AULA PRÁTICA

ENZIMAS

Enzimas catalisam as reações bioquímicas e são partes integrais da ciclagem de nutrientes

no solo. Todos os organismos vivos no solo, como microrganismos, raízes de plantas e
fauna, contribuem com grande variedade de enzimas. Elas estão usualmente associadas
com a proliferação de células viáveis, mas podem ser excretadas de uma célula viva ou
liberadas na solução do solo a partir de células mortas.

As fosfatases hidrolisam compostos de P orgânico transformando-os em diferentes

formas de P inorgânico, os quais são assimilados pelas plantas. Essas enzimas podem ter
origem a partir de microrganismos, como bactérias, fungos ou protozoários, assim como
animais e raízes de plantas. A mensuração da atividade da fosfatase é baseada na leitura
em espectrofotômetro do p – nitrofenol resultante da atividade enzimática da fosfatase.

Determinação da atividade da fosfatase:

1. Equipamentos:
Balança analítica
pHmetro
Banho-maria
Espectrofotômetro

2. Reagentes:
Ácido cítrico
Ácido maléico
Ácido bórico
Tris (hidroximetil aminometano)
NaoH
Cloreto de cálcio
p-nitrofenil fosfato

3. Preparo das soluções

Tampão universal (MUB) - solução estoque: dissolver 12,1 g tris; 11,6 g de ácido
maléico; 14 g de ácido cítrico e 6,3 g de ácido bórico em 500 mL de NaOH (1 mol L-1) e
diluir a solução para 1000 mL com água destilada. Armazenar a solução em geladeira a
4°C.

Tampão universal (MUB) (solos ácidos pH 6,5, solos alcalinos pH 11): pipetar 200
mL da solução estoque MUB em um beker de 500 mL e titular a solução com HCl (0,1
mol L-1) até atingir pH 6,5 ou titular a solução com NaoH até atingir pH 11. Transferir
para um balão volumétrico 1000 mL e completar o volume com água destilada.

CaCl2 (0,5 mol L-1): dissolver 73,5 g de CaCl2.2H2O em 700 mL de água destilada,
completar o volume para 1000 mL com água destilada.
NaOH (0,5 mol L-1): dissolver 20 g de NaOH em 700 mL de água destilada e completar
o volume para 1000 mL com água destilada.

Solução PNP (p-nitrofenil fosfato 0,05 mol L-1): dissolver 0,840 g de PNP em 40 mL
de MUB (pH 6,5), após a dissolução, completar a solução para 50 mL com MUB (pH
6,5). Estocar a solução em geladeira.

Solução padrão de PNF (p – nitrofenol): dissolver 0,1 g de p-nitrofenol em 70 mL de

água destilada e completar a solução para 1000 mL com água destilada. Armazenar a
solução em frasco escuro e em geladeira.

Procedimento:

Preparação das amostras

1. Pesar 0,5 g de solo em tubo Falcon de 15 mL;

2. Adicionar 2 mL de MUB (pH 6,5) e 0,5 mL de solução PNP, agitar o frasco por
alguns segundos até misturar o conteúdo;
3. Fechar o frasco e incubar em banho Maria por 1 hora a 37 °C;
4. Adicionar 0,5 mL de solução CaCl2 e 2,0 mL de NaOH (0,5 mol L-1), agitar por
alguns segundos até misturar;
5. Filtrar a solução e medir a absorbância em espectrofotômetro a 410 nm.

Preparação do branco (controle):

1. Pesar 0,5 g de solo em tubo Falcon de 15 mL;

2. Adicionar 2 mL de MUB (pH 6,5) e agitar o frasco por alguns segundos até
misturar o conteúdo;
3. Fechar o frasco e incubar em banho Maria por 1 hora a 37 °C;
4. Adicionar 0,5 mL de solução CaCl2 e 2,0 mL de NaOH (0,5 mol L-1), agitar por
alguns segundos até misturar.
5. Adicionar 0,5 mL de solução PNP e misturar; em seguida filtrar a solução e medir
a absorbância a 410 nm.