Universidad el Bosque

Programa de Biología
Asignatura: Bioquímica
Docente: Susana Lara
Práctica de laboratorio Nº2. Extracción de fibras de ADN
Cardona Julian C., Santander jorge A., Garcia Alejandro., Ahumada Eliana
20/09/2018
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Resumen:

El ADN, es la estructura que define las características que va a tener un individuo, tanto
genotípicas (internas), como externas (fenotípicas). Esta molécula se compone por
nucleótidos, que a su vez están constituidos por una base nitrogenada, un azúcar y un
grupo fosfato. Para lograr observar las fibras de ADN, en la práctica de laboratorio, se
trabajaron tres sustancias: espinaca y higado de pollo; a cada una se le agregó un buffer
casero previamente preparado, para luego centrifugar los tubos eppendorf con las muestras
y observar el desprendimiento de las fibras. Al final de la práctica se logró observar que las
fibras se desprenden gracias a movimientos circulares que se realizan en el tubo.

Palabras clave:
ADN, fibras, centrifugación, buffer

Abstract:
DNA is the structure that defines the characteristics that an individual will have, both
genotypic (internal), and external (phenotypic). This molecule is composed of nucleotides,
which in turn are constituted by a nitrogenous base, a sugar and a phosphate group. In order
to observe the DNA fibers, in the laboratory practice, two substances were worked: spinach
and chicken liver; a pre-prepared homemade buffer was added to each one, to then
centrifuge the eppendorf tubes with the samples and observe the detachment of the fibers.
At the end of the practice it was possible to observe that the fibers are detached thanks to
circular movements that are made in the tube.

Key words:
DNA, fibers, centrifugation, buffer
Introducción:
Fue en 1865, cuando el padre de la
genética, Gregor Mendel, empezó a
estudiar la bases moleculares de la
herencia basado en su experiencia de
hibridación con plantas ; pero fue hasta
1868 que Watson y Crick quienes
basados en los datos recopilados por
Rosalind Franklin, descubrieron el modelo
molecular del ADN (ácido
desoxirribonucleico) (Solari, 2004). El
ácido desoxirribonucleico, es un ácido
nucleico que se encuentra que contiene
los datos e información genética que se
van a expresar en un individuo. Esta
molécula se encuentra en la célula en
forma de X, también llamado cromosoma,
la cual alberga una estructura
superenrollada, que en los procariotas es
de forma circular y en los eucariotas tiene
enrollamiento de la hélice sobre sí mismo
que observada más de cerca, es una
doble hélice; las cuales se unen mediante
puentes de nitrógeno que se anclan a las
bases nitrogenadas, que pueden ser
purinas (adenina y guanina) o pirimidinas
(citosina y timina). La guanina se une con
la citosina formando tres puentes de
hidrógeno, mientras que la adenina se
una con la timina formando dos puentes
de hidrógeno. En las paredes de las
hélices, se encuentran azúcares, de tipo
pentosa, y un grupo fosfato que se une a
la pentosa en el carbono cinco de esta.
Una base nitrogenada, un azúcar y un
grupo fosfato, forman un nucleótido. Se
sabe también, que el ADN posee tres
tipos de estructuras: la primaria, que es la
secuencia de nucleótidos; la secundaria,
que se constituye por la doble hélice
antiparalela por lo que una va en sentido
5’ - 3’ y la otra en sentido 3’ - 5’, y
finalmente la estructura terciaria que es la
forma en que el ADN se almacena (Singer
& Berg, 2015).
Figura 3. Trituración del material con el
mortero

Figura 1. Unidades básicas que forman el

ADN llamados nucleótidos, hebras
simples de ADN unidos mediante un
azúcar y un grupo fosfato, polimerización
mediante la cual se unen dos hebras
simples, formación de puentes de
hidrógeno y la doble hélice del ADN ya
formada (Alberts, 2008)

Materiales y métodos Figura 4. Pesaje de muestras de hígado de

Para la práctica de laboratorio se realizó
la extracción del ADN de dos productos
orgánicos, los cuales fueron el hígado de
pollo y la espinaca, cada muestra con un
peso de 2,5 g(Fig. 2)
Figura 2. muestras (2.5 g) de Hígado de
pollo y de espinaca.
pollo y espinaca con el buffer.
Posteriormente se procedió a preparar el
Buffer el cual consiste en una mezcla de
agua destilada (120 ml), sal (1,5 g),
bicarbonato de sodio (5 g) y detergente
líquido (5 ml). seguido a esto se adiciono
en un vaso precipitado el cual fue
conservado en un baño de hielo triturado
para controlar su T°
Se mezcló 5 ml del triturado con 10 ml
del tampón frío y se centrifugó a baja
velocidad durante 5 minutos, (Fig. 5) este
proceso se realizó tanto para la espinaca
como para el hígado de pollo.

para este proceso fue necesario cortar el

material en pequeños pedazos y realizar
la trituración del material por medio de un
mortero y un pistilo, con 10 ml de agua
destilada el cual permite romper las
células y exponer así su material genético
(Fig. 3)

Figura 5. Centrifugado a baja velocidad

durante 5 minutos

Al terminar los 5 minutos de centrifugado,
se sacó con la pipeta el sobrante de la
superficie y se retiró 5 ml del caldo
molecular a un tubo de ensayo,
posteriormente fue añadido una pequeña
cantidad de ablandacarnes y después
con una pipeta se adicionan 10 ml de
alcohol frío lentamente por las paredes
del tubo que debe estar inclinado,
evidenciando así la estructura del ADN
(fig. 6). Finalmente, se agita suavemente
por 2 a 3 minutos para extraer fibras
blancas de ADN.
Figura 6. Fibras de ADN en muestras de
hígado de pollo y espinaca
Resultado y análisis
Para poder llevar a cabo la extracción del
ADN se preparó un buffer el cual estaba
compuesto por:
● El bicarbonato de sodio (HCO3) el
cual actúa como un ácido, ya que
tiene la capacidad tanto de
eliminar un protón (H+) y pasar a
ser un carbonato (de fórmula
molecular CO3 -2) como de ganar
un protón y pasar a ser ácido
carbónico, esto se debe a que el
ácido carbónico es muy inestable y
se disocia con facilidad, dándole la
capacidad de actuar en una
solución acuosa como ácido o
base (Cotton,1996)
● Sal de mesa (NaCl) que actúa
como base.
● Detergente líquido, el cual
contiene sodio dodecilo sulfato
(SDS) que se encuentra
normalmente en productos de
aseo personal (Falcón, 2007)
● Agua destilada.
La ruptura de tejidos y paredes celulares
macerando los diferentes compuestos
(Fig. 3) se realiza con el objetivo de
exponer las membranas y su contenido,
sin embargo este método tiene como
desventaja que no permite recuperar ADN
de buena calidad. (Rocha,2002) Posterior
a esto para la liberación de ADN, se hace
uso del SDS que es un detergente iónico,
(posee un grupo ionizado fuerte en su
extremo hidrófilo). Estos detergentes
iónicos desplazan y separan las
moléculas lipídicas entre sí, y separan las
moléculas lipídicas con las proteínas de
membrana, liberando el ADN del núcleo y
la célula contenido celular queda
expuesto liberando el ADN del núcleo.
Cuando las células se rompen, su ADN y
contenido se vierten en el buffer. A
menudo se incluyen además, la ARNasa
(destruye el ARN), las proteasas
(destruye las proteínas), y el SDS. En
conjunto, este caldo de contenido celular,
fragmentos de ARN y proteínas puede
tener un gran impacto en el pH de la
solución. Debido a que el ADN es
sensible al pH, es importante que la
solución buffer regule el caldo y mantenga
el pH en un valor estable (Falcón ,2007).
En el caso de la sal (NaCl), esta, en
particular forma una capa iónica suave
que recubre al ADN protegiéndolo y
ayudando a evitar su degradación
(Rocha,2002)
Las enzimas desoxirribonucleicas
(ADNasas) pueden cortar el ADN en
pedazos como defensa biológica,
evitando que se observe con éxito el
ADN, por esta razón es necesario
desnaturalizarlas por medio de un agente
caotrópico (NaCl) que es una sustancia
que desorganiza la red tridimensional del
agua influyendo en la organización de sus
moléculas a través de sus enlaces de
hidrógeno, y en la interacción de estas
con otros solutos como macromoléculas
tales como proteínas tendiendo a
disolverlas (Bidegain,2016).
posteriormente con el objetivo de retirar
los contaminantes de la muestra de ADN
se usa la centrifugación. (Fig. 5)
El ADN es insoluble en alcohol, por lo que
al verterlo a bajas T° en la sustancia
buffer nos permite ver el ADN con
claridad, gracias a que el alcohol lo
separa de otros componentes celulares,
los cuales son dejados en la solución
acuosa.
De las extracciones de ADN realizadas
(fig. 6), el tejido donde más se evidencio
el ADN fue en hígado, esto pudo deberse
a que en los tejidos vegetales son más
frágiles y la maceración puede afectar en
mayor medida el ADN de estos tejidos
dañándose o separándolo, a diferencia
del tejido del hígado que tiene más
resistencia y el ADN se mantiene de
mejor calidad.
Conclusiones
Se logró el desprendimiento de fibras de
ADN en las tres sustancias, que se
evidenciaron con largas estructuras
fibrilares blancas.
Todos los procesos de extracción, y
purificación se basan en las
características fisicoquímicas del ADN,
que es soluble en soluciones
concentradas de sal pero insoluble en
alcohol. Ya que el bicarbonato de sodio es
una sal de reacción ácida, el ADN se
libera muy fácil en el buffer y en el alcohol
se mantiene compacto sin diluirse, lo que
ayuda al desprendimiento de sus fibras.
Un componente muy común en los
detergentes es el sulfato de sodio, el cual
desempeña una gran labor removiendo
grasas y proteínas que constituyen las
membranas que rodean la célula y el
núcleo. Una vez que estas membranas se
han roto, el ADN es liberado de la célula.
El alcohol cumplió una función de gran
importancia debido a que el ADN junto
con este se precipita y de esta forma
puede ser evidenciado, además separa el
ADN de otros componentes celulares, los
cuales son dejados en la solución acuosa.
Cuestionario
1. Para qué se somete la muestra a
triturado?
➢ Mediante la maceración
generamos el rompimiento de
muchas membranas celulares
como son la pared celular y la
membrana celular generando una
liberación de el contenido nuclear
en el que se encuentra el ADN
2. Cuál es la función del
detergente y las sales?
➢ El detergente líquido ayuda a
romper la bicapa de fosfolípidos de
las membranas plasmáticas y la
envoltura nuclear. La molécula de
ADN es soluble en agua y por
tanto invisible, pero si se pone en
contacto con ADN que haya
estado en un medio salado y
alcohol frío el ADN se vuelve
insoluble y precipita. Por lo tanto el
agua salada ayuda a la
precipitación en el alcohol. La sal
también ayuda a separar el ADN
de las histonas ( Martinez, 2015).
3. Cuál es la función del
ablandacarnes?
➢ Cuando agregamos una pizca de
ablandador de carnes
detenemos a las proteínas
(conocidas como nucleasas)
 para que ADN no sea degradado
Las células se libera una gran
cantidad de proteínas, algunas
de estas proteínas tienen como
función degradar al ADN de
patógenos como son las
bacterias y los virus. Para
evitarlo agregamos el
ablandador de carnes, el cual
contiene proteasas, es decir,
proteínas especializadas en la
degradación de otras proteínas.
En los ablandadores de carnes
usualmente encontramos
papaína, la cual se extrae de la
papaya. Otras fuentes de
proteasas que puedes usar en
vez del ablandador de carnes
son: jugo de piña, solución
limpiadora de lentes de
contacto, y jugo de papaya.
4. Qué papel cumple el alcohol en
la extracción?
➢ El alcohol se utiliza para precipitar
el ADN en la interfase alcohol y
agua debido a que este se vuelve
apolar e insoluble en alcohol, de
esta manera es posible evidenciar
las fibras de ADN ya que se hace
visible porque las diferentes
cadenas se van aglutinando entre
sí al precipitar debido a la acción
de fuerzas físicas . El alcohol es
menos denso que el agua del
extracto y por eso flota sobre la
capa del extracto( Martinez, 2015).
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