I CONGRESO DE PETROLEO Y GAS (PETROGAS´2007)

Yacimientos y Producción de Petróleo PETRO4-P29

CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE UN POZO SELECCIONADO

PARA LA APLICACIÓN DE MEOR EN EL YACIMIENTO BOCA DE JARUCO
(1) (1) (1)
Silvia Acosta Díaz , Gloria Bugnes Morell , Francisca González , Gisela Novoa
Rodríguez (1).
(1) Centro de Investigaciones del Petróleo, Calle Washington No 169, esq. Churruca, Cerro, Ciudad de la
Habana, Cuba, E-mail: sacosta@ceinpet.cupet.cu

RESUMEN

La técnica de MEOR consiste en la inyección de microorganismos seleccionados dentro del reservorio y la

posterior estimulación y transporte de sus productos metabólicos generados in situ, con el fin de obtener la
recuperación del petróleo residual. Actualmente en nuestro centro existe un proyecto encaminado a aplicar
esta técnica en pozos en declinación del yacimiento Boca de Jaruco. Se hizo la selección geólogo –litológica
siendo el pozo 314 el seleccionado, se realizó su caracterización microbiológica al crudo con conteo de
bacterias aerobias y degradadoras de hidrocarburos, aislamiento de las bacterias y caracterización de las cepas
degradadoras. En este pozo seleccionado se encontró una población de bacterias aeróbicas de 107 UFC/g de
crudo, la que constituye esta una concentración alta de microorganismos. Las bacterias degradadoras de crudo
resultaron igualmente abundantes con una población de 103 UFC/g, Los aislamientos no mostraron mucha
diversidad, pero prevalecieron los bacilos Gram negativos. Se aislaron 4 cepas con características promisorias,
dos de ellas, 3141 y 3142 con potencialidades marcadas para ser utilizadas en procesos de Recuperación
Mejorada por Microorganismos

ABSTRACT

MEOR technique consists on the microorganism injection of selected inside the reservoir and the later
stimulation and transport of its metabolic products generated in situ, with the purpose of obtaining the recovery
of the residual petroleum. At the moment in CEINPET a project guided to apply this technique in wells in decline
of the location of Boca Jaruco. The selection geologist being the well B-J 314 the one selected was made,
characterization microbiological was carried out its, to the raw one with count of aerobic bacterias and isolation
of the bacterias and characterization degradation of hydrocarbons. In this selected well a population of aerobic
bacterias of 107 UFC/g was of raw, the one that constitutes this a high concentration of microorganism. The
degradations bacterias of raw were equally abundant with a population of 103 UFC/g, the isolations didn't show a
lot of diversity, but the bacillus prevailed negative Gram. 4 bacterias were isolated with characteristic promissory,
two of them, 3141 and 3142 with marked potentialities to be used in processes of Improved Recovery by
Microorganism.

INTRODUCCIÓN

En nuestro centro se han venido realizando desde 1996 trabajos relacionados con la recuperación de
petróleo por métodos biotecnológicos (MEOR). Se han realizado inyecciones de prueba en pozos de
los yacimientos de Jatibonico y Boca de Jaruco y se elaboró un Procedimiento Operativo que abarca
todos los pasos para la aplicación de esta tecnología.

Actualmente se culminó una tapa del Proyecto:”Biotecnología Aplicada a la industria del petróleo”
donde se llevó a cabo la selección del polígono experimental según las características geológicas del
yacimiento para la aplicación de esta tecnología. Se recomendó utilizar para el experimento el pozo
314, en la capa E1 del polígono I, en el Yacimiento Boca de Jaruco, por lo que este trabajo tiene como
objetivo la caracterización microbiológica del pozo inyector BJ-314.

SEGUNDA CONVENCIÓN CUBANA DE CIENCIAS DE LA TIERRA, GEOCIENCIAS´2007.

Memorias en CD-Rom, La Habana, 20-23 de Marzo de 2007
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MATERIALES Y MÉTODOS

Al pozo candidato BJ-314 para la aplicación de la tecnología MEOR se le realizó un muestreo

superficial de crudo manteniendo las condiciones de esterilidad según la norma NC 33-15:1983

Se pesaron 10 g del crudo y se añadió a un erlenmeyer de 250 ml que contenía 90 ml de medio

Solana y unas gotas de tween 80, se incubó en zaranda termostatada a 150 rpm durante 30 min. Se
tomó del sobrenadante y se realizaron diluciones seriadas hasta 10 -6 (ISO 6887, 1999). Las
diluciones se sembraron en placas por duplicado en medio de agar triptona soya de BIOCEN® para
el conteo total de bacterias aerobias dadas en UFC/ g (ISO 4833:1991) tambien se sembraron en
placas con agar petróleo (Finnerty, 1983) para el conteo total de bacterias degradadoras de
hidrocarburos.

Aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos.

Las colonias más representativas crecidas en agar petróleo se sembraron por agotamiento en medio
agar triptona soya y se incubaron a 37 o C por 24 h. Para la caracterización cultural se observaron las
colonias al estereoscopio y para definir las características morfológicas tintoriales se realizó la
tinción de Gram. (Bergey´s Manual, 1984)

Degradación de Crudo: Para determinar la capacidad degradadota del crudo pesado se añadió 1%
de crudo en tubos de cultivo con 9 ml del medio Solana. El medio se inoculó con una asada del
cultivo de la cepa, los tubos se incubaron durante 21 días a 37 0C con un indicador de crecimiento
por cambio de color.

Hidrocarburos Alifáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de

hidrocarburos alifáticos del petróleo como única fuente de carbono se añadió 1 % de queroseno y
1% de isooctano por separado en tubos con 9ml de medio Solana. El medio inoculado con una
asada del cultivo se incubó durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento por cambio de color.

Hidrocarburos Aromáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de

hidrocarburos aromáticos se utilizó 1% de naftaleno (poliaromático) y 1% de tolueno (aromático
alquilado) en medio basal Solana por separado. El medio se inoculó con una asada del cultivo y se
incubó, durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento por cambio de color.

Crecimiento en caldo nutriente con 7% de Nacl: En esta prueba se usó como medio el caldo
nutriente de BIOCEN® al que se le añadió una solución al 7% de Nacl. Posteriormente, se esterilizó
a 121 0C durante 15 minutos, se inoculó con una asada del cultivo y se incubó a 30 0C, observándose
el crecimiento a las 24, 48 y 72 horas. Esta prueba se realiza con el objetivo de comprobar la
tolerancia de estas cepas a altas concentraciones de sales. El resultado es positivo cuando aparece
turbidez en el medio.

Crecimiento a 50 0C en caldo nutriente: Se sembraron por asada en caldo nutriente y se incubaron

a 50 0C. Se realizaron observaciones a las 24, 48 y 72 horas, con el objetivo de ver si las cepas
aisladas son mesófilas. El resultado es positivo cuando aparece turbidez en el medio.

Formación de ácidos y gas a partir de diferentes azúcares: Los azúcares empleados fueron:
glucosa, xilosa, manitol y arabinosa. El medio inoculado se incubó durante 48 h a 300 C. A cada tubo
de le introdujo una campana Durhan para detectar la producción de gas. Un cambio de coloración
indica la producción de ácido a partir del azúcar y burbujas en la campana indican producción de gas.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el pozo BJ-314 muestreado se encontró una población de bacterias aeróbicas de 107 UFC/g de
crudo (Tabla I), esta es una concentración alta de microorganismos, adecuada para la aplicación de
la recuperación por microorganismos y coincide con los resultados obtenidos en otros trabajos de
caracterización microbiológica realizados a pozos de petróleo de este yacimiento (Acosta y col.
2000).

El petróleo es un compuesto orgánico rico en nutrientes y este crudo en particular está emulsionado
con 60 % de agua lo que favorece la biodisponibilidad de los nutrientes esenciales necesarios para el
crecimiento de bacterias que utilizan al crudo o sus derivados para su desarrollo, con un pH alrededor
de 7, óptimo para la degradación de hidrocarburos por bacterias aerobias.

Las bacterias degradadoras de crudo resultaron igualmente abundantes con una población de 103
UFC/g. El crudo resulta un sustrato, cuya composición química ha demostrado tener una influencia en
la generación de bacterias que lo utilizan como fuente de carbono y energía. Esto resulta muy
favorable ya que una de las vías más utilizadas dentro de la combinación de mecanismos
responsables de la estimulación de petróleo es la degradación del petróleo en el reservorio, ya que
las bacterias alteran la estructura carbonada del petróleo, haciéndolo mas fluido y facilitando la
recuperación.

Aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos

Como se aprecia (tabla II) las bacterias aisladas no tuvieron mucha diversidad, prevalecieron los
bacilos Gram negativos, microorganismos comúnmente aislados de crudo y de suelos contaminados
con hidrocarburos (Watanabe y col. 2000) capaces de mineralizar los hidrocarburos dodecano,
hexadecano, tolueno y naftaleno del petróleo (Bogdrossy y col. 1995).

Caracterización de las cepas aisladas como biodegradadoras

Las cepas aisladas utilizaron todos los compuestos hidrocarbonatos como única fuente de carbono y
energía (Tabla III). Esta versatilidad nutricional es muy importante ya que son pocas las especies
microbianas reportadas con potencialidades para degradar varios tipos de hidrocarburos pues la
mayoría de las cepas degradadoras de hidrocarburos pueden mineralizar los compuestos
poliaromáticos o alifáticos pero no ambos, lo cual sugiere que estas dos vías pueden ser excluyentes
en muchos casos (Whyte y col. 1997)

Estas capacidades biodegradativas de las cepas aisladas resultan muy favorables para la utilización
de estas bacterias aerobicas endógenas como degradadoras de fracciones pesadas de crudo,
teniendo en cuenta que este petróleo de donde fueron aisladas y al que están adaptadas
nutricionalmente, está biodegradado con altos contenidos de resinas y asfaltenos (Pascual y col.
1994)

Las bacterias promisorias a utilizar en esta metodología (MEOR) deben ser resistentes a niveles
relativamente altos de salinidad y temperatura ya que son condiciones que normalmente existen
dentro del reservorio y son limitaciones mencionadas para la aplicación de MEOR (Cobeñas y col.
2004). En el caso de la capa donde se encuentra el pozo (BJ-314) los niveles de salinidad están
alrededor de 3,5 % y la temperatura es de 45 0 C (Martínez y col. 2005) por lo que las bacterias
aisladas se sometieron a niveles 7% de salinidad y a 50 0 C de temperatura, niveles cercanos a las
condiciones de este pozo. Los resultados se muestran en la Tabla IV.

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Las cepas aisladas (crecieron con 7% de concentración de sales y a 500 C de temperatura) mostraron
ser resistentes a estas condiciones adversas de crecimiento que pueden existir en un reservorio.
Estas características de las cepas son esenciales para utilizarlas como inóculos bacterianos en la
inyección de los pozos para la recuperación de petróleo. Hay reportes que plantean que por encima
de 15 % de concentración de sales puede inhibirse el crecimiento de algunas especies microbianas y
que la mayoría de las especies biodegaradadoras de hidrocarburos son mesófilas. (Penin y
col.1990).

Las cepas 3141 y 3142 produjeron ácidos y gas al fermentar la glucosa (Tabla IV), capacidades muy
importantes para utilizar éstas en los procesos de inyección, ya que otro de los mecanismos
importantes en los procesos de MEOR (recuperación utilizando microorganismos) es la limpieza de
la vecindad del pozo mediante los ácidos y gases originados in situ, donde el tamaño promedio de las
gargantas porales es incrementado y como resultado la presión capilar en la región vecina al pozo se
transforma y es favorable el flujo de petróleo (Cobeñas y col. 2004)

CONCLUSIONES

En el pozo estudiado (BJ-314) del polígono I, se encontró una microbiota amplia en

concentraciones de 107 UFC/g de crudo y una concentración de 103 UFC/g de bacterias con
características biodegradadoras, las cuáles son importantes para ser utilizadas en la recuperación de
petróleo por métodos biotecnológicos. Se aislaron 4 cepas con características promisorias, dos de
ellas 3141 y 3142 con potencialidades más marcadas para ser utilizadas en procesos de MEOR
(Recuperación Mejorada por Microorganismos) en el pozo BJ-314 del polígono seleccionado.

BIBLIOGRAFÍA
Acosta, S; Bugnes, G; González, F y Novoa, G. “Caracterización de pozos en yacimientos Cubanos para la
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Cobeñas, R, I.T.B.A y Stanley L. Hogg, Valdez Rojas y Hogg, S.A “Mejoramiento de la Producción de petróleo
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Martínez, Y y col. Informe Etapa I , “Selección del área experimental y caracterización de los fluidos ”, Proyecto
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NC 33-15 : “Petróleo y sus derivados” , Métodos de Muestreo (1983)
Pascual, O.; Navarro, A. E. et al.: “Aproximación Estadística a la Caracterización y Correlación de los Petróleos
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Penín, M.E. ”Sistema anaeróbico para tratamiento de residuales de planta de pulpa y papel ” Tesis de
doctorado, CIQ (1990)
Watanabe, C y col. Molecular characterization of bacterial populations in petroleum-contaminated groundwater
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Finerty (1983). Biorremediación como alternativa ambiental. Proyecto 2416, Etapas 6-8, 2004, CEINPET,
Ciudad de la Habana, Cuba

TABLAS

Tabla I. Conteo de bacterias aeróbicas y bacterias degradadoras de hidrocarburos en el Pozo BJ-314.

Conteo de bacterias aerobias Conteo de bacterias degradadoras

Pozo UFC / g crudo
UFC / g crudo
BJ- 314 107 3 x 103

Tabla II. Características Culturales-Morfológicas y Tintoriales de las cepas aisladas

Pozo Cepa Tinción Gram Características Culturales

3141 Colonia verde pequeña, bordes ondulados, pigmento verde
Bacilos negativos
flourecente
2
BJ 314 Colonia verde pequeña, granulosa, plana, bordes ondulados.
Bacilos negativos
314 Olor a uvas, pigmento verde flourecente.
3
314 Bacilos
Colonia amarilla, granulosa, opaca, plana, bordes ondulados
Positivos
4
314
Cocobacilos
Colonia blanca, pequeña circular, plana, bordes enteros.
Positivos

Tabla III. Caracterización biodegradativa con diferentes hidrocarburos de las cepas aisladas del pozo BJ-314.

Pozo Cepas Naftaleno Crudo Kerosina Isooctano Tolueno

3141 ++ ++ ++ ++ ++
BJ 3122 ++ ++ ++ ++ ++
314 3143 ++ ++ ++ -- ++
3144 ++ ++ ++ -- ++

Leyenda:
++ Crecimiento por cambio de color en los dos tubos
- - no crecimiento por cambio de color en los dos tubos

Tabla IV. Crecimiento de las cepas aisladas del pozo BJ-314 en condiciones de alta salinidad y temperatura.

Cepas Crecimiento 7% NaCl Crecimiento a 50 0C

3141 ++ ++
3122 ++ ++
3143 ++ ++
3144 ++ ++

Leyenda:
++ Crecimiento por turbidez en los dos tubos

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Tabla V. Producción de ácidos de las cepas aisladas.

Cepas Glucosa Xilosa Manitol Arabinosa

3141 ++ gas ++ ++ --
3142 ++ gas ++ ++ --
3143 -- ++ ++ --
3144 ++ ++ -- ++

Leyenda:
++ Crecimiento por cambio de color en los dos tubos
-- no crecimiento

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