LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS:

CATECOLASA

PREINFORME Nombre: Viviana Jimenez Grupo: 3.1

I. CUESTIONARIO CONSULTA
1. Explique brevemente ¿qué es el pardeamiento enzimático?
El pardeamiento enzimático (PE) esta relacionado con la actividad de la enzima
polifenol oxidasa (PPO) que cataliza la oxidación a diferentes compuestos fenólicos, con la
consecuente transformación a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial.
2. Sobre la catecolasa (catecholase) en el enlace del aula virtual (DBGET Search –
ENZYME) consulte: nombres comunes y sistemático, clasificación completa, incluyendo
jerarquía (brite hierarchy), reacción o reacciones que cataliza, sustrato, producto, cofactor
y comentario sobre la enzima.
-Nombre:

catecol oxidasa; difenol oxidasa; o-difenolasa; polifenol oxidasa;pirocatecol oxidasa; dopa

oxidasa; catecolasa; o-difenol: oxidorreductasa de oxígeno; o-diphenol oxidoreductase.
-Clasificacion:

Oxidoreductasas;
Actuar sobre difenoles y sustancias relacionadas como donantes;
Con oxígeno como aceptor.
-Nombre sistematico:
1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno
-REACCIÓN: R00058

R00058 Reaction
Entrada

Nombre catecol: oxidorreductasa de oxígeno;

1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno

Definición Oxígeno + 2 Catecol <=> 2 o-Benzoquinona + 2 H2O

REACCIÓN: R00031

R00031 Reaction
Entrada

Nombre 1,2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno

Definición Oxígeno + 2 L-Tirosina <=> 2 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina

-Sustrato:
Nombre
Catecol;
1,2-bencenodiol; o-Benzenediol; 1,2-
dihidroxibenceno; Brenzcatechin;Pyrocatecho
Fórmula C6H6O2

-Producto:
Nombre:
o-benzoquinona; 1,2-
Benzoquinona
Fórmula
C6H4O2

-Comentario
Una proteína de cobre tipo 3 que cataliza exclusivamente la oxidación de catecol (es decir,
o-difenol) a la o-quinona correspondiente. La enzima también actúa sobre una variedad de
catecoles sustituidos. Es diferente de la tirosinasa, que puede catalizar tanto la
monooxigenación de los monofenoles como la oxidación de los catecoles.

3. Describa brevemente la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, si

la tiene, el sitio activo y los cofactores de la catecolasa usando figuras impresas y
recortadas del enlace del aula virtual - Enzyme structures database-. Para este propósito la
búsqueda debe realizarla con el número de clasificación obtenido del primer enlace, en el
espacio correspondiente a enzyme class: EC.

-El diagrama de colores ilustra la disposición de los residuos en cada hélice. Los residuos
están codificados por colores para los tipos de aminoácidos hidrofóbico (verde), polar (azul)
y cargado (rojo). Las ruedas asumen el valor helicoidal ideal de 3.6 residuos por vuelta.
-La estructura secundaria esta compuesta principalmente de α helices y giros beta y se
obsevan pequeñas configuraciones de hoja plegada
 (N.Hakulinen, 2013) (Krebs, Merkel, & Rompel, 2004)

(N.Hakulinen, 2013)

| EBI is an outstation of the European Molecular Biology Laboratory

 Macmillan Publishers Ltd: Nat Struct Biol (1998, 5 , 1084-1090) copyright 1998.
-Región de sitio activo de catecol oxidasa. a, Vista estéreo de la región del sitio activo con
feniltiourea unida al centro dicopper. El azufre del inhibidor se une a ambos iones de
cobre. Además, la cavidad hidrofóbica formada por los residuos Ile 241, His 244, Phe 261
proporciona contactos de van der Waals con el anillo aromático de la droga. Una
presentación en barra de los residuos del sitio activo del estado Cu (II) -Cu (II) en reposo de
la enzima se superpone en verde claro para revelar el cambio conformacional inducido por
la unión de PTU.

Macmillan Publishers Ltd: Nat Struct Biol (1998, 5 , 1084-1090) copyright 1998.
b, Presentación de la superficie molecular de la cavidad de unión hidrofóbica de catecol
oxidasa que muestra los dos iones metálicos, el inhibidor y Phe 261 en una presentación en
barra. La superficie electrostática se ha generado omitiendo estos residuos. Las áreas de
color rosa tienen un potencial negativo y las áreas de color púrpura tienen un potencial
positivo.

4. Haga una descripción sobre el efecto que tiene la temperatura y el pH en la actividad

catalítica de las enzimas.
-La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas
décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad.
Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína. En
cuanto los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de
incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas
siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se
empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es
máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de
actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse.

1. Fichas de seguridad

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad Primeros auxilios

CONSULTAR AL MEDICO EN
TODOS LOS CASOS
Inhalación: sacar al aire libre,
proporcionar oxígeno. No utilizar
técnicas boca a boca cuando la
víctima haya ingerido o inhalado la
sustancia; inducir la respiración
artificial con un dispositivo medico
efectivo
Polvo
Piel: quitarse inmediatamente la ropa
solido
Feniltiourea C7H8N2S y los zapatos contaminados. Lavar
Color beige
inmediatamente con agua abundante
Inodoro
P al menos durante 15 minutos. Lavar
las prendas contaminadas antes de
volver a usarlas.
Ojos: enjuagar inmediatamente con
abundante agua, también debajo de
los parpados al menos durante varios
minutos.
Ingestión: enjuagar la boca, NO
causar el vómito.
Inhalación: aire limpio y dejar en
reposo.
Piel: no hay afección
Ácido Cristales Ojos: enjuagar con abundante agua
C6H8O6
ascórbico blancos por varios minutos, consultar un
médico.
Ingestión: reposo y someter a
atención médica.
 Inhalación: aire limpio y reposo,
prestar atención medica
Piel: quitar ropas contaminadas
aclarar con abundante agua por varios
minutos o ducharse.
Cristales
Catecol C6H6O2 Ojos: enjuagar con abundante agua
incoloros
por varios minutos y si es fácil, retirar
Xn los lentes de contacto consultar al
medico
Ingestión: enjuagar la boca y prestar
atención médica.
Inhalación: trasladar al aire limpio
Piel: quitar ropas contaminadas y
HPO4−2 Liquido enjuagar con agua
Buffer fosfato con incoloro - Ojos: aclarar con abundante agua por
H2PO4- amarillo varios minutos
Ingestión: dar a beber agua, consultar
al médico.
Bibliografia.

Suárez, P., Andreu, A., Colman, S., Clausen, A., & Feingold, S. (2009). Enzimatic
browning : phenotypic , biochemical and molecular characterization of native potatoes
from Argentina. Revista Latinoamericana de La Papa, 15(1), 66–71. Retrieved from
http://www.papaslatinas.org/v15n1p66.pdf

Alzate T., L. M., Arteaga G., D. M., Guerreo E., C. A., & Rojano, B. A. (2013). Nueva
fuente de antioxidantes para el control de pardeamiento enzimático: una alternativa
para la reducción de pérdidas en poscosecha de frutas. Journal of Engineering &
Technology (2256-3903), 2(2), 22–32. Retrieved from
http://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&db=aph&AN=125024059&site=e
ds-live

Gerdemann C 1 , Eicken C , Krebs B (2015). La estructura cristalina de catecol oxidasa:

nueva percepción de la función de las proteínas de cobre tipo 3. Institut für
Anorganische und Analytische Chemie der Universität Münster, Wilhelm-Klemm-
Strasse 8, 48149 Münster, Alemania. Retrieved from http://www.genome.jp/dbget-
bin/www_bget?ec:1.10.3.1

Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Instituto Nacional de Seguridad e

Higiene en el Trabajo. Obtenido de Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el
Trabajo:
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Fi
cheros/301a400/nspn0379.pdf
Integrated database retrieval system.Enzime: 1,10,3,1. Obtenido de Integrateddatabase
retrieval system:
http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.10.3.1
Universidad del Pais Vasco. Universidad del Pais Vasco. Obtenido de Universidad del Pais
Vasco: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph

Krebs, B., Merkel, M., & Rompel, A. (3 de Marzo de 2004). http://www.scielo.org.ar/.

Obtenido de http://www.scielo.org.ar/: http://www.scielo.org.ar/pdf/aaqa/v92n1-
3/v92n1-3a01.pdf
N.Hakulinen, C. ( 2013). The European Bioinformatics Institute. Obtenido de The
European Bioinformatics Institute: https://www.ebi.ac.uk/thornton-
srv/databases/cgi-
bin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=4j3q&template=protein.html&r=wiring&l=1&ch
ain=A

Verificación de la actividad enzimática y efecto de la feniltiourea

RESULTADO ESPERADO:La feniltiourea inhibe el pardeamiento enzimático, esta se

unirá al cobre de la catecolasa e impedirá el acoplamiento de enzima-sustrato actuando
como un agente quelante utilizando en su estructura los iones de cobre formando
complejos, en las pruebas donde no se adiciona la feniltiourea presentara pardeamiento.
DIAGRAMA DE FLUJO:
Tomar 4 tubos, pipetear:

Tubo 1: 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL)Catecol 0.2%.

Tubo 2: 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL) Agua destilada.
Tubo 3: 1 (mL)Catecol 0.2% + 1 (mL) Agua destilada.
Tubo 4: : 1 (mL)Extracto enzimático + 1 (mL)Catecol 0.2% + 1(mL)Feniltiourea

Colocar los tubos en baño de maría a 37oC durante 25 minutos.

Observar como inicial y final de cada unos los tubos.

Emplear codigo para determinar el color.

Efecto de la temperatura
RESULTADO ESPERADO:observar la actividad enzimática depender de la temperatura,
a temperaturas extremas como 4ºC y 90ºC las enzimas perderán su función por la
desnaturalización proteica, desdoblamiento de la proteína y por consecuente pérdida de la
estructura terciaria, en cambio a temperatura cercana al ambiente o corporal de su
localización biológica las enzimas tendrán el máximo funcionamiento o la reacción tendrá
una mayor velocidad hasta el equilibrio en la formación de productos disminuyendo la
energía de
DIAGRAMA DE FLUJO

Adicionar a
cada uno 1 mL
del extracto
enzimático.
enzimático

tubos a diferentes
temperaturas durante
10 minutos, de esta
manera:

Tubo 1 a 0oC (en hielo)

Despues de 10 min,
agregar 1 mL de catecol
al 0,2%. Y dejar 5 min
mas a tem° indicada.
Tubo 2 a 37oC (en baño de agua)
Tubo 3 a 60oC (en baño de agua)
Tubo 4 a 92oC (en agua hirviendo)

Luego tomar tubos 1, 3 y

4 colocarlos en baño de
agua a 37oC durante 10
minutos, observar
yregistrar.

Observar el cambio de color segun codigo.

Efecto De ph
:
RESULTADO ESPERADO:La actividad enzimática dependerá del comportamiento de la
enzima ya sea acido o básico con el sustrato (mecanismo catalítico de la enzima), los
aminoácidos ácidos y bases que contiene el sitio activo son los determinaran el pH óptimo
por el grado de disociación de los grupos funcionales presentes en el sitio activo, el pH de
mejor actividad enzimática no necesariamente es el mismo del interior de la célula esto
sucede por los iones que participan en la desnaturalización a valores de pH, o por la
disponibilidad de los iones OH- en el medio para oxidar más rápido el catecol.
DIAGRAMA DE FLUJO:
Tomar 4 tubos, y medir volumenes:

Tubo 1: Buffer pH=3 - 2(mL) + 1 (mL) Extracto enzimático.

Tubo 2: Buffer pH=5 (mL)-2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático.
Tubo 3: Buffer pH=7 (mL) - 2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático.
Tubo 4: Buffer pH=9 (mL) - 2 (mL) + 1 (mL) Extracto enzimático.

Colocar los a una temperatura de 37oC durante 10 minutos.

Agregar a cada uno 1 mL de catecol,continuar calentamiento por 15 min.

Obsevar y registrar, plantear Ph optimo.

Efecto del ácido ascórbico

RESULTADO ESPERADO:el ácido ascórbico es un antioxidante por lo cual actuara
como un inhibidor del pardeamiento enzimático porque en agua liberara iones de
hidrogeno, que son el remplazo de los iones de hidrogeno que se remueven por la
catecolasa impidiendo la formación de moléculas de colores, por lo cual en la prueba
debería minimizar el pardeamiento enzimático hasta que se convierte en deshidroscorbico
en la otra muestra la enzima monofenol oxidasa tendrá más sustrato (agua) y ayudara en la
reacción para la obtención del color pardo.
DIAGRAMA DE FLUJO

Cortar un trozo de cada muestra (5

mm)de espesor y divídirlo en dos
partes iguales.

Raspar la superficie de ambos trozos, de cada muestra, con una cuchilla.

Cubrir uno de los trozos con agua destilada y al otro con ácido ascórbico.

Después de 1 minuto cubra los trozos con catecol.

Esperar 5 minutos y observar