Inmunohistoquímica:

los números de podocitos se evaluaron utilizando el clon 6F-H2 anti-WT1 (Tumor de Wilms 1) a
una dilución de 1: 100.
La inmunohistoquímica se realizó en un instrumento de inmunotinción automatizada Leica
Bond MAX. Se realizó un lavado de solución salina tamponada con Tween20 / Tris al 0,05%
entre todas las etapas. Las secciones de tejido que se desparafinaron, se trataron con la enzima
Proteinasa K y luego con la peroxidasa. Luego con un agente bloqueador de roedores se
incubaron con un anticuerpo primario anti-WT-1 que luego se detectó utilizando un anticuerpo
anti-ratón secundario estreptavidina-HRP.

La visualización de cromógenos se realizó utilizando tetrahidrocloruro de diatobenzidina 3,3

'(DAB) durante 5 minutos, seguido de contratinción de hematoxilina y deshidratación mediante
el aumento del gradiente de etanol-agua en xileno, y se montó en Permount. Se tomaron
imágenes de secciones de riñón completas utilizando Aperio ScanScope. Se cuantificaron
cincuenta glomérulos por sección de riñón para el número de células positivas para WT-1
(marrón) y negativas para WT-1 (azul).
También se realizó inmunohistoquímica para examinar CD31 un marcador de integridad
endotelial.

Análisis por RT-PCR de la expresión génica: una porción de riñón de cada ratón se congeló
instantáneamente en Trizolsolution y se almacenó a -80 ° C hasta el análisis. Los tejidos se
homogeneizaron utilizando un molino de perlas en 0,5 ml de solución de Trizol y el ARN total se
extrajo con cloroformo y se purificó usando un mini kit RNeasy estándar. Las muestras de ARN
se eluyeron en 30 uL de agua libre de nucleasas y se cuantificaron utilizando un Nanodrop. El
ADNc se generó a partir de 2 μg de ARN mediante el uso de reactivos Clontech Sprint
PowerScript de acuerdo con el protocolo del fabricante. La amplificación por PCR y el análisis de
la reacción de PCR se realizaron y monitorearon utilizando un sistema de detección de secuencia
ABI Prism 7900HT.

Análisis estadístico: Los análisis estadísticos para los datos de suero y orina, y los datos de
expresión génica se realizaron utilizando una prueba t de Student de dos colas. El análisis
estadístico de los datos histológicos se realizó mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-
Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn.

Resultados
1. Efectos sistémicos y farmacocinética.

La uninefrectomía (Unx) se asoció con una ligera reducción en el peso corporal tanto en el
vehículo como en los grupos de tratamiento; sin embargo, las ganancias de peso corporal
durante el curso del estudio no se vieron afectadas por los tratamientos con CXA-10 o enalapril
en los grupos de DOCA / sal (Fig. 2A).

La adición de DOCA / sal causó un aumento modesto en la presión arterial media (~ 20 mmHg)
en el modelo, que no fue mitigado por ninguno de los tratamientos, incluido el enalapril (Fig.
2B).
Los niveles de colesterol total en plasma también se elevaron significativamente con DOCA /
sal en el grupo del vehículo (> 100%) y se redujeron con una dosis baja de CXA-10 o enalapril
(Fig. 2C). El peso renal / peso corporal y las relaciones peso corporal / peso corporal
aumentaron con la administración de DOCA / sal en este modelo y se atenuaron
significativamente con el tratamiento con dosis bajas de CXA-10 (Fig. 2C).

Se administró CXA-10 después de 2 semanas y 4 semanas de tratamiento diario por vía oral en
el modelo de DOCA / sal y se determinaron las concentraciones plasmáticas de CXA-10 (23
horas después de la dosis final) de CXA-10. Las concentraciones plasmáticas promedio de CXA-
10 para el grupo de dosis baja (2,5 mg / kg) a las 2 y 4 semanas fueron de 14.9 y 9.7 ng / ml,
respectivamente; y 79 y 58.4 ng / ml en el grupo de dosis alta (12.5 mg / kg) (Fig. 1B).

2. Efectos renales
La introducción de DOCA / sal en el modelo aumentó la excreción de albúmina urinaria, nefrina
y KIM-1 (Fig. 3 y Fig. 1 complementaria).

Todos los tratamientos activos redujeron la albuminuria a las 2 semanas, pero solo la dosis baja
de CXA-10 (2,5 mg / kg) y enalapril fueron eficaces a las 4 semanas (Fig. 3A; Fig. 1
suplementaria).

La nefrina urinaria elevada, que sugiere una lesión de podocitos, también fue evidente a las 2 y
4 semanas en el modelo (Fig. 3B).
El tratamiento con dosis bajas de CXA-10 redujo la nefrinuria después de 4 semanas, mientras
que el enalapril fue efectivo en las 2 y 4 semanas de tratamiento (Fig. 3B).

La excreción urinaria de KIM-1, un marcador de lesión tubular asociada con regiones de

inflamación y fibrosis, también se incrementó con la administración de DOCA / sal en el
modelo (Fig. 3C). Hubo una tendencia aparente a disminuir el KIM-1 en orina tanto en la dosis
baja de CXA-10 (p <0,1) como en los grupos de enalapril (p = 0,06).