Conceptos básicos de

HPLC
TEMARIO (día 1)

1. Definiciones generales
2. Termodinámica en cromatografía
3. Hidrodinámica en cromatografía
4. Detectores
5. HPLC fase reversa
6. HPLC fase normal
7. Tipos de HPLC y UHPLC
Practica (día 2)

A. Recorrido por la tecnología de punta

B. Implementación de métodos en HPLC
C. Escalamiento de métodos de HPLC a UHPLC
Cromatografía
La cromatografía es un método de separación fisicoquímico de los componentes de una
mezcla, los cuales se distribuyen entre dos fases, una fase estacionaria de considerable
área superficial y una fase móvil, que pasa a través de la anterior.
 Fase estacionaria es un sólido finamente dividido con elevada área superficial, la cual es
contenida dentro de una columna tubular

Fase móvil fluido que se filtra a través y a lo largo de la fase estacionaria en una dirección
definida
Definiciones Generales

• CROMATOGRÁFIA DE PARTICIÓN:
• La fase estacionaria es un líquido que se mantiene fijo por adsorción sobre un solido inerte y poroso, en
tanto que la fase móvil sea un gas o un liquido.
• Cromatografía de líquidos y gases

• CROMATOGRÁFIA DE ADSORCIÓN:
• La fase estacionaria es un solido que funge como adsorbente y la fase móvil puede ser un liquido o un gas; la
separación se basa en repetidas etapas de adsorción- desorción.
Cromatografía de Gases y líquidos
Tipos de HPLC
HPLC de exclusión molecular
La cromatografía de exclusión molecular separa las partículas de la
muestra en función de su tamaño.
En este tipo de cromatografía la fase estacionaria hecha de largos
polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.
Definiciones Generales
HPIC (cromatografía de intercambio ionico)
En la cromatografía de intercambio iónico la retención se basa en la atracción
electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria.
Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los iones de carga
opuesta son retenidos por la columna.
En cromatografía de iones los detectores mas utilizados son electroquímico y
conductividad.

SO3- H+Cl
H+Cl
SO3-
H+Cl
SO3- H+Cl
SO3- H+Cl
 Proceso de la Separación en HPLC

 Muchas equilibrios de Adsorción-Desorción

Película de fase
estacionaria Eluente ocurren durante el paso de la muestra a
través de los componentes de la fase
estacionaria.
 La separación depende de las diferencias
en los coeficientes de distribución de los
componentes de la muestra.
 La velocidad de migración en una columna
para cada analito es diferente e individual y
se expresa en terminos del factor de
capacidad (K)

Moléculas de
 El factor de capacidad idealmente debe de
Muestra estar entre 1 y 5
Definición de Parámetros Relacionados
en la retención
tR2
tR: Tiempo de Retención

Señal
s tM : Tiempo Muerto (Elución de un compuesto no retenido)
tR1
tM tR’: Tiempo de Retención Corregido

t’R1 w tR = t’R + tM
t‘R2 Tiempo

Factor de Retención (k): Factor de Separación ()

tR  tM t´R t´R 2 k2
k   
tM tM t´R1 k1
k es independiente del  es la medida de la selectividad de
flujo y de las un método para separar compuestos
dimenciones de la  = 1 significa co-elución
columna (aun que si del
tiempo de retención)
La teoría de HPLC puede ser subdividida en dos aspectos:
Termodinámica e hidrodinámica.

El aspecto hidrodinámico de la migración de la banda

cromatografíca responsable del ensanchamiento de la banda
cromatografíca.

El aspecto termodinámico es responsable de la retención de

los analitos en la columna.
Eficiencia de la Columna (Número de Platos)

 El modelo de platos asume que la columna cromatografía contiene un

gran número de capas separadas llamadas platos teóricos
 Estos Platos en realidad no existen; Ellos son producto de la
imaginación para ayudarnos a describir el proceso de separación
(equilibrios) (termodinámica de la cromatografía)
 También nos sirven para medir la calidad de la columna o la eficiencia del
método.
– Por el número de Platos (N) en una columna (entre más grande
mejor)
– O por la distancia entre uno y otro plato teórico (HETP, H); la altura
equivalente del plato teórico (entre menor mejor)
 La columnas con gran número de platos teóricos son más eficientes que
columnas con menos números de platos teóricos
 Una columna con alta eficiencia nos presentará picos más altos y agudos
Eficiencia de la columna (numero de platos)

 eqcuación para el cálculo de la eficiencia:

2
 tR 
N a   
 w
N = número de platos teóricos (adimencional)
a = constante dependiendo del método a emplear para el cálculo
tR = tiempo de retención del pico
w = ancho del pico a cierta altura
Método a
USP estandar: ancho del pico en la línea 16
base

EP estandar: ancho del pico al 50% de 5.54

altura

JP estandar: ancho del pico a la mitad 5.55

de altura
• Teoría de los platos teóricos (termodinámica)

Columna
cromatográfica Columna de
destilación

• Teoría de las velocidades (cinética)

Termodinámica en cromatografía

El proceso de elución es descrito como una serie de procesos

de adsorción-desorción el cual es continuo desde el momento
que la muestra es inyectada dentro de la columna hasta el
tiempo en el cual los solutos salen de ella. Equilibrios que hay
entre la fase estacionaria y la muestra.

Si la densidad de la columna cambiamos la velocidad cinética de los

analitos.
 2
L  wh 
σL2
H    
L 8 ln 2  t R 
2s 2
L  tR 
concentración N   5.54   
H  wh 
H, altura del plato; N, número de platos
L, longitud de la columna
tR, tiempo de retención
wh, ancho del pico a la mitad
2s de la altura

Menor H o Gran N
significa picos agudos!
tiempo (longitud)
La eficiencia esta relacionada con el ensanchamiento del sistema
 Efectos Extra Columna
– Tubería y conecciones
– Celda de Flujo
– Pre acondicionador de temperatura
– Filtros en Línea
 Efectos de la columna
– Procesos no deseados
» Daño del empaque, volumenes muertos
» Impurezas de la fase estacionaria o filtro de entrada sucio
» Diferencias en la Tº de la fase y la columna
– Procesos naturales
» Difusión de Eddy Teoría de Van Deemter
» Difusión Longitudinal
» Resistencia a la Transferencia de Masa
  Diámetro de Partícula
 Calidad del Empaque
 Velocidad Linear de FM
80
 Características de la Muestra
 Viscosidad del Eluente
dp = 10 µm
60 dp = 5 µm
dp = 3 µm

 Factor de Retencióan
dp = 1.7µm

H [µm]
Van Deemter describe 40

unicamentela optimización de
la eficiencia pero 20

actualmente tambien se
busca la optimización de la 0
0 2 4 6 8 10
resolución u [mm/s]
Como determinar la resolución Rs entre
2 Picos?
tR
2
tR
1

señal

wh wh2
1

t
wb1 wb2


2 t R 2  t R1   1.177t R2  t R1 
Rs 
w h1  w h2
= 1.5 Objetivo !!
w b1  w b 2

R = 1.5 se define como la resolución en la línea base  ideal para lograr la separación
Resolution R

 La resolución es el objetivo de cada método LC

 R es proporcional a la raíz cuadrada de N
 R es influenciada por el factor de retención k
 R es influenciada por el factor de sepración 
 Resolución, un número mayor a 1.5 significa que existe línea base
entre dos picos
 R menor a 1.5 significa que existe co-elución de picos
Selectivida
d

1 k  1
R  N  2

4 1 k  2

Eficiencia Retención
Como se ve la influencia de los 3 parámetros?

N

k
Relaciones hidrodinámicas (ecuación de Van Deemter)
Efecto multi-trayectorias
El ensanchamiento de banda en la fase móvil se debe en
parte a la multitud de trayectorias por las que las moléculas
pueden desplazarse a través de la columna empaquetada.
Como resultado, algunas moléculas recorren trayectorias más
cortas y algunas otras recorren trayectorias más largas.

A
Relaciones hidrodinámicas (ecuación de Van Deemter)
Difusión longitudinal B/u
La difusión longitudinal provoca la migración de un soluto del
centro concentrado de una banda a las regiones más diluidas
a ambos lados de la misma (es decir, a favor y en contra de la
dirección del flujo).

u
B
Relaciones hidrodinámicas (ecuación de Van Deemter)
Resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil
Durante el paso a través de la columna, las moléculas son
constantemente y reversiblemente transferidas de la fase
móvil a la fase estacionaria.
Esta transferencia no es instantánea se necesita un tiempo
para que las moléculas pasen (por difusión) a través de la fase
móvil, alcancen la interfase y finalmente puedan entrar a la
fase estacionaria.

C
 Hidrodinamica (Van Deemter)

B
H A   C  u
Altura de Platos (HETP)
u A

u
B
Resistencia a la
Transferencia de masa
Cu

Difusión de Eddy A
Difusión Longitudinal B/u C
Velocidad de la Fase Móvil (u)
 DETECTORES

Detector de longitud de ultravioleta

Detector de fluorescencia.
Detector de índice de refracción
Detector Corona
Detector de espectrometría de masas.
DETECTOR ESPECTROFOTOMÉTRICO DE LONGITUD ULTRAVIOLETA:
Mide la capacidad de la muestra para absorver la luz ultra violeta.
- DETECTORES DE LONGITUD DE ONDA FIJA.
- DETECTORES DE LONGITUD DE ONDA VARIABLE.
- DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS.
DETECTORES

DETECTOR DE FLUORESCENCIA:
Mide la capacidad de un componente para absorver y re-emitir la luz a varias
longitudes de onda. Cada componente tiene una característica fluorecente. La
luz emitida de excitación pasa a través de la celda de flujo, hacia el
fotodetector mientras que el monocromador mide las longitudes de onda de
emisión.
DETECTORES..
DETECTOR DE INDICE DE REFRACCIÓN:
También es conocido como detector de refractómetro
diferencial. Se basa en el hecho de que en la mayoría de
los líquidos tienen una un diferente índice de refracción,
el detector determina la diferencia entre la fase móvil y
el soluto que eluye de la columna.
DETECTORES

DETECTOR CORONA
El detector Corona Ultra es un detector universal que a sido diseñado
para medir analitos no volátiles a semivolátiles

Independientemente de su estructura química o sus propiedades

fisicoquímicas

La respuesta es generada solo por la masa del analito

Detectores
• DETECTOR DE MASAS
• Detector univeral

• Simple cuadrupolo; no selectivo

• Triple cuadrupolo; selectivo
• Fuente de ionización de las moléculas (+) ó (-), fracmentación de
muestras movilidad por campos magnéticos.
Fase Reversa y Fase Normal
Fase Normal
Fase Reversa
Fase Reversa y Fase Normal
Fase Reversa
Fase Normal
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Mecanismo de Retención
Columnas
 Portafolio para LC & LC/MS de Thermo Scientific
Familia
Atributo Logrado mediante
(Hidrofobicidad)

Tecnologia de núcleo mejorado con

 
Accucore
Máximo Rendimiento partículas porosas de núcleo sólido de
(Baja) 2,6 y 4 μm

 
Hypersil GOLD Sílica de alta pureza de 1,9, 3 y 5 μm
Selectividad y forma de pico
(Baja) Amplia gama de fases convencionales

Sílica de pureza ultra alta de 2,2, 3 y 5

 
Acclaim Especialidad y aplicación
μm Fases estacionarias innovadoras y
(Media/Alta) específicas
únicas

 
Syncronis Sílica de alta superficie 1.7, 3 y 5 μm,
Robustez y reproducibilidad
(Alta) Densa unión, doble endcapping,
pruebas rigurosas

 
Hypercarb Capacidades de separación
100% Carbón grafítico poroso
(Muy Alta) extendidas
Fases Comunes para HPLC y sus Usos
 Selección de Columnas según la fase estacionaria
Analyte Solubilty
Non- Polar
 Selección de Columnas según la fase estacionaria
Analyte Solubilty
Non- Polar
Selección de Columnas según la fase estacionaria
Selección de Columnas según la fase estacionaria
Sistemas UHPLC
•High-Ultra
•Performance
•Liquid
•Cromatografy
Ultimate 3000
• Sistema robusto para análisis
rutinarios
• Capacidad de 120 viales de 2 mL
• SD 9000 psi
• RS 15000 psi
• Facilidad de uso con Software
Chromeleon
Ultimate 3000
Vanquish Vanquish

XRS

RSLCnano RSLC/ Bio RS

Standard

Basic Automated
• Highest pressure capability up to 1500 bar
• Lowest system dispersion by optimized system setup and
flow path
• Extended sample capacity: 4 sample containers in the
sampler
• Space for 9 racks or deep well plates/ 20 shallow well
plates in the charger
• Two thermostatting modes to face diverse application
challenges
• UHPLC system for • Binary and Quaternary UHPLC • Unmatched detection sensitivity and linearity up to 3 AU
Nano/Cap/Micro range systems • Highly LC/MS optimized
quaternary UHPLC system
• 20 nL/min – 50 µL/min up to • 1000 bar up to 5 mL/min
800 bar • Pressures up to 1250 bar
• 200 Hz data rate
• Continuous direct flow • Flow rates of up to 2 mL/min
• Advanced workflows with Dual
• 620 bar UHPLC compatible • Open Autosampler available
• Snap-in valves systems
• Flow rates up to 10 mL/min
• Highly economic & reliable
• Highest flexibility with Dual
• 620 bar UHPLC compatible solutions
• Flow rates up to 10 mL/min

620 bar 800 bar Up to 1000 bar 1250 bar 1500 bar
Vanquish Flex
• 15000 psi bomba
cuaternaria
• Capacidad para 216 viales
de 2 mL
• Tecnología Light pipe
• Tubería Viper
• Dos modos de
transferencia de calor
Vanquish Horizon
• 22,000 psi presión bomba
binaria
• 4 racks de 54
• Tecnología Light pipe
• Tubería Viper
• Dos modos de transferencia de
calor
Bomba
• Presiones de 15000/22000 psi
• Biocompatible
• 2 o 3 canales de solventes
• 9 combinaciones de solventes
• Degasificador integrado
Autosampler
• Válvula de inyector de “no
mantenimiento”
• Temperaturas de 4 – 40 °C
• Sistema biocompatible
• 4 racks con funcionamiento de
código de barras
Compartimento de
• Preheater (activación
columna
opcional)
• Temperatura de 5 – 120 °C
• Sistema de identificación de
columnas
• Conducción
• Convección (still air y Forced
air)
• Puede crecer hasta con tres
compartimentos de columna
Detector DAD
• Tecnología Light pipe
• Celda de 10 mm
• Celda 60 mm alta sensibilidad
• Menor ruido en línea base
• Reduce efectos térmicos
 Lightpipe

• Alta sensibilidad
• Flujo y volumen de muestra
mínimos
• Disminución de ruido
Tecnología Lightpipe
Detector UV
• 4 canales de longitud de onda
• Arreglo de diodos/multilongitud
de onda
• Señal ruido minimizado
Otros detectores

Fluorescencia CAD
Vanquish Duo
Vanquish Duo VS Vanquish
Chromeleon 7.2
Chromeleon
• Incrementa la7.2
productividad
por el fácil procesamiento
• Controla los equipos
LC/IC/CG/MS
• Complimiento regulatorio
• Administración simplificada
• Conexión por sistema de
redes
• Extension Pack
Gracias por su atención
Fátima Cuevas Reséndiz
Mariano Martínez Guerrero

Teléfono. 55 9876 5432

correo@canitec.com.mx