PRACTICA N° 4: DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCION INTRACELULAR DE LAS

ENZIMAS DE OXIDO- REDUCCION

SISTEMA I: Usando 2,6-diclorofenolindofenol

I. PROCEDIMIENTO:

 Colocar en cada uno de los 5 tubos de ensayo, los respectivos reactivos, de acuerdo
al siguiente cuadro:

COMPONENTES (ml) I II III IV V

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5
2-6 diclorofenolindofenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato de Sodio 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Fracción nuclear - 0.5 - - -
Fracción mitocondrial - - 0.5 - -
Fracción microsomal-soluble - - - 0.5 -
Homogenizado total - - - - 0.5

 Luego de formado el sistema, se mezcla y se deja en reposo a temperatura ambiente.

 Observar constantemente y anotar los cambios de color, para interpretar los
resultados.

II. OBSERVACIONES:

TUBO N° I:

En este tubo de ensayo, se encuentra la sustancia buffer, el indicador (2-6

diclorofenolindofenol) y el sustrato (succinato de sodio); al no encontrarse el complejo
enzimático, no se produce reacción, ya que no se puede formar el complejo E-S y por tanto,
tampoco existe formación del producto; esto se evidencia en que en el tubo de ensayo
aparece un color azul oscuro.

TUBO N° II:

En este tubo de ensayo, se encuentra la sustancia buffer, el indicador (2-6

diclorofenolindofenol), el sustrato (succinato de sodio) y la fracción nuclear. Observamos
que aparece un color azul oscuro, con lo que podemos deducir que en la fracción nuclear no
existen enzimas que se unan al sustrato y formen el complejo E-S , por lo que no se produce
la reacción
 TUBO N° III:

En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el

sustrato (succinato de sodio) y la fracción mitocondrial (complejo enzimático). Observamos
que el color azul oscuro se decolora, lo que es indicador de que existe una reducción y por
tanto se ha producido la reacción. De esto deducimos que en la fracción mitocondrial sí
podemos encontrar enzimas que se unan al sustrato, formen el complejo E-S y por tanto,
formen el producto.

TUBO N° IV:

En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el

sustrato (succinato de sodio) y la fracción microsomal (organelas pequeñas tales como:
ribosomas, REL, RER) . Observamos que el color que aparece es azul oscuro, lo que indica
que no se ha producido la reacción, es decir, que en las organelas presentes en la fracción
microsomal, no se encuentran enzimas para poder formar el complejo E-S y posteriormente
el producto.

TUBO N° V:

En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2-6 diclorofenolindofenol), el

sustrato (succinato de sodio) y el homogenizado total (donde se encuentran todas las
fracciones ya mencionadas). Se observa un cambio de color, ya que el azul se decolora; lo
que nos indica que se ha producido una reducción y por tanto, una reacción. Esto quiere
decir que en el homogenizado total sí existen enzimas para poder formar el producto.

SISTEMA II: Usando p-fenilendiamina.

I. PROCEDIMIENTO:
  Colocar en cada uno de los 5 tubos de ensayo, los respectivos reactivos, de acuerdo
al siguiente cuadro:

COMPONENTES (ml) I II III IV V

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0
P-fenilendiamina 1% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Fracción nuclear - 0.5 - - -
Fracción mitocondrial - - 0.5 - -
Fracción microsomal-soluble - - - 0.5 -
Homogenizado total - - - - 0.5

 Luego de formado el sistema, se mezcla y se deja en reposo a temperatura ambiente.

 Observar constantemente y anotar los cambios de color, para interpretar los
resultados.

II. OBSERVACIONES:

TUBO N° I:

En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer y la p-fenilendiamina que actuará

como indicador y sustrato. Observamos que se torna un color marrón claro, por lo tanto este
color evidenciara que no se ha producido reacción, ya que en este tubo de ensayo no existe
ningún complejo enzimático para poder formar el producto.

TUBO N° II:

En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, la p-fenilendiamina (indicador y

sustrato) y la fracción nuclear. Observamos que el color que aparece en este tubo de ensayo
es el color marrón claro y comparándolo con el tubo n°1 nos damos cuenta que este color es
indicador de que no se ha producido reacción; por lo tanto deducimos que en la fracción
nuclear no existen enzimas para poder llevar a cabo la reacción de óxido-reducción y por
tanto formar el producto.

TUBO N° III

En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer , la p-fenilendiamina (indicador y

sustrato) y la fracción mitocondrial (complejo enzimático). Observamos que aparece un
color marrón oscuro, lo que indica que sí se produce formación de producto y por tanto, sí
 hay reacción. Esto debido a que en la fracción mitocondrial sí existen enzimas para poder
formar el producto y llevar a cabo la reacción.

TUBO N° IV:

En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, la p-fenilendiamina (indicador y

sustrato) y la fracción microsomal. Observamos que existe un color marrón claro, que
indica que no se ha formado el producto y por tanto no se ha producido la reacción. Esto
debido que en la fracción microsomal (organelas pequeñas: REL, RER y ribosomas) no
existen enzimas capaces de catalizar reacciones de óxido-reducción.

TUBO N° V:

En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer , la p-fenilendiamina (indicador y

sustrato) y el homogenizado total. Observamos que en este tubo el color se torna marron
oscuro y esto debido a que si se produce la reacción, ya que en el homogenizado, existe
también fracción mitocondrial donde se encuentran las enzimas.

CONCLUSION:

 Las enzimas de óxido-reducción se encuentran distribuidas en la mitocondria y en el

experimento, también se encuentran en el homogenizado total, esto debido a que en dicho
homogenizado también se encuentra la fracción mitocondrial.

CUESTIONARIO:
 1. ¿Qué es el 2,6 diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria?

El 2,6 diclorofenolindofenol es una sustancia indicadora que es azul en su forma oxidada y

se decolora cuando se reduce. Éste actúa entre la FMN y la CoQ
Así, si un inhibidor impide que el 2,6 diclorofenolindofenol se reduzca, quiere decir que
dicho inhibidor esta actuando en alguna región anterior a la FMN, pero si el indicador se
reduce, quiere decir que el sitio de inhibición esta en algún lugar posterior a la
CoQ,inclusive.

2. ¿Qué es el p-fenilendiamina y como actúa en la cadena respiratoria?

La p-fenilendiamina es una sustancia indicadora que también puede actuar como sustrato.
Cuando se oxida, es decir cede electrones, cambia de color a
marrón oscuro; de lo contrario, mantendrá un color
marrón muy claro. De esta manera se puede verificar si la
cadena comprendida entre el citocromo C y el O 2 es o no
permeable al flujo de electrones proveniente del
indicador.
Si se aplica un inhibidor en algún punto de esta porción de la cadena, la p-fenilendiamina no
se oxidara, pero si el inhibidor no impide su reducción quiere decir que esta actuando en
algún sitio anterior al citocromo C o de la cadena.

3. Grafique, usted en una cadena de óxido-reducción biológica a la acción de los indicadores

redox 2,6 diclorofenolindofenol y p-fenilendiamina.

FAD
SUCCINAT
O Fe-S

Hem a
Cit O2
NADH FMN, Q Cit b, Fe-S, hem
C
Fe-S Cit c1 a3
 2,6 diclorofenolindofenol p-fenilendiamina

ADP + ATP
ADP + ATP ADP + ATP
Pi
Pi Pi
4. ¿Qué es un homogenizado de hígado y como se obtienen las fracciones celulares por
centrifugación diferencial?

Es un preparado que contiene fracciones mitocondrial, microsomal y nuclear. Se prepara

mediante los siguientes pasos (T° = 0 °C – 4 °C):
 Colocar el hígado en petri y eliminar su capsula y otros tejidos periféricos.
 Pesar 10 g de hígado y cortar en fragmentos pequeños.
 Colocar en un homogenizador potter y agregar solución de KClO 154M.
 Hacer presión manual con el embolo girando hacia el fondo.
 El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en
tubos de polietileno, previa calibración en la balanza, se emplea una centrifuga
refrigerada.
 El sobrenadantes separado por un beaker de 500 ml
 El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100 ml.
 El sobrenadante anterior es centrifugado a 1500 revoluciones por 15 minutos en la
centrifuga retirada.
 Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fracción microsomal con el
citosol.
 El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial.

5. ¿En qué fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido-reducción?

 Fracción mitocondrial
 Homogenizado total

6. Haga un esquema de la centrifugación diferencial.