You are on page 1of 11

Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

listas de contenidos ofrecidos en ScienceDirect

La catálisis molecular

revista Página de inicio: www.elsevier.com/locate/mcat

modelo de cinética de las enzimática adición de Michael para la síntesis de análogos de mitomicina
catalizada por lipasa inmovilizada de T. laibacchii

Zhang Yuanyuan una , segundo , 1 , Yuanyuan Zhao una , 1 , Xin Gao una , 1 , Jiang Weiwei una , Zewen Li una , Quancai Yao una ,
Fengke Yang una , • , Fanye Wang una , • , Liu Junhong una , •
una Departamento de Ingeniería Farmacéutica de la Facultad de Ingeniería Química, Universidad de Qingdao de Ciencia y Tecnología, buzón 70, 53 Zhengzhou Road, Qingdao,

266042, China
segundo Estado clave Laboratorio de Base Eco-Ingeniería Química en la Facultad de Ingeniería Química, Universidad de Qingdao de Ciencia y Tecnología, buzón 70, 53 Zhengzhou Road, Qingdao, 266042, China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

palabras clave: El presente estudio investiga el modelo cinético de la enzimática adición de Michael de butilamina a 2-metil-
modelado cinético lipasa inmovilizada adición de 1,4-benzoquinona para formar 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1-hidro-4-quinona en bu citrato ff solución er (pH 7,0). Se logró el rendimiento del producto
Michael Modi fi ed azar mecanismo de bi-bi de 98%, debido principalmente a la excelente regioselectividad de la lipasa inmovilizada de
transferencia de masa
T. laibacchii. La preparación inmovilizada utilizado aquí se obtuvo por un método de puri fi catiónico y en la inmovilización situ. A través de los puri fi catiónico
usando un PEG 4000 / K 2 HPO 4 sistema de dos fases acuosas (ATPS), el lipasa T. laibacchii se repartió principalmente en la fase superior rica en
PEG que se añadió tierra de diatomeas de lograr en la inmovilización in situ mediante la activación interfacial sobre el soporte hidrófobo. Un
mecanismo de reacción propuesto de la adición de Michael implica (1) el agujero de oxianión polariza la α, β- carbonilo insaturado de 2-metil-1,4

- benzoquinona, aumentando su capacidad electrófilo, (2) la histidina catalítica desprotona la amina n-butilo nucleófilo. Una modificación fi mecanismo
secuencial ed incluyendo ordenó y se propuso aleatorio bi-bi secuencial para el fi en primer lugar, y es bene fi cial para agregar estas modi fi mecanismos de
cationes a la familia de mecanismo de reacción complejo de la enzima debido a que el mecanismo se expande en parte. Los parámetros cinéticos se
obtienen directamente mediante la combinación de la caja de herramientas ode45 integración numérica para resolver di ff ecuaciones diferenciales y la
optimización no lineal fmincon caja de herramientas para el error minimizar la función objetivo. Un acuerdo muy satisfactorio entre datos y el modelo
resultados experimentales se obtuvo basada en la modi fi ed mecanismo de bi-bi azar, lo que implica que el enzimática Michael adición puede seguir la
modi fi ed mecanismo de bi-bi aleatorio. Las limitaciones de transferencia de masa fueron investigados, y se encontró que ambas limitaciones de
transferencia de masa internos y externos podrían ser ignorados.

1. Introducción y análogos de tratar de mejorar la selectividad anti-tumor. La clave para la síntesis de estos
compuestos se encuentra en la formación de la estructura padre para-benzoquinoidic estable y su
Mitomicinas son una familia de antibióticos con actividad antineoplásica [ 1 ]. La actividad amino funcionalización. aunque electrónico FFI ciente en los términos de formación de esqueleto
biológica de mitomicinas está relacionada principalmente a dos motivos activos: uno es una farmacológicamente activo esencial, el enfoque químico para sintetizar mitomicinas presenta varios
estructura de matriz para-benzoquinoidic y el otro es un grupo funcional aminación [ 2 ]. La mitomicina inconvenientes tales como la mala selectividad, etapas de reacción tediosas y condiciones fuertes [ 6 , 7
C (MMC) es uno de los miembros importantes de mitomicinas que ha sido ampliamente utilizado ]. Método enzimático puede superar los problemas mencionados anteriormente en términos de alta
como un medicamento contra el cáncer para el tratamiento de diversos tumores asociados con quimioselectividad, regioselectividad y estereoselectividad, alto e FFI eficiencia, condiciones de
gástrico, pancreático, colorrectal, de mama, pulmón y et al. [ 3 , 4 ]. Aunque MMC es generalmente reacción suaves,
reconocido como uno de los más correo ff medicamentos contra el cáncer ectantes, su aplicación
clínica es limitada debido a su alta toxicidad que causa grave e adverso ff ECTS [ 5 ]. Desde su y las propiedades del medio ambiente-benignos [ 8 , 9 ]. lacasas
descubrimiento, una gran parte de la atención ha sido atraída a la búsqueda de sus derivados (EC1.10.3.2) están multicobre que contienen polifenol oxidasas (PPO), que catalizan la oxidación de
un electrón de fenoles para producir radicales fenoxi como los productos de oxidación primarios
(semi-quinona)

• los autores correspondientes.

Correos electrónicos: ywang8209@163.com (F. Yang), fywang8209@163.com (F. Wang), zljh06@163.com (J. Liu).
1 Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo y deben ser considerados co- fi autores primero.

https://doi.org/10.1016/j.mcat.2019.01.017
Recibido el 18 de de octubre de de 2018; Recibido en forma 30 de noviembre 2018 revisado; Aceptó 16 de enero de 2019
2468-8231 / © 2019 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

2 mlU- 1 h- 1
Nomenclatura
K 10 parámetro cinético, mM - 3, o energía de activación, J mol- 1 K- 1
[UNA] La concentración de 2-metil-, 4-benzoquinona, mM [A 0] K 11 K 13 factor de pre-exponencial, mM - 2 mlU- 1 h- 1
concentración inicial de 2-metil-, 4-benzoquinona, mM [B] K 12 K 14 energía de activación, J mol - 1
La concentración de amina n-butilo, mM [B 0] ΣK Suma de Kappa P constante 1
Concentración inicial de amina n-butilo, mM K 1 Producto do

parámetro cinético, mM - 1 PAG 2 Producto re

K2 parámetro cinético, mM - 1 R constante de los gases, mol 8.314J - 1 K - 1

K3 parámetro cinético, mM - 1 Y1 El rendimiento del producto c,%

K4 parámetro cinético, mM - 2 Y2 rendimiento del producto d,%

K5 parámetro cinético, mM - 2 Y ijk estim Rendimiento estimado, i = 1, 2, para el producto do y re j = 1,2,3, es decir, 40 ° C, 45 ° C,
50 ° C; k es puntos experimental, k = 1, ... 12 Y ijk exp
K6 parámetro cinético, mM - 2, o mm- 3
K7 parámetro cinético, mM - 3, o factores pre-exponenciales, mm- rendimiento Experimental, i = 1, 2, para el producto do y re
2 mlU- 1 h- 1
j = 1,2,3, es decir, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C; k es puntos experimentales, k = 1, ... 12 t

K8 parámetro cinético, mM - 3, o energía de activación, J mol- 1 K- 1


K9 parámetro cinético, mM - 4, o factores pre-exponenciales, mm- Tiempo, hora

típicamente seguido por varios C mi C, C mi N o C mi reacciones de acoplamiento O y de forma que puede conducir a una visión más profunda en el diseño de equipos y mecanismo de reacción de
concomitante reducir el oxígeno molecular al agua [ 10 - 12 ]. En los últimos años, lacasa mediada C mi N la adición de Michael enzimática. Los modelos cinéticos de hidrólisis y esterificación fi cación
reacciones de acoplamiento han sido ampliamente investigada. Manda et al. [ 13 ] Han utilizado con catalizada por lipasas han sido ampliamente estudiados [ 21 - 23 ]. A lo mejor de nuestro conocimiento,
éxito una lacasa fúngica de Trametes villosa para mediar la oxidación y de acoplamiento cruzado de sin embargo, los métodos de modelización de la adición de Michael enzimática son escasos en la
dos derivados de ácido benzoico para-dihidroxilado con 4-aminobenzoico ácido para producir literatura.
derivado aminobenzoquinones. Los compuestos de mitomicina-como incluyendo [5-alquilamino 1 , 4 ]
-benzoquinones y 2,5-bis (alquilamino) - [ 1 , 4 ] -Benzoquinones, se sintetizaron por acoplamiento Las lipasas de T. laibacchii utilizado en el presente estudio son enzima lipolítica intracelular que
heteromolecular de 2-metoxi-3-metilhidroquinona con primaryamines mediadas por M. thermophila lacasa se han utilizado con éxito en la resolución de ketoprofeno [ 24 ], La síntesis estereoselectiva de
(MTL) y P. cinnabarinus lacasa (PCL), respectivamente [ 14 ]. Sin embargo, la formación de producto y 1,3oxathiolane quiral [ 25 ] Y la directa in situ de polimerización de apertura de anillo de
el rendimiento fueron signi fi cativamente depende de la fuente de lacasa y su pH que resulta en una
escasa selectividad, menor rendimiento y subproducto indeseable. Herter et al. [ 14 ] encontrado que M. ε- caprolactona [ 26 ]. Es bien sabido que las lipasas son capaces de actuar en la superficie de gotas
thermophila lacasa resultó en los productos monoaminated como principal producto con un de aceites y tienen un mecanismo de acción denominado activación interfacial [ 27 ]. Hay dos di ff formas
rendimiento de 32,9%, así como subproducto (no fue elucidada en su estudio) en su pH óptimo de Erent de lipasas, incluyendo de forma cerrada en el que el centro catalítico hidrófobo es bloqueado
7,0. usando una relación 1: 5 mM de fenoles aminas toprimary después de 6 h, mientras P. por una cadena de polipéptido, denominado tapa, y la forma abierta en la que esta tapa se desplaza
cinnabarinus lacasa resultó en los productos diaminado como principal producto con un rendimiento la exposición de una muy gran bolsillo hidrófobo para el medio [ 28 , 29 ]. En presencia de una
de más de 84% y los productos monoaminated menores (se generaron en una proporción de 10: 1) superficie hidrófoba, la forma abierta de la lipasa queda adsorbido a través de este gran bolsillo
en su pH óptimo de 5,0 bajo las mismas condiciones. hidrofóbico. Esto permite que las lipasas pueden Do ff er activación interfacial con di ff superficies
hidrófobas Erent tales como un soporte hidrófobo [ 30 , 31 ] Y producir su activación hiper en muchos
casos y la sintonización de las propiedades de la enzima [ 32 ].

Las lipasas son las enzimas versátiles más utilizados en la síntesis orgánica principalmente la inmovilización de enzimas se ha presentado como una herramienta poderosa para mejorar las

debido a su selectividad, la disponibilidad de un gran número de preparaciones comerciales, ancho propiedades de la enzima incluida la estabilidad, la actividad, selectividad o especificidad fi ciudad, resistencia

especí fi ciudad y alta estabilidad frente a disolventes orgánicos, extremos de temperatura y pH [ 15 ]. a los inhibidores o los productos químicos y reutilización [ 33 , 34 ]. En nuestro trabajo anterior, nos acoplamos

El concepto de la promiscuidad ha sido percibida como un fenómeno útil que puede aumentar la puri fi catión / inmovilización de T. laibacchii lipasas a través de control del proceso de inmovilización (véase la

utilidad de la lipasa como biocatalizador [ dieciséis ]. Las lipasas han atraído una amplia atención Sección

como biocatalizadores promiscuos que muestran buenas capacidades catalíticas en C mi formación 2.1 ). A través de los puri fi catiónico usando un PEG 4000 / K 2 HPO 4 sistema bifásico acuoso (ATPS),
de enlace C, C mi formación de enlace heteroátomo (por ejemplo, C mi N, C mi O, C mi S acoplamiento), el lipasa T. laibacchii se repartió principalmente en la fase superior rica en PEG que se añadió tierra
los procesos oxidativos, y novedosos reacciones hidrolíticas [ 17 ]. Michael reacciones han sido de diatomeas de lograr en la inmovilización situ. El inmovilizado de T. laibacchii lipasas sobre el
ampliamente reportado en muchos documentos recientes. el inmovilizado Thermomyces lanuginosa lipasa apoyo diatomita que sea fácilmente recuperados por fi filtración. La diatomita es [hidrófobo 35 ] Que
(TLL) se utilizó para catalizar la reacción de Michael de compuestos de metileno activos a chalconas, puede ser utilizado para mantener los residuos implicados en la adsorción dentro de un entorno muy
lo que resultó en el más alto rendimiento de 94% [ 18 ] .El anticoagulante warfarina se sintetizó con hidrófobo, reduciendo su exposición al ataque de los inhibidores de la [ 36 ].
éxito a través de la adición de Michael de 4-hidroxicumarina a α, β- enonas insaturados en medio
orgánico mediante el uso de páncreas porcino lipasa (PPL) como un biocatalizador [ 19 ]. Souza et al.
ha informado de reacciones de Michael catalizada por lipasa entre aminas primarias o secundarias y la especificación fi c particularidades activación interfacial se han utilizado para purificar y / o
acrilonitrilo para obtener los aductos de Michael en el tiempo de reacción más corto que las inmovilizar lipasas. Fernández-Lafuente et al. [ 37 ] Informó de que la adsorción de la lipasa en
reacciones no catalizadas [ 20 ]. soportes hidrófobos en fuerza iónica baja no es una adsorción hidrófobo convencional, pero un una FFI
proceso interfacia nidad. Ellos encontraron que entre las proteínas solubles en agua, solamente
lipasas son capaces de convertirse adsorbido en un soporte moderadamente hidrófobo. Por lo tanto,
se deduce que T. laibacchii lipasas pueden ser inmovilizadas a través de la activación interfacial
sobre diatomita hidrófobo [ 38 ]. Esto fue considerado como un protocolo mucho utilizado porque
Este estudio presenta el uso de T. laibacchii lipasa, como un catalizador alternativo para la permite, en un solo paso, para inmovilizar y estabilizar la forma abierta de la lipasa [ 39 ].
reacción de adición de Michael de 2-metil-1,4-benzoquinona con la amina de n-butilo para producir
2-metil-3- norte- butylaminoyl-1hydro-4-quinona ( do). evaluación cinética y la simulación del proceso de
biocatalytical es de gran importancia en el diseño experimental de ampliación, El glutaraldehído es una herramienta versátil en la inmovilización de enzimas que ha sido ampliamente

utilizado como agente de reticulación de proteínas, activador de soportes, y

147
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

agente de reticulación de las enzimas y los soportes [ 40 ]. En el presente estudio, el glutaraldehído se y se analizó por HPLC. Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado.
usa como un agente de reticulación de T. laibacchii lipasas y diatomita apoya con el fin de evitar la Después de la reacción, la mezcla de reacción era fi infiltrado para eliminar la lipasa inmovilizada
lixiviación de las lipasas a partir de los soportes y por consiguiente mejorar la estabilidad de y después se extrajo tres veces con acetato de etilo. La fase orgánica se combinó, se secó sobre
inmovilizado T. laibacchii lipasas. Esta estrategia se ha utilizado en varios ejemplos en los que las MgSO 4 y fi finalmente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó fi ed por cromatografía en
enzimas adsorbidas fueron reticulado usando glutaraldehído para mejorar la retención de las columna de gel de sílice con éter de petróleo y acetato de etilo como disolvente de elución a una ff ord
enzimas sobre los soportes [ 41 - 43 ]. Por otra parte, se informó por Izquierdo et al. que las actividades el producto 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1hydro-4-quinona. El rendimiento de los productos se
promiscuos de lipasas se pueden sintonizar a través de la inmovilización sobre el soporte adecuado [ 44 determinó por análisis de HPLC como se describe en la Sección de 2.6 .
]. La adsorción de moléculas de CALB por activación interfacial de la forma abierta de la lipasa sobre
el soporte de poliestireno-divinilbenceno puede ayudar a generar un grupo especialmente reactivo
sobre la superficie de la enzima por exposición de aminoácidos laterales de ácido cadenas de
residuos tales como Lys, His, Arg a la medios de reacción mayor o la generación de entornos 2.3. Los experimentos de transferencia de masa interna y externa

especiales [ 45 ].
di externa ff experimentos derrame se realizaron a di ff Erent velocidades para investigar el correo ff ect
de velocidad de rotación de una cama de agitación orbital sobre el rendimiento. En el interior di ff experimento
El objetivo principal de este estudio es sintetizar 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1-hidro-4-quinona derrame, di ff Erent tamaños de lipasa inmovilizada se utilizaron para investigar el correo ff ect de tamaño
mediante el uso de un inmovilizado T. laibacchii de partícula en el rendimiento. Otras condiciones experimentales son las mismas que la Sección 2.2 .
lipasa como catalizador en bu citrato ff er solución e informar de un nuevo modelo cinético basado en
una modificación fi ed mecanismo de bi-bi secuencial aleatorio para simular el proceso general de
adición de Michael entre la benzoquinona y la butilamina. 2.4. ensayo de actividad de lipasa

actividad de la lipasa se ensayó mediante el uso de "emulsionante de oliva fi método catión" como
2. Experimental se describe anteriormente [ 47 ]. Se llevó a cabo como sigue: 1 ml de solución de enzima, emulsión 5
ml de aceite de oliva 25 ml (y 75mL2% de alcohol de polivinilo, MW aprox 72 000 emulsionante. fi ed en
2.1. Enzimas y productos químicos un homogeneizador a 20 000 rpm), y 5 ml bu ff er (BU fosfato ff er pH 8,0) se mezclaron y se incubó en
un baño de agua con agitación a 40 ° C durante 10 min. La reacción se detuvo mediante la adición de
2- benzoquinona metil-1,4- ( una, 98%) y n-butil amina ( segundo, 99,7%) reactivo de parada 15 ml (95% de etanol). La muestra y una muestra en blanco (parada de reactivo
ambos fueron comprados a Shanghai Aladdin Tecnología Bioquímica Co, Ltd, China. Todos los otros añadido antes de la emulsión) se titularon con
productos químicos de grado analítico o más puro utilizado se adquirieron de proveedores
comerciales y se utilizaron sin más puri fi catión. Una lipasa inmovilizada de Trichosporon laibacchii (T. 0,01 mol L - 1 NaOH utilizando fenolftaleína como indicador untilit se vuelve rosa. Una unidad de
laibacchii) CBS5791 con 1.280 U g - 1 se utilizó. Esta preparación inmovilizada se obtiene por un actividad (U) de la lipasa se De fi define como la cantidad de enzima requerida para catalizar aceite de
método de puri fi catiónico y en la inmovilización in situ como se describe en nuestro trabajo previo [ 46 ]. oliva sustrato para hidrolizar para producir 1 μ mol de ácido graso libre por minuto a 40 ° C y pH 8,0.
La lipasa intracelular bruto se sometió a purificación parcial fi catión por un sistema de dos fases
acuosas (ATPS) que consiste en 12% (w / w) de polietilenglicol (PEG) 4000 y 13% (w / w) de fosfato
de potasio (K 2 HPO 4) y después en la inmovilización in situ directamente sobre diatomita de la 2.5. inhibición irreversible por reacción con paraoxón
PEG-fase rica en la parte superior de ATPS. Un protocolo para puri acoplado fi catión / inmovilización
de T. laibacchii lipasa fue como sigue: se añadió 1,8 g de lipasa en bruto (homogeneizado de células) Las reacciones se realizaron utilizando el inmovilizada T. laibacchii
a un sistema de cantidades apropiadas de fosfato PEG / potasio y después se añadió agua lipasa, en bu citrato ff er (pH 7,0) y un co-disolvente, metanol (2 - 4%, v / v). La mezcla de reacción (10
desionizada para dar un peso total de 10,0 g para generar una fi sistemas de dos fases acuosas NAL ml) contenía 25-50U ml - 1 de biocatalizador, y 0,01 mM de paraoxón. La reacción entre paraoxón y la T.
que contienen PEG 4000 (12%, w / w) y fosfato de potasio (K 2 HPO 4, 13%, w / w). Los sistemas se laibacchii lipasa se lleva a cabo a 25 ° C con agitación durante 50 min.
mezclaron durante unos pocos segundos en un mezclador de vórtice, después se centrifugaron a
temperatura ambiente durante 5 min a 3000 rpm para acelerar la separación de fases. La fase
superior se pipeteó cuidadosamente y se pesa. A 20 ml de la fase superior que contiene lipasa, 2.6. El análisis por HPLC

cantidades apropiadas de la diatomita seguidor (seguidor de 0,8 mg por unidad de actividad de la


lipasa) se añadió y la mezcla resultante se incubó a 30 ° C y 150 rpm durante 2 h. A partir de Las muestras se analizaron por HPLC (Agilent1200series, las tecnologías de Agilent, Inc., Santa
entonces glutaraldehído (GA) con una fi concentración final 0,2% (v / v) se añadió, y después la Clara, EE.UU.) en una columna Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18 (250 × 4,6 mm, 5 μ metro). La fase
mezcla resultante se agitó durante 2 h a 25 ° C. Finalmente, se obtuvo el lipasa inmovilizada después móvil era una mezcla de metanol: agua (80:20, v / v) y la Florida velocidad de flujo era de 0,5 ml min - 1. El
de fi filtración en vacío, lavando con bu fosfato ff er y el secado por vacío. volumen de muestra fue de 5 μ L. La columna se mantuvo a 30 ° C y la longitud de onda de detección
fue de 227 nm. Los tiempos de retención de 2-metil-3-

norte- butylaminoyl-1-hidro-4-quinona ( do) y 2-metil-3,5- norte- butylaminoyls-1,4 -benzenediol ( re), eran


3.602 y 3.803min, respectivamente.

3. modelado cinético

2.2. Catalizada por lipasa la adición de Michael de la amina de n-butilo a 2- metil- 3.1. Mecanismo de reacción y modelado cinético
1,4-benzoquinona
La reacción investigado era un enzimática la adición de Michael de la amina de n-butilo ( segundo)
2-metil-3- norte- butylaminoyl-1-hidro-4-quinona ( do) se sintetizó utilizando un recipiente de a 2-metil-1,4 -benzoquinone ( una) para formar 2-methyl3- norte- butylaminoyl-4-hidro-1-quinona ( do) catalizada
reacción de 20 ml a través de la reacción de adición de Michael de la amina n-butilo ( segundo) a por la lipasa inmovilizada de T. laibacchii, la ruta de reacción propuesto para esta reacción se ilustra
2-metil-1,4 -benzoquinone ( una). Las reacciones se realizaron utilizando el inmovilizada T. laibacchii lipasa, en la Esquema 1 . En la adición de Michael, dos productos de reacción se pueden producir
en bu citrato ff er (pH 7,0) y un co-disolvente, metanol (2 - 4%, v / v) que se añadió para ayudar a la dependiendo de las condiciones de reacción, tales como la enzima, la temperatura, pH del medio de
disolución de los sustratos. La mezcla de reacción (10 ml) contenía 25-50U ml - 1 del biocatalizador. reacción, etc, aducto de Michael do
Las reacciones se realizaron a 40 - 50 ° C y se agitó a 200 rpm en un agitador de baño de agua
durante 20 - 24 h. Las muestras fueron retiradas a especí fi intervalos de tiempo c de masa de reacción debido a la adición de Michael de segundo a una, y el producto di-Michael re por una reacción de doble

Michael, entre una y segundo formar do y una posterior adición de Michael de segundo a do, Si la

regioselectividad de la lipasa utilizada favorecida

148
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

sigue básicamente dos tipos de mecanismos: el ping-pong mecanismo de bi-bi (no secuenciales) [ 50 - 52
] Y el mecanismo de complejo ternario,
es decir, el mecanismo secuencial incluyendo ordenados y Bibi secuencial aleatorio [ 53 - 56 ]. Para la
adición de Michael de la amina de n-butilo ( segundo) a 2-metil-
1,4 -benzoquinone ( una), Sin embargo, un ping - bi-pong - mecanismo bi puede ser no es adecuado
debido a que los sustratos carecen de un grupo saliente. De acuerdo con nuestro conocimiento, una
modificación fi bi azar ed - bi o una modi fi ed ordenó mecanismo de bi-bi puede ser adecuado, por lo
tanto, se estudiarán los dos mecanismos en el presente trabajo de revisar el mecanismo que es
exactamente adecuado para los datos experimentales.

Para el modelo de cinética de catalizada por lipasa de adición de Michael, se hacen las
siguientes suposiciones:

(1) El modelo cinético establecido es un modelo de cinética de reacción inherente.


Los resultados experimentales preliminares muestran que el aumento de la velocidad de
agitación (véase el capítulo 4.1.2) no una ff ect el rendimiento del producto do, lo que indica que la
reacción no se controló por di externa ff derrame. La reducción del tamaño de partícula (ver el
capítulo 4.1.1) de catalizador de lipasa inmovilizada no una ff ect el rendimiento también, lo que
Esquema 1. síntesis catalizada por lipasa inmovilizada de 2-metil-3- norte- butylaminoyl-4-hidro-1 - quinona ( do) sugiere que la reacción no pertenecía a di interna ff control de derrame. Por lo tanto, los
por la adición de Michael de 2-metil-1,4-benzoquinona ( una) con la amina de n-butilo ( segundo). experimentos de cinética de reacción en este trabajo no eran tanto en el di interna y externa ff regiones
de control de derrame, y el modelo cinético establecido era un uno cinética intrínseca. (2) El
último paso es una reacción irreversible donde el producto do es pro-
efectuar la aducción c, c será generado a ocupar la mayor parte, de lo contrario, la regioselectividad
disminución puede causar aumento de la formación de subproducto
re. El producto objetivo do es más fácil de ser oxidado a 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1,4-quinonas ducido.
que es un análogo de la mitomicina. (3) En el intervalo de concentración de sustrato utilizado, la inhibición de sustrato
Con el fin de estafar fi rm que la reacción de adición de Michael estudiadas en el presente coul ser ignorado. Los resultados de los experimentos preliminares en la concentración de
documento se produjo mediante catálisis de T. laibacchii lipasa centro activo, paraoxón que ha sido sustrato variada muestran que la inhibición de sustrato podría ser ignorado (véase el capítulo
verificación fi ed para ser un inhibidor irreversible de la lipasa mediante la modificación de residuo de 4.4).
serina Ser105 [ 48 , 49 ] Fue utilizado para inhibir irreversiblemente la actividad de T. laibacchii lipasa. (4) No hay pérdida de actividad de la enzima durante toda la reacción. De hecho, la
el inactivada T. laibacchii lipasa por paraoxón se utilizó para catalizar la adición de Michael de la actividad de la lipasa inmovilizada restante de T. laibacchii fue de más de 92% después de una
amina de n-butilo a 2- benzoquinona metil-1,4- como se describe en 2.2. En otro experimento, la carrera, por lo que la pérdida de la actividad enzimática podría ser ignorada.
diatomita soporte tratado con glutaraldehído pero sin T. laibacchii lipasa se añadió a la mezcla de
reacción para con fi rm que la lipasa juega algún papel en esta reacción. Los resultados se muestran
en la Tabla 2 . Como se ve desde Tabla 2 , Ningún producto se formó en la reacción de control, cuando Es bien sabido que la lipasa es una de α / β- enzimas hidrolasa veces que contiene dos
sólo diatomita trató con se añadió glutaraldehído sin lipasa. Esto indica que se trata de la T. laibacchii lipasa dominios: un dominio catalítico y un dominio de tapón o tapa. En el dominio catalítico hay una
que cataliza la reacción. Cuando esta reacción se preformados usando paraoxón inhibida T. laibacchii maquinaria catalítica núcleo: la tríada catalítica Ser-HisAsp y el agujero de oxianión que contiene
lipasa, no se formó ningún producto. En contraste, el producto C con rendimiento de 51,6% se formó parte del sitio de unión del sustrato. La lipasa cataliza una adición de Michael con ácido en general - catálisis
en presencia de T. laibacchii lipasa solamente. Es tal vez la conclusión de que el residuo activo de básica en la que no se forma ninguna enzima acil porque los sustratos carecen de un grupo saliente [ 57
serina (Ser105) de la T. laibacchii lipasa jugar papel crítico en la presente reacción promiscua. ]. Para el enzimática adición de Michael de butil amina a 2-metil-1,4-benzoquinona por lipasa de T.
laibacchii, se propone un mecanismo de reacción tentativa como sigue: la adición de Michael implica
(1) el agujero de oxianión polariza la

α, β- carbonilo insaturado de 2-metil-1,4 -benzoquinone, aumentando su capacidad electrófilo para


Es bien informó que la catálisis de lipasa que involucra a dos sustratos ayudar a la formación del intermedio enolato, (2) la

Esquema 2. La representación esquemática general de la modi fi ed mecanismo de bi-bi aleatorio.

149
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

más probable orden de sustratos a la enzima de unión. Así, dos modelos con di ff Para Erent están
configurados de la siguiente manera:

3.1.1. modi fi azar ed mecanismo de bi-bi ( esquema 2 )


Tomando la modi fi ed mecanismo de bi-bi azar como un ejemplo, se estableció la ecuación
cinética de la reacción.
Como se muestra en esquema 2 , El mecanismo se supone que consisten en la
siguiente pasos: sustrato 2-metil-1,4 -benzoquinone [A] se une fi RST para la enzima [E] para formar
la benzoquinona - lipasa complejo binario [EA]. El agujero oxianión polariza la α, β- carbonilo insaturado
de 2-metil-
1,4 -benzoquinone, aumentando su capacidad electrofílico, la benzoquinona polarizada se llama Un ', Por
lo tanto, la benzoquinona - lipasa complejo binario se expresa como [EA ']. En el segundo paso, n-butil

Esquema 3. Los esquemas Rey-Altman de la modificación fi ed mecanismo de bi-bi aleatorio. amina [B] reacciona con el benzoquinona - lipasa complejo binario, y la histidina catalítica desprotona
el nucleófilo amina n-butilo, similar a una ', la amina desprotonada se denomina B ', el complejo binario
es [EB '] antes de cualquier reacción tiene lugar para formar el producto intermedio de complejo
ternario [EA ' segundo '], que da la enzima - do complejo [EP 1]. Instantáneamente, el producto
histidina catalítica desprotona la amina de n-butilo nucleófilo. Entonces, desprotonado amina n-butilo
monoaminated [P 1] se forma y libera con la restauración de la enzima [E], es un enzimática adición de
se añade a la benzoquinona polarizada. Después de la adición del nucleófilo en C 3 de la
Michael. Por otro lado, n-butilo amina [B '] también concede al complejo [EP 1] para formar otro
benzoquinona, la histidina protonado protona el α- de carbono de la benzoquinona, se genera un
complejo [EP 1 SEGUNDO']. Como resultado, la enzima - re complejo [EP 2] se forma seguido de la
doble enlace y los enol y carbonilo interconvierte estructura. En la reacción de adición de Michael, no
formación y liberación de un producto diaminado [P 2] y la enzima, es una reacción enzimática doble
enzima acil se genera debido a no grupo saliente.
Michael.

De acuerdo con el mecanismo de reacción, el sustrato A se une para la lipasa E para formar EA,
y la interacción de la enzima con A hace que A A convertido 'por lo que EA también transforma a EA',
De acuerdo con la modificación fi ed mecanismo de bi-bi azar, sustrato n-butilo amina [B] se une fi
pero es obvio que no hay grupo saliente. EA' se une a B para formar EA'B ( esquema 2 ). Del mismo
RST para la enzima [E] también para formar el complejo aminelipase [EB], entonces se convierte en
modo, E interactúa con B, por lo que se convierte en B B'. EA'B continuación, convierte a EA'B', y la
EP complejo-producto enzimático es fi finalmente producido. Desde el mecanismo de reacción el complejo [EB '] cuando la histidina catalítica desprotona la amina nucleófilo n-butilo y la amina

podemos ver que no es un mecanismo de bi-bi típico de ping-pong, debido a que el mecanismo tiene desprotonada se denomina B '. La benzoquinona [A] a continuación, se une a la amina - enzima

dos características: (1) hay un grupo saliente rápido, es decir, un producto se libera entre las complejo binario [EB '], a continuación, el agujero de oxianión polariza la benzoquinona para formar el

adiciones de dos reactivos, y (2) no complejo enzimático ternario EAB se produce. Por otra parte, producto intermedio de complejo ternario [EA ' segundo '], que da la enzima - do complejo [EP 1]. A

debido a que el complejo enzimático ternario es EA'B', en lugar de EAB, este mecanismo no continuación, el producto monoaminated [P 1] está formado y libera con la restauración de la enzima

pertenece a un mecanismo secuencial típico (ordenada o aleatoria secuencial bi-bi), como el [E]. Los siguientes pasos son similares a los pasos anteriores, el producto P 1, PAG 2 se formaron una
mecanismo secuencial se caracteriza por la formación de la EAB complejo enzimático ternario. El tras otra, y la enzima se regenera, respectivamente. En este trabajo las ecuaciones de cinética de
mecanismo de reacción parece estar en algún lugar entre el mecanismo bi-bi ping-pong y un reacción se establecen mediante la adopción de enfoque King-Altman. Residencia en esquema 3 , Las
mecanismo secuencial. El mecanismo de reacción de complejo enzima sustrato no contenía esta expresiones cinéticas correspondientes se derivan. Después de una gran cantidad de manipulación
situación para la reacción sin embargo, cuando se propuso en el siglo pasado. Así, fi ed ping-pong algebraica las siguientes ecuaciones de velocidad para la modificación fi ed se obtuvieron mecanismo
mecanismo de bi-bi o una modi fi ed mecanismo secuencial que incluye una modi fi ed azar mecanismo bibi azar: [A] = [A 0] ( 1-Y 1- Y 2)
de bi-bi y una modi fi ed ordenó bi-bi. Es bene fi cial para agregar estas modi fi mecanismos de cationes
a la familia de mecanismo de reacción complejo de la enzima debido a que el mecanismo se
expande en parte.

(1)

[B] = [B 0] ( 1-Y 1- 2Y 2) (2)

Σ K = K 1+ K 2 [ A] + K 3 [ B] + K 4 [ A] [B] + K 5 [ B] [B] + K 6 [ A] [A] + K 7 [ A] [B] [B] + K 8 [ A] [A] [B] + K 9 [ A] [A]


[B] [B] + K 10 [ B] [B] [B] (3)
De hecho, cuando enzima se une al sustrato, tendrán obviamente interactuar. ¿Cómo se dè fi NE
A '? En otras palabras, ¿en qué medida una transformación para ¿qué opinas A A convertido '? Tal dY 1 / dt = K 11 exp (-K 12 / RT) [A] [B] [E 0] / [ UNA 0] / Σ K (4)
vez el rompecabezas puede ser que el mecanismo de reacción se ocupará.
dY 2 / dt = K 13 exp (-K 14 / RT) [A] [B] [B] [E 0] / [ segundo 0] / Σ K (5)

Para el mecanismo cinético de la catálisis enzimática, el orden de unión a la enzima sustrato es Cuando las ecuaciones. (4) y (5) representar las velocidades de reacción de producto do y re,

importante. Para esta reacción, el sustrato 2-metil-1,4-benzoquinona A y sustrato n-butil amina B, lo respectivamente, que constituyen un di ff ecuación diferencial de conjunto con un total de 14 parámetros del
que es el orden de su unión a la lipasa? El problema es indistinta, y hay varias posibilidades. Por modelo.
ejemplo, el benzoquinona fi primero se une a lipasa para formar la benzoquinona - lipasa complejo Con el fin de representar la sensibilidad a la temperatura de la reacción, las constantes de
binario, y luego la amina reacciona con el complejo; o, la secuencia de la benzoquinona o se une la velocidad aparente se expresan en términos de temperatura por una expresión de
amina para la lipasa es aleatoria. Para este estudio, técnicas experimentales existentes no podrían Arrhenius-similares. En el presente trabajo el diagrama King-Altman utilizado se elaboró ​basa en una
ser capaz de determinar qué sustrato reacción reversible y las ecuaciones cinéticas se obtuvieron basa el diagrama fi en primer lugar.
Entonces, considerando una reacción irreversible donde fi se formó producto final, los elementos de
reacción inversa que corresponden al producto se retiran de las ecuaciones establecidas. Por lo
fi primero se une a la enzima, es decir, el orden de unión del sustrato a la lipasa no puede ser tanto, sólo los términos y parámetros relacionados con reacciones directa permanecieron en las
experimentalmente identi fi ed. Sin embargo, un modelo cinético de reacción puede ayudarnos a ecuaciones cinéticas. De acuerdo con el enfoque del Rey-Altman, muchos elementos en la molécula
explorar esta cuestión. Podemos establecer un modelo cinético correspondiente de acuerdo con el de las ecuaciones cinéticas no aparecen, sin embargo, y sólo un elemento, tal como K 11 exp (-K 12 /
orden de enlace de di ff Erent sustratos para la lipasa. Entonces, de acuerdo a la comparación de los
valores simulados del modelo con los datos experimentales, podemos especular del

RT) [A] [B] [E 0] fue mantenido.

150
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

3.1.2. modi fi ed ordenó mecanismo de bi-bi


El procedimiento muy similar utilizado para derivar las ecuaciones. (3) - ( 5) se puede utilizar para
derivar una relación para las ecuaciones de velocidad para la modi fi ed ordenó mecanismo de bi-bi
puede ser obtenido. los Esquemas 4 y 5 mostrar la representación esquemática y los esquemas
Rey-Altman de la modificación fi ed ordenó a uno bi-bi, respectivamente.

Con un total de 10 parámetros del modelo, las ecuaciones de velocidad para la modi fi ed ordenó
mecanismo de bi-bi son los siguientes:

Σ K = K 1+ K 2 [ A] + K 3 [ B] + K 4 [ A] [B] + K 5 [ B] [B] + K 6 [ TEJIDO] (6)


Esquema 5. Los esquemas Rey-Altman de la modificación fi ed ordenó mecanismo de bi-bi.

dY 1 / dt = K 7 exp (-K 8 / RT) A] [B] [E 0] / [ UNA 0] / Σ K (7)

dY 2 / dt = K 9 exp (-K 10 / RT) [A] [B] [B] [E 0] / [ segundo 0] / Σ K (8)

3.2. Estimación de parámetros cinéticos en las ecuaciones de velocidad de reacción

Los parámetros cinéticos de las ecuaciones de velocidad de reacción se estimaron mediante la


combinación de di ordinaria ff ecuaciones diferencial solucionador con el método de optimización. Los
parámetros del modelo (K 1 ... K 14) se estimaron a partir fi tting los datos experimentales través de la
minimización de la función objetivo: F = ΣΣΣ ABS ((Y estim

ijk - Y exp ijk) / Y estimijk) * 100 (9)

Los valores absolutos de la di ff rencia entre el predichos y los valores experimentales se


utilizaron para expresar la desviación entre ellos, porque el uso de valor absoluto para expresar la
desviación no es aumentar la no linealidad de la desviación y bene fi CIAL para el cálculo. La suma de Figura 1. El e ff ect de diámetro de partícula en el rendimiento del producto do.
los cuadrados de las desviaciones generalmente aumenta la no linealidad de la desviación, lo que Temperatura, 50 ° C, velocidad de agitación, 200 rpm.

aumenta la di FFI cultad de optimización no lineal. Obviamente, utilizando el valor absoluto de la


desviación en lugar del cuadrado de la desviación es ventajoso a la informática. Debido a que hay
methylquinone eran 50 U ml - 1 y 0,10 mM, respectivamente, y la relación de amina n-butilo a la
dos desviaciones positivas y negativas, si simplemente se agregan entre sí, se contrarrestan entre sí.
methylquinone era 1,05. Se puede observar a partir Figura 1 , Había una insignificante e ff ect de di
A pesar de que la desviación de la raíz cuadrada media hacen todos los valores positivos, aumenta
interna ff transferencia de masa usional en Y 1, El rendimiento del producto do cuando el tamaño de
la no linealidad de los datos, para evitar la junta ff conjunto de desviación positiva y negativa, se utilizó
partícula estaba en el intervalo de 0,1 - 0.5mm.When el tamaño de partícula fue de más de 0,5 mm, sin
el valor absoluto de la desviación que puede hacer que todos los datos positivo.
embargo, el rendimiento disminuye gradualmente con el aumento del tamaño de partícula. Esto indica
que la reacción se controla mediante el di interna ff transferencia de masa usional si el tamaño de
partícula es más de 0,5 mm. En la reacción, donde el tamaño de partícula inmovilizada T. laibacchii lipasa
de la era más de 0,5 mm, el correo ff ect de di interna ff transferencia de masa usional en el rendimiento
Un código de cálculo fue desarrollado e implementado para el procedimiento de estimación de
de producto c no era insignificante. La substancia fi rstly alcanza la superficie del catalizador por di
parámetros utilizando el software Matlab 6.5. El ode45 subrutina (Matlab herramientas 6.5 de la
interna ff transferencia de masa usional, y luego enlace con la proteína enzimática para hacer que se
biblioteca) se utilizó para resolver las ecuaciones el diferencial. (4) y (5) o (7) y (8) Y la optimización
produzca la reacción enzimática. La velocidad de reacción sería una ff ected por el di interna ff limitación
fmincon subrutina se utiliza para minimizar la función objetivo (9) .
de transferencia de masa usional cuando el di interna ff tasa usional es menor que la velocidad cinética
de la enzima (velocidad de reacción intrínseca). El di interna ff transferencia de masa usional se
convertiría en el paso limitante de la velocidad si el di interna ff tasa usional es mucho menor que

4. Resultados y discusión velocidad cinética de la enzima. En este caso, la reducción de diámetro de partícula, el aumento de
tamaño de poro de soporte y reducir la carga de enzima puede cambiar el di interna ff limitación

4.1. mi ff ect de transferencia de masa derrame. Por el contrario, el di interna ff tasa usion sería más grande que la velocidad de reacción
inherente de la enzima si el tamaño de partícula es suficientemente pequeño y el tamaño de poro del

4.1.1. mi ff ect de la transferencia de masa interna soporte es lo suficientemente grande. Si el di ff tasa de derrame es mucho mayor que

Figura 1 da los resultados experimentales en di ff diámetros Erent de partículas usando


adsorbente T. laibacchii lipasa como biocatalizador. Los experimentos se realizaron a 50 ° C con 200
rpm de la velocidad de la cama sacudiendo baño donde la concentración de la enzima y

Esquema 4. La representación esquemática general de la modi fi ed ordenó mecanismo de bi-bi.

151
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

la velocidad de reacción inherente de la enzima, la reacción catalítica de la enzima sería el paso la relación de benzoquinona a amina fue de 1: 1-2. De lo contrario, los productos de mitomicina-como
limitante de la velocidad, y la di interna ff limitación usion puede ser ignorada. En este sistema de diaminado fueron más producen como a pH 5,0 y la proporción era de 1: 2,5. Haghbeen et al. [ 67 ]
reacción, cuando el diámetro de partícula es más de 0,5 mm, el di interna ff resistencia usion aumenta También informó de resultados experimentales similares en la síntesis de para-así como
gradualmente que una ff ECTS la reacción. Cuando el diámetro de partícula es inferior a 0,5 mm, la orto-benzoquinonas. Un aumento de la formación de productos de diaminado en reacciones de
determinación del rendimiento es que por razones cinéticas. Por lo tanto la lipasa inmovilizada que aminación nucleares con los donantes de amina aplicadas excesivamente ya se demostró [ 68 , 69 ].
tiene el tamaño de partícula de 0,5 mm fue elegido para utilizar para los experimentos posteriores. En
caso de enzima inmovilizada, de hecho, aunque la velocidad de reacción puede ser controlada por la
transferencia de masa interna, se informó también de que la limitación de transferencia de masa
podría ser descuidada para soportes porosos en muchas obras [ 58 - 61 ]. 4.3. mi ff ect de la temperatura

biocatalıticos reacciones dependen de una serie de di ff Erent parámetros de funcionamiento y la


Si se pueden obtener parámetros relevantes, la evaluación de di interna ff Coe usivity FFI ciente temperatura es uno de los más importantes que aumenta la colisión-interacción molecular [ 70 , 71 ]. Es
también se puede hacer mediante el uso de cálculos teóricos para determinar el mecanismo de necesario proporcionar una temperatura de reacción óptima con las enzimas sensibles a la
control. módulo de Thiele ( φ) es un ampliamente utilizado como un criterio, para los valores de φ ≤ 0,3, temperatura [ 22 , 50 , 72 ]. La actividad enzimática y la estabilidad se considera que son los factores
el factor de eficacia interna se aproxima a 1 [ 22 ] Y hay una insignificante e ff ect de di interna ff transferencia
más importantes en las reacciones enzimáticas, ambos de los cuales son las funciones de la
de masa usional en velocidad de reacción. temperatura de reacción. En general, un aumento en la temperatura de reacción aumenta la
velocidad de reacción mientras que la estabilidad de la enzima puede disminuir e incluso enzima
puede ser desnaturalizada. Por lo tanto, el correo ff ect de la temperatura de reacción sobre la
4.1.2. mi ff ect de limitación de transferencia de masa externa velocidad de reacción de do y re,
En un sistema heterogéneo que contiene enzima inmovilizada, tanto el sustrato como producto
tienen que di ff utilizar entre la solución a granel y las partículas de enzimas inmovilizadas [ 62 , 63 ]. reemplazado por el rendimiento aquí, fue estudiado en di ff temperaturas Erent que van desde 40 a 50 ° C,
limitaciones de transferencia de masa externa pueden minimizarse llevando a cabo la reacción a una manteniendo todos los demás parámetros es decir, constante de velocidad de agitación a 200 rpm, la
velocidad óptima de la agitación y bajo enzima de carga [ 22 ]. Por lo tanto, los experimentos se concentración de lipasa 50 Uml - 1, relación molar de sustrato de a / b 1: 1,05. Los resultados obtenidos
llevaron a cabo a diferentes velocidad de agitación de 50 a 250 rpm, a fin de estudiar su correo ff ect están representados en
en el enzimática adición de Michael de amina butilo a la benzoquinona. Las condiciones Higos. 3 y 4 , Respectivamente. Como se muestra en Fig. 3 , Un incremento en la tasa de producto de
experimentales fueron el mismo que en di interna ff transferencia de masa usional. Figura 2 ilustra reacción do se observó con un aumento de temperatura de 40 a 50 ° C. A 50 ° C, el rendimiento de do
que, con un aumento de la velocidad de agitación de 50 a 150 rpm el rendimiento Y 1 fue encontrado era 97,2% después de 12 h de tiempo de reacción y, a continuación, durante 15 h, el rendimiento de do
para aumentar de 31% a 67,5%. Se puede atribuir al hecho de que la resistencia de transferencia de era 97,2% a los 45 ° C, y fi finalmente, hasta 19 h el rendimiento alcanza 97,1% a 40 ° C. Esto indica
masa disminuye debido al aumento en la turbulencia. Por lo tanto, había limitaciones de transferencia que el aumento de la temperatura acelera la reacción. el tiempo de reacción se disminuyó de 19 h a
de masa externa en el intervalo de velocidad de 50 a 150 rpm. A medida que la velocidad de 12 h, el tiempo, evidentemente, se ha acortado por
agitación aumentó de 175 a 250 rpm, sin embargo, no se encontró que el rendimiento para aumentar
lo que indica que la resistencia de transferencia de masa externa era insignificante después de 175 36,8%. El e ff ect de temperatura de reacción en el rendimiento de re fue similar a do se muestra en la Fig. 4 .
rpm. Con una velocidad más alta, la enzima tiende a dejar su apoyo perdiendo así su propiedad
reciclabilidad. Por lo tanto la velocidad de 200 rpm fue seleccionado como el óptimo para la adición Generalmente, la temperatura más alta es favorable para la velocidad de reacción catalítica de
de Michael con el fin de mantener el catalítica e FFI ciencia (reutilización) de la lipasa inmovilizada. la enzima, que causa la disminución de la barrera de energía entre reaccionar molécula y
enzima-sustrato la formación del complejo y en otros resultados en la mejora de la velocidad de
reacción y la conversión [ 50 ]. T. laibacchii lipasa utilizada es una enzima tolerante al calor que tiene
una buena estabilidad a 50 ° C. Por lo tanto, se seleccionó la temperatura óptima es decir, 50 ° C
para llevar a cabo el costo-e ff aspecto caz en nuestros estudios.
Por lo tanto, tanto la resistencia de transferencia de masa interna y externa se puede despreciar
con 0,5 mm de diámetro de partículas de lipasa inmovilizadas y 200 rpm de velocidad de agitación.
Considerando di global ff usion transferencia de masa limitada, se puede concluir que la velocidad
4.4. mi ff ect de la concentración de sustrato en el rendimiento
solamente se rige por la cinética de enzimas, a través de la modi fi ed aleatorio bi-bi o la modi fi ed
ordenó mecanismo.
En general, la inhibición de la enzima a concentraciones de sustrato superiores conduce a una
disminución en la conversión o rendimiento. Los datos de reacción muestra que, o bien solo sustrato
Mediante el uso de cálculos teóricos, el e ff ect de transferencia de masa externa en la velocidad
o bisustrato pueden ser responsables de la acción inhibitoria de la enzima, reduciendo el progreso de
de la reacción también se puede determinar con Da y η. Si el valor de Da <<1, el di externa ff transferencia
la reacción [ 73 ]. Para investigar los inhibidores de correo ff ect tanto de los sustratos, los experimentos
de masa usional tiene un insignificante e ff ect en el sistema dado [ 22 ].
se puede llevar a cabo de forma individual al mantener una constante de sustrato y la variación de la
concentración del otro. Sin embargo, las concentraciones de

4.2. Reacción experimentos cinéticos

Higos. 3 y 4 dar los rendimientos de dos productos ( do y re) a 40 ° C, 45 ° C y 50 ° C,


respectivamente. Como se muestra en Fig. 3 , El más alto rendimiento de producto monoaminated do, es de
aproximadamente 98%, y es mucho mayor que la de producto diaminado re, es decir, subproducto, su
rendimiento máximo es de aproximadamente 1,6% se muestra en la Fig. 4 . Esto indica que la lipasa
inmovilizada hemos empleado tiene una excelente regioselectividad. Por otra parte, una pequeña
proporción molar de 1,05 de la amina y el benzoquinona, y un pH medio de reacción adecuado de pH 7,5,
fueron elegidos para facilitar la biocatalıtica óptima e FFI deficiencia de la lipasa en excelentes rendimientos.

Fue bien documentado que el rendimiento del producto depende de la selectividad de la enzima,
el pH del medio de reacción y la relación de sustratos [ 64 - 66 ]. Hertera et al. [ 14 ] Realizado la síntesis
de productos con mitomicina como monoaminated usando lacasas, y sus resultados muestran que
Figura 2. El e ff ect de la velocidad de agitación en el rendimiento del producto do.
los productos se obtuvieron principalmente solamente a pH 7,0 y
Temperatura, 50 ° C diámetro de partícula, 0,5 mm.

152
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

datos son principalmente simetría del eje cero, lo que indica que el modelo era bien
fi tted, estable y válido de los datos correspondientes. Visto desde la Ec. (9) , La desviación relativa media
es un promedio de valor absoluto de la desviación relativa. Como se vio en Fig. 6 A, la desviación relativa
disminuyó rápidamente con el aumento de rendimiento Y 1. Sin embargo, una pequeña desviación podría
producir desviaciones relativas más grandes cuando Y 1 en sí era pequeña. Por lo tanto, las grandes
desviaciones relativas ocurrió a las de los rangos de bajo rendimiento. Cuando el rendimiento fue alto,
sin embargo, la desviación relativa se había convertido en más pequeño. De hecho, cuando el
rendimiento superó el 20%, la desviación relativa era menor que 15%. Por otro lado, para subproducto re,
sin embargo, la media y la desviación relativa máxima eran 15,53% y 55,65%, respectivamente, porque
Y2

en sí era muy pequeña, tales como pequeñas desviaciones podrían producir grandes desviaciones.
Fig. 3. La comparación de rendimiento entre los resultados simulados de la modi fi ed modelo bi-bi aleatorio y Por ejemplo, cuando Y exp
212 e y estim 212 fueron 0,057% y
los datos experimentales para 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1-hidro-4quinone ( do).
0,128%, respectivamente, la desviación relativa era 55,46%. Para el caso de
re, aunque la desviación relativa era grande, no indica que el modelo no estaba bien fi tted, por lo
- : Rendimiento estimado, · : rendimiento Experimental.
tanto, nos dimos di ff fracciones de peso Erent a do y re en el cómputo de optimización de la ecuación
objetivo. (9) . Las fracciones en peso de do y re fueron 1 y 0,2 respectivamente.

Como se ve desde Higos. 3 y 4 , El rendimiento máximo de do y re era alrededor del 98% y


1,6%, respectivamente, el rendimiento de do era mucho más alto que re, por lo que el rendimiento se
empleó en lugar de la conversión en este trabajo. La energía de activación del producto do era 9,98
kJ mol - 1, fue mucho menor que la del producto re, 23,53 kJmol - 1, como significa que el producto re

encontraría las barreras de energía mayores, por lo tanto, la velocidad de reacción de producto do y
el rendimiento eran mucho mayor que éstos de producto re.
Fig. 6 B ilustra las comparaciones entre los valores simulados basados ​en la modificación fi ed
ordenó mecanismo-bi bi y datos experimentales para do
y re, Y 1, e y 2, a 40 ° C, 45 ° C y 50 ° C respectivamente. los fi TTED parámetros del modelo de cinética
se muestran también en tabla 1 . por do, producto objetivo, el promedio y la desviación relativa máxima
de los valores simulados a los datos experimentales fueron 21,7% y 68,6%, respectivamente, por
Fig. 4. La comparación de rendimiento entre los resultados simulados de la modi fi ed modelo bi-bi aleatorio y
otra parte, los datos de desviación no eran cero eje de simetría. Incluso si el rendimiento Y 1 supera el
los datos experimentales para 2-metil-3,5- norte- butylaminoyls- 1, 4-bencenodiol ( re).
80%, la desviación relativa era todavía mayor, por ejemplo, cuando el rendimiento fue de 90%, el Y 1 desviación
era 33,75% a 40 ° C, lo que indica que el modelo no estaba bien fi tted de los datos correspondientes.
- : Rendimiento estimado, · : rendimiento Experimental.

ambos sustratos eran bajos en esta reacción biocatalítica, y por lo tanto la inhibición de la enzima
constante cinética de reacción es importante en la cinética enzimática porque revela la
pueden ser neglectible. Los experimentos se llevaron a cabo mediante la variación de las
velocidad de reacción de cada mecanismo, proporcionando una visión de un proceso enzimático
concentraciones de ambos sustratos, los resultados obtenidos están representados en Fig. 5 . Se
particular. de preferencia tabla 1 , fi primera, energías de activación de la constante cinética estaban
encontró que el aumento de las concentraciones de sustrato no tenía en Florida influencia en el
entre 7.68 y 23.5 kJ mol - 1,
rendimiento de do cuando la concentración de una aumentó de 5 mM a 15 mM con una relación de
valores incluidos en el 2 - 40 kJmol - 1 intervalo encontrado en la mayoría de los modelos cinéticos de
1,05 para
reacción bioquímica. Entonces, todas las constantes de adsorción o de equilibrio deben ser signos
segundo a a. Por lo tanto, los sistemas de reacción no mostró inhibición por los dos sustratos para los
positivos, que se encuentra con todos los modelos en tabla 1 Así, el modelo de distinguir debe
intervalos de concentración de 5 a 15 mm para a.
realizarse sobre la única base de fi tting del modelo a los datos experimentales [ 23 ]. Porque el fi t de
modelo basado en la modi fi ed mecanismo de bi-bi aleatorio es mejor que la modi fi ed ordenó
4.5. modelo cinético mecanismo de bi-bi, el mecanismo de reacción puede seguir a la modi fi ed mecanismo de bi-bi
aleatorio. El modelo está dada por la Ecs. (4)
Higos. 3 y 4 ilustrar las comparaciones entre los valores simulados basados ​en la modi fi ed azar
mecanismo de bi-bi y los datos experimentales para do, re, a 40 ° C, 45 ° C y 50 ° C, respectivamente. y (5) . Por otra parte, sobre la base de las comparaciones entre los valores simulados y los datos
los fi parámetros TTED del modelo cinético propuesto en este documento se muestran en la tabla 1 . experimentales, la modificación fi ed ordenó modelo bi-bi no dio un acuerdo bueno y satisfactorio entre
La técnica de estimación de parámetro cinético usual consiste en dos pasos. En primer lugar, los experimental
parámetros cinéticos de isotérmica se estiman a partir de datos isotérmica. A continuación, los
parámetros cinéticos de no isotérmica se estiman utilizando di ff temperaturas de datos Erent, y fi Se
calcula la energía de activación nalmente. En este trabajo, los parámetros cinéticos se estimaron
utilizando una modificación fi método ed en el que todos los datos de di ff temperaturas Erent se
utilizaron simultáneamente. Los parámetros cinéticos, incluida la energía de activación, se
determinaron directamente mediante la combinación de la solución numérica de di ff ecuaciones
diferenciales y el método de optimización no lineal. El proceso de estimación de parámetros cinéticos
es simplificada fi ed y la computacional e FFI eficiencia se mejora. Para el parámetro fi tting del modelo
cinético en este trabajo, dos juegos de experimentos de datos que comprende 78 puntos de datos
para do y re a 40 ° C, 45 ° C y 50 ° C fueron utilizados.

Como se ve desde Fig. 6 A, producto objetivo para do, de la media y las desviaciones relativas
máximas de los valores simulados a los datos experimentales fueron 11,25% y 28,57%, Fig. 5. El e ff ect de la concentración de sustrato sobre el rendimiento del producto do.

Temperatura, 50 ° C, diámetro de partícula, 0,5 mm, velocidad de agitación, 200 rpm.


respectivamente, por otra parte, la desviación

153
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

tabla 1 5. Conclusiones
los parámetros estimados del modelo cinético.

El estudio investigó modelo cinético de la enzimática adición de Michael de butil amina a la


parámetros la modi fi ed aleatorio bi-bi la modi fi ed ordenó bi-bi
reacción 2-metil-1,4-benzoquinona para la síntesis de 2-metil-3- norte- butylaminoyl-1-hidro-4-quinonein
K1 3.99 17.16 bu citrato ff solución er (pH 7,0) para la fi tiempo primero. El mayor rendimiento de producto do
K2 16.57 19.96
K3 20.39 19.94
de 98% fue logrado, que se atribuye principalmente a la buena regioselectividad del inmovilizado T.
K4 30.95 72.39
K5 126,44 8.33 laibacchii lipasa. El mecanismo de reacción propuesto para la adición de Michael implica (1) el
K6 140,17 1 agujero de oxianión polariza la α, β- carbonilo insaturado de 2-metil-1,4 -benzoquinone, aumentando
K 7, o una 1 1 35.04
su capacidad electrófilo, (2) la histidina catalítica desprotona la amina nucleófilo n-butilo, desprotona
K 8, mineral 1 1 7689.2
se añade amina n-butilo a la benzoquinona polarizada. la modi fi ed ping-pong mecanismo de bi-bi y la
K 9, o una 2 0.1 0.94
K 10, mineral 2 0.5 13308 modi fi mechanismwere propuso ed secuencial. Es bene fi cial para agregar estas modi fi mecanismos de
K 11, o una 1 291,93 cationes a la familia de mecanismo de reacción complejo de la enzima, como se extiende el
K 12, mineral 1 9979.7 mecanismo. Se desarrolló el modelo cinético para la reacción y fi tted en base a los datos
K 13, o una 2 158.75
experimentales. Los parámetros cinéticos se determinaron directamente mediante la combinación de
K 14, mineral 2 23536
la solución numérica de di ff ecuaciones diferenciales y el método de optimización no lineal. Con la
desviación relativa media de

Tabla 2
La reacción con di ff lipasa Erent o muestra de control.

Lipasa o control de ejemplo Rendimiento (%)


11,25% y la desviación siendo principalmente simetría del eje cero, un acuerdo muy satisfactorio

diatomita DAKOTA DEL NORTE


entre los datos experimentales y los resultados del modelo se obtuvo basan en la modi fi ed
La diatomita tratado con glutaraldehído DAKOTA DEL NORTE mecanismo de bi-bi azar, lo que implica que el enzimática Michael adición puede seguir la modi fi ed
Inmovilizado T. laibacchii lipasa tratado con paraoxón DAKOTA DEL NORTE
mecanismo de bi-bi aleatorio. Las limitaciones de transferencia de masa internos así como externos
Inmovilizado T. laibacchii lipasa 51.6
no muestran signi fi no puede correo ff ect en cinética de la reacción, lo que indica que la reacción
podría ser controlado por la cinética de enzimas.
La reacción se llevó a cabo a 50 ℃ durante 5 h, otras condiciones fueron las mismas que la descripción en la
Sección 2.2 . ND, no detectado.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [números
de subvención 21546004 y 21576145], la Fundación Provincial de Shandong de Ciencias Naturales,
China [número de concesión ZR2017MB065] y el Shandong Clave Provincial de I + D Programa
[números de subvención 2017GSF21109 y 2017GSF18135].

referencias

[1] S. Wakaki, H. Marumo, K. Tomioka, G. Shimizu, E. Kato, H. Kamada, S. Kudo,


Y. Fujimoto, el aislamiento de nuevas fracciones de mitomicinas antitumorales, Antibiot. Chemother.
(1971) 8 (5) (1958) 228 - 240 .
[2] W. Verboom, BHM Lammerink, RJM Egbrink, DN Reinoudt, S. Harkema, la síntesis de análogos de mitomicina
C. 2. Introducción de un grupo saliente en C-1 y la oxidación del anillo aromático en
2,3,9,9a-tetrahidro-1H-pirrolo [1,2-a] indoles, J. Org. Chem. 50 (20) (1985) 3797 - 3806 .

[3] WJ van Eden, NFM Kok, K. Woensdregt, ADR Huitema, H. arranque,


AGJ Aalbers, Caja de intraperitoneal Mitomicina C frente oxaliplatino intraperitoneal en pacientes con
carcinomatosis peritoneal de cáncer colorrectal sometidos a cirugía citorreductora y HIPEC, Eur. J. Surg.
Oncol. 44 (2018) 220 - 227 .
[4] A. Arjona-Sánchez, P. Barrios, E. boldo-Roda, B. Campos, J. Carrasco-Campos, HIPECT4: ensayo clínico
multicéntrico, aleatorizado para evaluar la seguridad y e FFI cacia de hipertérmica quimioterapia intra-peritoneal
(HIPEC) con mitomicina C utilizada durante la cirugía para el tratamiento de carcinoma colorrectal localmente
avanzado, BMC Cancer 18 (2018) 183 - 190 .

[5] Z. Min, D. Wang, Y. Che, M. Wu, Q. Li, C. Shao, Y. Wang, L. Cao, G. Wang, H. Hao, Ginsenósidos sinergizar con mitomicina C
en la lucha contra no humana de células de cáncer de pulmón pequeño mediante la represión de la reparación del ADN
Fig. 6. desviaciones relativas de la estimación vs rendimiento experimental de los modelos cinéticos. mediada por Rad51, Acta Pharmacol. Pecado. 39 (3) (2018) 449 - 458 .

Consta de 78 puntos de datos, y la desviación relativa es (Y estim [6] VS Nithianandam, S. Erhan, polímeros de quinona-amina: 18: un nuevo método para la síntesis de poli
ijk - Y exp ijk) / Y estimijk)
estimijk) * 100.
(aminoquinona alquilo) s, Polymer 39 (17) (1998) 4095 - 4098 .
(A) con la modi fi ed mecanismo de bi-bi azar, (B) con la modi fi ed ordenó mecanismo de bi-bi.
[7] JM Schkeryantz, SJ Danishefsky, la síntesis total de (+ -..) - FR-900482, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 4722 - 4723
.
[8] VR Moure, C. Fabrício, G. Frensch, FA Marques, DA Mitchell, N. Krieger, la mejora de la enantioselectividad de
la lipasa de Burkholderia cepacia LTEB11 hacia la resolución de los alcoholes alílicos secundarios, Biocatal.
datos y resultados del modelo, y el mecanismo de reacción biocatalítica pueden no ser la modi fi ed Agric. Biotechnol. 3 (2014) 146 - 153 .
ordenó mecanismo de bi-bi.
[9] V. Patel, H. Gajera, A. Gupta, L. Manocha, D. Madamwar, Síntesis de ethylcaprylate en medios orgánicos
Además, una buena concordancia entre los datos experimentales y el modelo cinético propuesto
usando Candida rugosa lipasa inmovilizada sobre óxido de grafeno exfoliada: parámetros del proceso y los
da soporte a la citada conclusión acerca di ff transferencia de masa derrame que el correo ff ect de estudios de reutilización, Biochem. Ing. J. 95 (2015) 62 - 70 .
tanto la resistencia de transferencia de masa interna y externa se puede despreciar para la lipasa
inmovilizada utilizada en este trabajo. [10] A. Abdulhadi, C. Isabelle, J. Jordane, P. Cédric, S. Joël, M. Lionel, la oxidación de ácido ferúlico y ferulato de etilo
en medio acuoso lacasa-catalizada: un procedimiento de verde para la síntesis de nuevos compuestos, Food
Chem . 145 (2014) 1046 - 1054 .
[11] C. Engelmann, S. Illner, U. Kragl, lacasa inició acoplamientos CC: various

154
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

técnicas para la monitorización de la reacción, Proceso Biochem. 50 (2015) 1591 - 1599 . JM Guisan, lipasas interfacialmente activados contra soportes hidrófobos: e ff ect de la supportnature sobre las
[12] M. Fernandez-Fernandez, MA Sanroman, D. Moldes, los desarrollos recientes y aplicaciones de lacasa propiedades biocatalıticas, Proceso Biochem. 43 (2008) 1061 - 1067 .
inmovilizada, Biotechnol. Adv. 31 (2013) 180 - 186 .
[13] K. Manda, E. Hammer, A. Mikolasch, T. Niedermeyer, J. dic A. Daniel Jones, [40] O. Barbosa, C. Ortiz, A. Berenguer-Murcia, R. Torres, RC Rodrigues, R. FernandezLafuente, glutaraldehído en el diseño de
AJ Benesi, F. Schauer, JM Bollag, una lacasa inducida por acoplamiento cruzado de 4-aminobenzoicacid con los bio-catalizadores: un agente de reticulación útil y una herramienta versátil en la inmovilización de enzimas, RSC
el párrafo -dihydroxylated compuestos de 2,5-dihidroxi-N- (2-hidroxietil) benzamida y éster metílico de ácido Adv. 4 (2014) 1583 - 1600 .
2,5-dihidroxibenzoico , J. Mol. Catal. B: Enzym. 35 (2005) 86 - 92 . [41] MI Kim, J. Kim, J. Lee, S. Shin, HB Na, T. Hyeon, HG Park, HN Chang, agregados enzimáticos reticulados
unidimensional en SBA-15: comportamiento catalítico Superior a la inmovilización de enzimas convencionales,
[14] S. Herter, D. Michalik, A. Mikolasch, M. Schmidt, R. Wohlgemuth, U. Bornscheuer, microporosa mesoporoso Mater. 111 (1 - 3) (2008) 18 - 23 .
F. Schauer, la síntesis de 2-metoxi-3-metil-5- (alquilamino) lacasa-mediado - y bis 3-metil-2,5- (alquilamino) -
[1,4] -benzoquinones, J. Mol. Catal. B: Enzym. 90 (2013) 91 - 97 . [42] IK Luna, J. Kim, J. Lee, H. Jia, BN Hyon, KY Jong, HK Ja, A. Dohnalkova,
JW Grate, P. Wang, T. Hyeon, GP Hyun, NC Ho, de enzima reticulado agregados en sílice mesoporosa
[15] G. Angajala, P. Pavan, R. Subashini, lipasas: una visión general de sus retos actuales y prospectivas en la ordenada jerárquicamente-: una simple y e ff método reflexivo para la estabilización de enzima, Biotechnol.
revolución de la biocatálisis, Biocatal. Agric. Biotechnol. 7 (2016) 257 - 270 . Bioeng. 96 (2) (2007) 210 - 218 .
[43] R. Reshmi, S. Sugunan, características bioquímicas mejorada de glucosidasa reticulado en espumas de sílice
[dieciséis] BP Dwivedee, S. Soni, M. Sharma, J. Bhaumik, JK Laha, UC Banerjee, la promiscuidad de reacciones nanoporoso, J. Mol. Catal. B: Enzym. 85 (86) (2013) 111 - 118 .
catalizada por lipasa para la síntesis orgánica: una actualización reciente, Chemistryselect. 3 (9) (2018) 2441 - 2466
. [44] FI Diana B. Oveimar, M. Isabel Burguete, L. Pedro, Santiago VL, FL Roberto,
[17] E. Busto, V. Gotor-Fernández, V. Gotor, hidrolasas: catalíticamente enzimas promiscuos para reacciones no GV Eduardo, Tuning lipasa B de Candida antarctica C mi enlace C actividad promiscua por inmovilización sobre
convencionales en síntesis orgánica, Chem. Soc. Rev. 39 (11) (2010) 4504 - 4523 . perlas de poli-estireno-divinilbenceno, RSC Adv. 4 (12) (2014) 6219 - 6225 .

[18] S. Ghasemi, M. Heidary, MA Faramarzi, Z. Habibi, la inmovilización de la lipasa en Fe3O4 / ZnO núcleo / [45] F. Secundo, los cambios conformacionales de las enzimas sobre la inmovilización, Chem. Soc. Rev. 42 (2013) 6250 - 6251
nanopartículas magnéticas de la cáscara y la catálisis de tipo adición de Michael a derivados de chalcona, J. .
Mol. Catal. B: Enzym. 100 (2014) 121 - 128 . [46] YY Zhang, Liu JH, Puri fi catiónico y en la inmovilización in situ de lipasa de de una
[19] Y. Yuan, L. Yang, S. Liu, J. Yang, H. Zhang, J. Yan, X. Hu, la adición de Michael catalizada por la enzima para la mutante de laibacchiiusing Trichosporon sistemas de dos fases acuosas, J. Chromatogr.
síntesis de la warfarina y su determinación a través Florida fluorescencia de temple de L-triptófano, B. 878 (2010) 909 - 912 .
Spectrochim. Acta Parte A 176 (2017) 183 - 188 . [47] JH Liu, Zhang YY, optimización de la producción de lipasa por un mutante de Candida
[20] ROMA de Souza, LMC Matos, KM Goncalves, ICR Costa, I. Babics, Antártida DSM-3855 usando la metodología de superficie de respuesta, Int. J. Sci Food. Technol. 46 (2011) 695 - 701 .
SGF Leite, EG Oestreicher, OAC Antunes, adiciones de Michael de aminas primarias y secundarias a
acrilonitrilo catalizadas por lipasas, Tetrahedron Lett. 50 (2009) 2017 - 2018 . [48] J. Uppenberg, MT Hansen, S. Patkar, A. Jones, la secuencia, determinación de la estructura cristalina y re fi namiento
de dos formas cristalinas de la lipasa B de Candida antarctica, Estructura 2 (4) (1994) 293 .
[21] C. TSY, CM Yeoh, ET Phuah, WL Siew, YY Lee, TK Tang, Estudio cinético de glicerólisis catalizada por lipasa
de palmoleína usando Lipozyme TLIM en el sistema libre de disolvente, PLoS One 13 (2) (2018) e0192375 . [49] Y. Mei, A. Kumar, R. Gross, Kinetics y el mecanismo de Candida antarctica lipasa B
solución de polimerización catalizada de ε- caprolactona, Macromolecules 36 (2003) 5530 - 5536 .
[22] VG Waghmare, A. Chatterji, KV Rathod, cinética de la síntesis enzimática de butirato de cinamilo por la lipasa
inmovilizada, Appl. Biochem. Biotechnol. 183 (2007) 792 - 806 . [50] AC Mathpati, KC Badgujar, BM Bhanage, modelado y de acoplamiento Kinetic estudio de lipasa inmovilizada
catalizadas síntesis de acetato de furfurilo, Enzyme Microb. Technol. 84 (10) (2016) 1 - 10 .
[23] M. Ravelo, E. Fuente, Á. Blanco, M. Ladero, F. García-Ochoa, Esteri fi cación de
glicerol y el ibuprofeno en medios exentos de disolventes catalizadas por CALB libre: modelado cinético, Biochem. [51] M. Rizzi, P. Stylos, A. Riek, MA Reuss, Estudio cinético de la lipasa inmovilizada catalizar la síntesis de acetato
Ing. J. 101 (2015) 228 - 236 . de isoamilo por transesterificación fi cationes en n-hexano, Enzyme Microb. Technol. 14 (1992) 709 - 714 .
[24] YY Zhang, JH Liu, Estudio cinético de la hidrólisis enantioselectiva de (R, S) éster etílico -ketoprofeno usando
adsorbente T. Laibacchii lipasa, Biochem. Eng.J. 54 (1) (2011) 40 - 46 . [52] MP Kamble, SD Shinde, GD Yadav, resolución cinética de (R, S) - α- tetralol cata-
lisaron por la enzima B de Candida antarctica lipasa reticulado, J. Mol. Catal. B: Enzym. 132 (2016) 61 - 66 .
[25] YY Zhang, X. Gao, CY Wang, ZK Zheng, LL Wang, JH Liu, en un solo recipiente síntesis estereoselectiva de
quiral 1, 3-oxatiolano por laibachii Trichosporon lipasa: optimización de la metodología de superficie de [53] KC Badgujar, BM Bhanage, Síntesis de acetato de geranilo en medios no acuosos usando adsorbente Pseudomonas
respuesta integrado un enfoque de función de conveniencia, J. Mol. Catal. B: Enzym. 133 (2016) 27 - 34 . cepacia lipasa en polímero biodegradable fi lm: modelado cinético y longitud de la cadena e ff ect estudio,
Proceso Biochem. 49 (8) (2014) 1304 - 1313 .
[26] YY Zhang, PY Lu, QH Sun, T. Li, LJ Zhao, X. Gao, FY Wang, JH Liu, Lipasemediated directa in situ de
polimerización de apertura de anillo de ε- caprolactona formada por un método quimio-enzimática, J. [54] R. Garcia, TM Garcia, MJ Aracil, modelado cinético de la síntesis de 2-hydroxy5-hexenilo éster 2-clorobutirato por
Biotechnol. 281 (2018) 74 - 80 . una lipasa inmovilizada, Biochem. Ing. J. 5 (2000) 185 - 5190 .
[27] R. Verger, ' activación interfacial ' de lipasas: hechos y artefactos, Trends Biotechnol.
15 (1997) 32 - 38 . [55] GD Yadav, AH Trivedi, el modelado cinético de transesterificación catalizada lipasa inmovilizada fi cación de
[28] AM Brzozowski, U. Derewenda, ZS Derewenda, GG Dodson, DM Lawson, n-octanol con acetato de vinilo en medios no acuosos, Enzyme Microb. Technol. 32 (2003) 783 - 789 .
JP Turkenburg, et al., Un modelo para la activación interfacial en lipasas de la estructura de un complejo
de lipasa-inhibidor de hongos, Naturaleza 351 (1991) 491 - 494 . [56] GD Yadav, IV Borkar, modelado cinético de la catálisis de lipasa inmovilizada en la síntesis de levulinato
[29] H. Van Tilbeurgh, MP Eglo ff, C. Martínez, N. Rugani, R. Verger, C. Cambillau, la activación interfacial de la lipasa - complejo de n-butilo, Ind. Eng. Chem. Res. 47 (2008) 3358 - 3363 .
procolipasa por micelas mixtas reveladas por X-raycrystallography, Naturaleza 362 (1993) 814 - 820 . [57] M. Svedendahl, P. Carlqvist, C. Branneby, O. Allner, A. Frisia, K. Hult, P. Berglund,
T. Brinck, epoxidación directa en lipasa de Candida antarctica B estudiado por el experimento y la teoría,
[30] A. Bastida, P. Sabuquillo, P. Armisen, R. Fernández-Lafuente, J. Huguet, Chem. Biol. Chem. 9 (2008) 2443 - 2451 .
JM Guisán, un solo paso puri fi catiónico, inmovilización, y la hiperactivación de las lipasas a través de [58] V. Fernando, LK Roberta, C. Fernanda, CF Lúcio, C. Vladimir, N. Jorge,
adsorción interfacial sobre soportes fuertemente hidrófobos, Biotechnol. Bioeng. 58 (1998) 486 - 493 . LC Marcos, modelado cinético de glicerólisis catalizada por lipasa de aceite de oliva, Biochem. Ing. J. 56 (2011)
107 - 115 .
[31] C. Garcia-Galán, O. Barbosa, K. Hernández, J. dos Santos, R. Rodrigues, [59] B. Cheirsilp, W. Kaewthong, A. H-Kittikun, Estudio cinético de glicerolisis de oleína de palma para la producción de
R. Fernández-Lafuente, Evaluación de estireno - perlas de divinilbenceno como un soporte para inmovilizar las lipasas, monoacilglicerol por la lipasa inmovilizada, Biochem. Ing. J. 35 (2007) 71 - 80 .
las moléculas 19 (2014) 7629 - 7645 .
[32] G. Fernández-Lorente, JM Palomo, Z. Cabrera, JM Guisán, R. FernándezLafuente, Speci fi mejora ciudad hacia [60] A. Valerio, KG Fiametti, S. Rovani, E. Franceschi, ML Corazza, H. Treichel,
sustratos hidrófobos por inmovilización de lipasas por activación interfacial en soportes hidrófobos, Enzyme D. Oliveira, JV Oliveira, la producción enzimática de mono y diglicéridos en n-butano comprimido y
Microb. Technol. 41 (2007) 565 - 569 . tensioactivo AOT, J. Supercrit. Fluidos 49 (2009) 216 - 220 .
[61] JP Chen, HY Wang, propiedades de bilirrubina oxidasa mejorarse mediante atrapamiento en alginato - matriz
[33] W. Shuai, RK Das, M. Naghdi, SK Brar, M. Verma, una revisión sobre los aspectos importantes de la inmovilización de sol-gel de silicato, Biotechnol. Tech. 12 (1998) 851 - 853 .
la lipasa sobre los nanomateriales, Biotechnol. Appl. Biochem. 64 (4) (2017) 496 - 508 . [62] J. Sun, B. Yu, P. Curran, Liu SQ, catalizada por lipasa síntesis de éster en el sistema de aceite libre de disolvente: ¿es esterificado fi
catión o transesterificación fi catiónico, Food Chem. 141 (2013) 2828 - 2832 .
[34] RA Sheldon, JM Woodley, Papel de la biocatálisis en química sostenible, Chem. Rev. 118 (2) (2018) 801 - 838 .
[63] VK Vishakha, GL Vikesh, P. Arushi, K. Virendra, Rathod Síntesis de isobutilo lipasa propionato usando
[35] HEGMM Bakr, diatomita: su caracterización, modi fi cationes y aplicaciones, adsorbente en un sistema libre de disolvente: optimización y estudios cinéticos, J. Mol. Catal., B Enzym. 99
Asian J. Mater. Sci. 2 (3) (2010) 121 - 136 . (2014) 143 - 149 .
[36] K. Hernandez, R. Fernandez-Lafuente, lipasa B de Candida antarctica inmovilizado [64] BB Feng, M. Voehler, L. Zhou, M. Passarelli, CM Harris, TM Harris, Major ranura (R) -alfa- (N6-adenil) aductos de
en octadecilo Sepabeads: un biocatalizador muy estable en presencia de peróxido de hidrógeno, óxido de estireno en un oligodesoxinucleótido que contienen los humanos N-ras codon 61 secuencia:
Proceso Biochem. 46 (4) (2011) 873 - 878 . conformaciones de la R (61,2) y R (61,3) secuencia de isómeros a partir de 1H RMN. MP Piedra, Bioquímica
[37] R. Fernández-Lafuente, P. Armisén, P. Sabuquillo, G. Fernández-Lorente, 35 (1996) 7316 - 7329 .
JM Guisán, la inmovilización de lipasas por adsorción selectiva en soportes hidrófobos, Chem. Phys.
Lípidos 93 (1998) 185 - 197 . [sesenta y cinco] C. Eggert, Temp U., KEL Eriksson, el sistema ligninolítico de la rotfungus blanco Pycnoporus
[38] O. Barbosa, C. Ortiz, Á. Berenguer-Murcia, R. Torres, Rafael CR, R. FernandezLafuente, Estrategias para la cinnabarinus: puri fi cación y caracterización de la lacasa, Appl. Reinar. Microboil. 62 (1996) 1151 - 1158 .
inmovilización de un solo paso - Puri fi cación de enzimas como biocatalizadores industriales, Biotechnol. Adv.
33 (2015) 435 - 456 . [66] RM Berka, PS chneider, EJ Golightly, SH Brown, M. Madden, KM Brown,
[39] G. Fernández-Lorente, Z. Cabrera, C. Godoy, R. Fernandez-Lafuente, JM Palomo, T. Halkier, K. Mondorf, F. Xu, caracterización del gen que codifica una

155
Y. Zhang et al. Molecular Catálisis 466 (2019) 146-156

lacasa extracelular de Myceliophthora thermophila y el análisis de thermophila y el análisis de la enzima [70] KP Dhake, PJ Tambade, ZS Qureshi, RS Singhal, BM Bhanage, HPMCPVA fi lm inmovilizada Rhizopus oryzae
recombinante expresada en Aspergillus oryzae, Appl. Reinar. Microboil. 63 (1997) 3151 - 3157 . lipasa como biocatalizador para la transesterificación fi reacción de cationes, ACS Catal. 1 (4) (2011) 316 - 322 .

[67] K. Haghbeen, EW Tan, ChemInform Resumen: síntesis fácil de colorantes azoicos catecol, [71] AS de Miranda, LSM de Miranda, ROMA de Souza, lipasas: catalizadores valiosos para resoluciones cinéticas
J. Org. Chem. 63 (1997) 4503 - 4505 . dinámicas, Biotechnol. Adv. 33 (5) (2015) 372 - 393 .
[68] THJ Niedermeyer, A. Mikolasch, M. Lalk, aminación Nuclear catalizada por lacasas fúngicas: productos de [72] NR Khan, Virendra K. Rathod, catalizada por enzimas de síntesis de ésteres cosméticos y su intensi fi cación: una
reacción de p-hidroquinonas y aminas aromáticas primarias, J. Org. Chem. 70 (2005) 2002 - 2008 . revisión, Proceso Biochem. 50 (11) (2015) 1793 - 1806 .
[73] KC Badgujar, BM Bhanage, La evaluación métrica verde y síntesis de compuestos dieselblend a partir de
[69] A. Mikolasch, A. Matthies, M. Lalk, F. Schauer, lacasa-inducidos p-hidroquinonas CN couplingof sustituidos con biomasa derivado de ácido levulínico en dióxido de carbono supercrítico, Biomasa bioenergía 84 (2016) 12 - 21 .
p-aminobenzoico acidin comparación withknown rutas químicas, Appl. Microbiol. Biotechnol. 80 (2008) 389 - 397
.

156

You might also like