un método sencillo, rápido y fiable para identificar la
naturaleza química de una sustancia.

Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho en química, en
especial en química orgánica. Se pueden generar gráficos bien resueltos con muestras de una sola
sustancia de gran pureza. Sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de
mezclas complejas.
Bibliografia

Laurella, Sergio Luis Nociones de resonancia magnética nuclear : una aproximación a la elucidación
estructural / Sergio Luis Laurella. - 1a ed. - La Plata : Universidad Nacional de La Plata, 2017.

Marta Martinez Esperanza ,“ Metodo fisicos-bioquimicos en biotecnología: Dicroismo circular ”,

Mexico. Instituto de Biotecnología/UNAM, 2013, recuperado 18 de enero de 2019, disponible en
, http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/dicroismocircular2013.pdf

Espectroscopía Vibracional. ( S.F) Recuperado el 18 de enero del 2019, disponible en

http://www.scai.uma.es/areas/aqcm/evi/evi.html

Gascón Alonso Javier, “La resonancia paramagnética electrónica una técnica multidisciplinar”,
España. Academia de ciencias exactas, físicas, químicas y naturales de Zaragoza,2002, recuperado
el 17 de enero de 2019, disponible en
http://www.raczar.es/webracz/ImageServlet?mod=publicaciones&subMod=discursos&archivo=Al
onso.pdf