3 Biotech (2016) 6:53
DOI 10.1007 / s13205-016-0377-y
ARTÍCULO ORIGINAL
Producción, purificación y caracterización de una serina proteasa alcalina
termotolerantes de una nueva especie Bacillus caseinilyticus
Thirumala Mothe 1 • Vishnuvardhan Reddy Sultanpuram 1
Recibido: 12 Junio ​2015 / Aceptado: 3 Octubre 2015 / Publicado en línea: 13 Febrero el año 2016
El autor (s) de 2016. En este artículo se publica con acceso abierto al Springerlink.com
Resumen Las proteasas alcalinas son enzimas importantes en muchas aplicaciones
industriales, especialmente como aditivos en la industria de los detergentes de
lavandería. Aunque hay una serie de
Bacilo especies que se informó de que la producción de proteasas, la
deficiencia ef de una proteasa producida por una nueva cepa tiene que ser
estudiado en comparación con los otros. Por lo tanto, en este estudio, una
proteasa de serina alcalina producida por una nueva especie Bacillus
caseinilyticus se purificó y se caracterizó por su posible uso en la industria
del detergente. sulfato de amonio, diálisis y columna DEAE métodos
cromatográficos fueron utilizados para la purificación de la proteasa alcalina
aislado. El peso molecular de la proteasa se determinó por SDS-PAGE y se
encontró que era 66 kDa. Péptido toma de huellas digitales fi masa (PMF)
se llevó a cabo usando MALDI-TOF-TOF espectrometría de masas y se
encontraron los péptidos que ser similar a la de la proteasa subtilisina. se
encontró actividad específico de proteína fi ed puri ser 89,2 U / mg. El pH
óptimo y la temperatura para la actividad enzimática estaban a pH 8 y 60 C,
respectivamente, que muestran la estabilidad con CaCl 10 mM 2. Fenil metil
sulfonil fluoruro (PMSF) en ambos 5 y 10 concentraciones mM inhibió
completamente la actividad de la enzima que sugiere su naturaleza serina.
EDTA, iones metálicos Mg 2? y Ca 2?
aumento de la actividad enzimática. El un factor a la optimización del tiempo de
la producción de proteasa se realizó para identificar los factores importantes
que afectan a su producción. Después de la optimización, la proteasa se
produjo a escala de laboratorio, purificado y caracterizado. Este álcali,
termotolerantes
y Vishnuvardhan Reddy Sultanpuram
vishnu_micro@yahoo.co.in
1 Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento de Bioquímica,
Mahatma Gandhi Universidad, Anneparthy, Yellareddygudem (PO),
Nalgonda 508254, Telangana, India
Se encontró serina proteasa ser significativamente estables en presencia de
diversos tensioactivos y H 2 O 2. Además, era satisfactoriamente capaz de eliminar las
manchas de sangre cuando se utiliza como un aditivo junto con detergente
comercial que sugiere su potencial aplicación en la industria de detergentes de
lavandería.
Palabras clave industria de los detergentes Ensayo de Proteasa de aplicaciones de
lavandería
Introducción
Casi dos tercio de proteasas comerciales son producidos por especies de hongos,
levaduras y bacterias (Wang et al. 2013 ). Las proteasas tienen diversas
aplicaciones en diversas industrias, tales como, alimentos, productos
farmacéuticos, seda y diagnósticos con uso predominante en las industrias de
detergentes y de cuero (Banik y Prakash 2004 ; Gupta et al. 2002 ). La demanda de
enzimas industriales, en particular de origen microbiano, es cada vez mayor
debido a sus aplicaciones en una amplia variedad de procesos. Las proteasas
representan uno de los tres grupos más grandes de enzimas industriales y
representan aproximadamente el 60% de la venta en todo el mundo total de las
enzimas (Rajkumar et al.
2011 ).
Las proteasas son ampliamente clasificados como endo o exoenzimas
sobre la base de su sitio de acción en sustratos proteicos. Se clasifican
adicionalmente como proteasas de serina, proteasas de aspártico, proteasas
de cisteína o metaloproteasas en función de su mecanismo catalítico
(Geethanjali y Subash
2011 ). serina proteasas alcalinas de origen microbiano poseen considerable
potencial industrial debido a su diversidad bioquímica y amplias aplicaciones en
la curtiduría, las industrias de alimentos, formulaciones medicinales, detergentes
y procesos como el tratamiento de residuos, la recuperación de plata y la
resolución de mezclas de aminoácidos (Agarwal et al. 2004 ).
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Bacilo especies son especí fi cos productores de proteasa extracelular.
Varias proteasas alcalinas han sido purifica y caracterizado de muchos Bacilo monitoreados. El sobrenadante libre de células se recuperó por
cepas (Rao et al. 1998 ). La subtilisina Carlsberg producido por Bacillus
liceniformis
(Jacobs et al. 1985 ) Y subtilisina Novo producido por
Bacillus amyloliquefaciens ( Wells et al. 1983 ) Han sido las enzimas de
elección para las industrias de detergentes. Estas enzimas presentan una
actividad máxima a valores de pH alcalinos que van desde 8 a 10 (Horikoshi 1999sacarosa, lactosa, fructosa y maltosa), nitrógeno (1% w / v; cloruro de amonio,
). Generalmente, las proteasas alcalinas para aplicaciones detergentes
deben ser activos a temperatura superior a 40-50 C y el pH en el intervalo de
9-12 (Sellami-Kamoun et al. 2008 ; Hadder et al.
2009 ).
El proceso de purificación también aumenta las actividades fi
específicos de enzimas, haciéndolos más específico para aplicaciones
industriales. En el presente estudio, informe puri fi cación y caracterización
de una serina proteasa alcalina termotolerantes producido por una nueva
especie, Bacillus caseinilyticus.
materiales y métodos
materiales
Albúmina de suero bovino (BSA), reactivos para la estimación de proteínas
y SDS-PAGE, DEAE-celulosa se adquirieron de Hi-Media, Mumbai, India.
placas de gel de sílice de TLC (0,25 mm), ácido tricloroacético (TCA), la
caseína y otros productos químicos de grado analítico se adquirieron de
Merck, Mumbai, India.
Microorganismo
Una novela Bacillu s cepa SP T se aisló del lago Lonar alcalina, situada en
Buldhana, Maharashtra, India. La caracterización detallada taxonómica y
identificación de esta cepa propuesto como una nueva especie, Bacillus
caseinilyticus se ha descrito en otra parte (Vishnuvardhan Reddy et al. 2015
).
La optimización de las condiciones de cultivo y medios de comunicación para
la producción de proteasa: de un factor-a la vez
La producción de la proteasa Bacillus caseinilyticus se llevó a cabo en
medio basal con la siguiente composición (g l- 1): extracto de levadura, 0,01;
KH 2 correos 4, 0,5; MgSO 4 7H 2 O,
0,2; (NUEVA HAMPSHIRE 4) 2 HPO 4, 1,0; NaCl, 60 con diferentes
combinaciones de sustratos de carbono y nitrógeno (1% w / v) y 1% el
tamaño del inóculo a 37 C durante 48 h en un agitador rotatorio (180 rpm). El
pH inicial del medio se ajustó a
8.0. optimización paramétrica se realizó con respecto a los sustratos (tanto
de carbono y nitrógeno), iones metálicos, pH,
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la temperatura, periodo de fermentación y sus efectos individuales fueron
centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min a 4 C y se utiliza para
determinar la actividad proteasa extracelular.
Para el cribado signi fi cativas las variables que afectan la producción de
proteasas por Bacillus caseinilyticus, varios de carbono (1% w / v; glucosa,
extracto de malta, extracto de levadura, peptona y leche descremada)
sustratos, cloruros metálicos (CaCl 2, MgCl 2, ZnCl 2, FeCl 2 y CuCl 2) a una
concentración de 5 mM, el tiempo de incubación (24, 48, 74, 98 y 120 h),
temperatura (20, 30, 37, 40, 50, 60 y 70 C) y pH (6, 7,
8, 9, 10, 10.5 y 12) fueron probados por la estrategia de un factor-a-una vez. Los
controles se preparan simultáneamente para comparar los datos de las pruebas sin la
adición de cualquier carbono, fuentes de nitrógeno o cloruros metálicos.
ensayo enzimático
actividad de la proteasa alcalina se determinó con el método de Lin et al. ( 1969
) utilizando N, N- caseína dimethylated (DMC) como sustrato. La mezcla de
reacción que contiene 2 ml de 1% (w / v) DMC en tampón de
borato-hidrocloruro 100 mM (pH
8), 0.25 ml de 1% de ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (como un indicador
de color) y 1 ml de extracto libre de células con la enzima se incubó a 60 C
durante 25 min con agitación constante. Después de la incubación la reacción
se detuvo mediante la adición de 2,5 ml de agua fría durante 15 min. El
precipitado se separó después por centrifugación a 10.000 9 sol durante 15
min a 4 C y la absorbancia se midió a 450 nm frente al blanco. La cantidad de
la enzima que cataliza la escisión de 1 l mol de enlace peptídico de DMC por
minuto bajo las condiciones experimentales usadas se definió como una
unidad proteolítica (IU).
la estimación de proteínas
El contenido total de proteína se determinó por Lowry et al. ( 1951 ) Utilizando
albúmina de suero bovino como referencia.
Proteasa purificación
precipitación con sulfato de amonio
precipitación con sulfato de amonio fue el método por el cual sobrenadante
libre de células se precipitó usando diferentes niveles de saturación de sulfato
de amonio (40, 50, 60, 70 y 80%). Después de cada adición, la solución de
enzima se agitó durante 1 h a 4 C. La proteína precipitada se separó por
centrifugación a 12.000 9 sol durante 20 min a 4 C y se resuspendieron en un
volumen pequeño de tampón Tris-HCl 0,05, pH 8,0 para obtener la suspensión
de enzima concentrada. El precipitado
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se recogió por centrifugación a 10.000 9 sol durante 15 min, que se disolvió
en tampón 20 mM Tris-HCl (pH 8,8) y se dializó frente al mismo tampón
durante la noche a 4 DO.
La purificación de la proteasa por cromatografía en columna de celulosa
DEAE
Purificación adicional se llevó a cabo usando cromatografía en columna de
DEAE celulosa, para lo cual se aplicó enzima dializado 100 ml
a la columna de DEAE-celulosa
(2.4 9 45 cm) pre-equilibrada con tampón 0,05 M Tris-HCl (pH 8). La
enzima se eluyó con el mismo tampón a un caudal de 20 ml / h.
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y el péptido espectrometría de masas
El peso molecular de la proteasa alcalina se determinó mediante la ejecución
de la SDS-PAGE en contra de marcador de proteína de peso molecular
estándar, incluyendo la fosforilasa b (97,4 kDa), albúmina de suero bovino (66
kDa), ovoalbúmina de huevo (45 kDa), y anhidrasa carbónica (29 kDa ) y el
análisis después de la formación de banda (Laemmli 1970 ). Los geles se
tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 en ácido acético-agua metanol (5:
1: 5, v / v), y se decoloró con ácido acético al 7%. Además, la masa molecular
de los péptidos de la proteína purificada se analizó por el método de matriz de
desorción láser asistida por ionización de tiempo de fl ight-tiempo de fl ight
(MALDI-TOF-TOF) espectrometría de masas. La instrumentación utilizada fue
la 4800 espectrómetro de masas MALDI-TOF / TOF Applied Biosystems (AB)
Modelo. Re fl ectron análisis MS resume 1250 disparos de láser para generar
el mapa de péptidos fi huella digital (PFM) y los espectros se internamente
calibrado usando la bradiquinina como un estándar interno. Masas fueron
elegidos por el software Explorer Series AB 4000 (versión 3.0) para la
adquisición de MS / MS.
Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática y la estabilidad
Para determinar el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de
proteasa, las mezclas de reacción [enzima diluida (10 l l de enzima
purificado? 190 l l buffer)? 1% (w / v) DMC como sustrato] se incubaron a
diferentes valores de pH (6-12) y temperaturas (30-100 DO). Los diferentes
tampones utilizados fueron: (0,05 M) de fosfato (pH 6-7), Tris-HCl (pH 8-9) y
glicina-NaOH (pH 10-12). Para comprobar la estabilidad de pH 10 l l de
enzima y 190 l l de dichas soluciones tampón anterior se incubaron. Las
actividades residuales fueron medidos de acuerdo con el método de ensayo
estándar. Para determinar la estabilidad, la enzima se preincubó durante 24
h en las condiciones de reacción mencionadas anteriormente con 5 mM y
CaCl 10 mM 2.
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Determinación de la concentración por valoración de sitios activos
La valoración de sitios activos se realizó utilizando pag- nitrofenil
pag 0- guanidinobenzoato (PNPGB). Se preparó una solución 10 mM de
stock PNPGB en dimetilformamida (DMF). al 990 l solución de enzima ed fi
puri L, 10 l se añadió L PNPGB 10 mM, se mezcla rápida y completamente
y OD se midió inmediatamente a 410 nm (Chase y Shaw 1969 ).
Efecto de los inhibidores y los iones metálicos sobre la actividad de la proteasa
Efecto de diversos inhibidores, tales como, PMSF (metil fenil sulfonil
fluoruro) a 5 mM y concentraciones 10 mM, etileno ácido acético diamina
tetra (EDTA) y los iones metálicos (Ca 2 ?, mg 2 ?, Zn 2 ?, Co 2 ?, Fe 2 ?, N / A 2 ?, Cu 2? y
Ni 2?) a concentraciones 5 mM sobre la actividad de la proteasa fueron
estudiados. La enzima purificada se preincubó con los inhibidores y de
metal mencionados anteriormente
iones (10 l l enzy-
yo ? 190 l l 500 mM de tampón Tris-HCl y 1% (w / v) DMC como sustrato) durante 1
h a 60 C y después se ensayó la actividad residual. Los controles también se
llevaron a cabo sin inhibidores e iones metálicos, junto con pruebas.
Efecto de diferentes sustratos sobre la actividad enzimática
El efecto de diferentes sustratos en la proteasa alcalina se comprobó
utilizando diversos sustratos como, caseína, gelatina, albúmina de suero
bovino (BSA) y albúmina de huevo. La mezcla de reacción que contiene
200 l l de enzima y 200 l l de sustrato (1 mg / ml) se incubó a 60 C durante 20
min y la actividad se estimó usando el ensayo estándar.
Efecto de disolventes polares y no polares sobre la actividad de la proteasa
El efecto de los disolventes sobre la actividad de la enzima se estudió
mediante la incubación de la enzima con (10 l enzima l? 190 l l 500 mM de
tampón Tris-HCl y 1% (w / v) DMC como sustrato) los disolventes polares y no
polares (10% v / v), tales como, acetona, benceno, cloroformo, hexano y
tolueno durante 24 horas a 60 C y que ensayó la actividad residual de la
enzima. Se realizaron los controles junto con las pruebas.
Efecto de tensioactivos y diferentes agentes oxidantes en la estabilidad de
la proteasa
Efecto de Tween 20 al 0,5%, 1%, SDS al 0,5%, 1% y H 2 O 2 en el 0,5% y el 1%
fueron estudiados sobre la actividad de la proteasa mediante la incubación de
las mezclas (10 l enzima l? 190 l l mM de tampón Tris-HCl 500 y 1% (w / v) DMC
como sustrato) durante 1 h a 60 C. Más tarde se midieron las actividades
residuales; los controles se utilizaron en estudios sin tensioactivos y agente
oxidante.
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análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado cada vez. El significado ± desviación
estándar (SD) y de correlación de rangos coeficiente de Spearman se empleó en los
datos para la producción de proteasa, la actividad de proteasa y la estabilidad a
diferentes temperaturas y concentraciones de pH se ensayaron para determinar su
significación utilizando Microsoft Excel.
Aplicación de proteasa purificada en la eliminación de manchas de sangre
Aplicación de la proteasa purificada como un aditivo de detergente en la eliminación de
manchas de sangre se estudió en piezas de tela de algodón blanco (10 cm 9 10 cm)
manchadas con sangre y secado al horno a 95-100 C durante 5 min. Las piezas de tela
manchadas fueron tomadas en bandejas separadas. Los siguientes conjuntos se
prepararon y se estudiaron:
(A) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado de sangre
tela? 1 ml de detergente comercial (Surf Excel5 mg / ml)? 2 ml de
enzima purificado. (B) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado
de sangre
tela? 1 ml de detergente comercial (Surf Excel5 mg / ml).
(C) el pedazo de tela no tratada manchado de sangre era conside-
Ered como control.
(D) la bandeja con agua destilada (100 ml)? manchado de sangre
tela? 2 ml de enzima purificado. (E) la bandeja con agua destilada (100
ml)? manchado de sangre
paño.
Las bandejas se incubaron a 50 C durante 30 min. Las piezas de tela fueron
sacados de cada conjunto a intervalos regulares de 5 min, se enjuagó con agua, se
secaron y se examinaron visualmente.
Resultados y discusión
La optimización de las condiciones de cultivo y medios de comunicación para
la producción de proteasa: de un factor-a la vez
El organismo fue capaz de producir la proteasa a un intervalo de pH de 7,0 a 10,0
(producción óptima a pH 9,0) y en un rango de temperatura de 30-60 C
(producción óptima a 37 DO). Entre las fuentes de carbono ensayadas, fructosa
mostró más capacidad de producción, seguido de sacarosa. Entre las diferentes
fuentes de nitrógeno orgánico, leche descremada dio un rendimiento máximo de
la proteasa seguida de extracto de malta, peptona y extracto de levadura. El
cloruro de amonio como fuente de nitrógeno inorgánico se encontró que inhibe la
producción. MgCl 2 y CaCl 2
de producción, mientras que, otras sales de metales de proteasas inducidas como ZnCl 2, FeCl NCIM 2713 reportado por Mane y Bapat, tenía una actividad óptima a pH 8
2y CuCl 2 tuvo un efecto mínimo. Aumento de la producción mejorada de la proteasa
tiempo de incubación hasta 48 h.
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Pero, no se observó disminución gradual de la producción de enzimas con la
prolongación del tiempo de fermentación (tabla 1 ). Los parámetros
optimizados se utilizaron para la producción de la enzima en el medio con
fructosa como fuente de carbono y la leche descremada en polvo como
fuente de nitrógeno, con MgCl 2 y CaCl 2 aditivos adicionales. El pH final del
medio se ajustó a 9,0 y el organismo se hizo crecer a 37 C durante 48 h.
La purificación y la espectroscopia de péptido masa de
proteasa alcalina
Después de la producción de la enzima, se precipitó de manera óptima usando
sulfato de amonio a nivel de saturación de 60%. La saturación de sulfato de
amonio aumentó la puri proteína fi cación 1,65 veces con recuperación de 60%;
más adelante enzima se purificó por el método de diálisis. La muestra dializada
fue más purificó por cromatografía en columna de celulosa DEAE. La
purificación de la proteína usando la cromatografía de columna de celulosa
DEAE incrementó la pureza de la proteína por 20,74 veces en comparación
con precipitación con sulfato de amonio y diálisis (Tabla 2 ). la actividad de c
especificidad de puri proteína fi ed fue 89,2 U / mg. pureza de la enzima fue
confirmada por SDS-PAGE con la ayuda de Ejecución marcador de proteína
estándar contra la muestra de ensayo. Se encontró que el peso molecular de la
proteína a ser 66 kDa (Fig. 1 ). Una proteasa 34 kDa serina de B. pumilus CBS, y
un 35 kDa manganesedependent serina proteasa alcalina de B. pumilus TMS55
se ha informado anteriormente (Jaouadi et al. 2008 ; Ibrahim et al. 2011 ). Por
otra parte, también se informó de un 38 kDa disolvente orgánico y detergente
proteasa estable a partir de Bacilo
sp. RKY3 (Reddy et al. 2008 ). El peso molecular de la enzima aislada
estaba en el intervalo de algunos reportado Bacilo
proteasas.
La toma de huellas digitales péptido masa fi (PMF) de la proteína después de
la digestión con tripsina produjo ocho prominente m / z picos (Fig. 2 ). los m / z valores
correspondientes a 1958,2,
1324,6 y 1308,9 Se identificaron como péptidos con secuencias
LEAAPVMFPERPAYPDR, GVAPDAEIYAYR y LIGETIADFSSR,
respectivamente. Estos péptidos fueron similares a peptidasa S8 y S53
subtilisina de Bacillus cellulosilyticus.
Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la proteasa alcalina y la
estabilidad
La actividad enzimática exhibido en la amplia gama de pH de 6 a 10 con la
actividad máxima a pH 8 ( PAG segundo 0.1), que apoya que la enzima con
la naturaleza alcalina. Algunos de los Bacilo proteasas derivadas viz. desde B.
subtilis
y era estable a pH 6,5-9 (Mane y Bapat 2001 ). La proteasa de B. subtilis VSG-4
reportado
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tabla 1 Efecto del periodo de fermentación, pH, temperatura, fuentes de carbono, fuentes de a 10 con la actividad máxima a pH 8 (Farhadian et al.
nitrógeno y cloruros metálicos sobre la producción de serina proteasa alcalina de Bacillus 2015 ). Del mismo modo, una bacteria halófilas aislado a partir de agua de mar
caseinilyticus
reacciones catalizadas en el intervalo de pH 8-11 y se realizó de forma óptima a
período de fermentación (h) La concentración de proteína (mg / pH 10 (Raval et al. 2014 ). Enzima aislada en este estudio era más estable a pH 8
ml)
en presencia de CaCl 10 mM 2 ( Higo. 3 ).

26 39.30 ± 2.5
Efecto de diferentes temperaturas mostró que la enzima era activo en estas
48 42.67 ± 3.5
temperaturas variadas, sin embargo, se descubrió que la temperatura óptima
74 34.65 ± 4.0
para ser 60 C ( PAG segundo 0.1) que soporta la naturaleza termotolerantes de
98 28.76 ± 2.8
la enzima. La máxima actividad proteolítica de Bacilo cepas de HR-08 y
120 24.35 ± 2.1
KR-8102 aislado del suelo de la parte oeste y norte de Irán se han registrado a
pH 6
los 65 y 50 C, respectivamente (Moradian et al.
0

7 29.30 ± 3.5
2006 ). Una proteasa de serina por B. subtilis DR8806 mostró la actividad
8 33.67 ± 2.5
más alta en 45 C y resistió a la temperatura hasta 70 C (Farhadian et al. 2015
9 49.76 ± 1.5
). Cha et al. ( 2005 ) Informó que la proteasa de Bacilo sp. SS103 era activo
10 28.16 ± 2.6
en 37 C y la proteasa alcalina de B. subtilis VSG-4 que previamente
10.5 0
reportados por Giri et al. ( 2011 ) Era activo en un rango de temperatura de
12 0
40 a 60 C con una temperatura óptima a 50 C. Además, Huang et al.
Temperatura ( C) 20
purifica una proteasa alcalina que tenía una actividad máxima a 55 C
0
(Huang et al. 2003 ).
30 39.10 ± 2.5

37 49.99 ± 3.5

40 39.76 ± 1.5
En el presente estudio, la actividad enzimática aumenta gradualmente desde
50 28.16 ± 2.9
la temperatura de 30-60 C, pero, después de 60 C, mostró disminución de la
60 20.22 ± 1.8
actividad. Sin embargo, la presencia de CaCl 10 mM 2 disminución de la actividad
70 0
que en cierta medida. Enzyme retenido actividades enzimáticas residuales
Las fuentes de carbono
alrededor de 98% a 60 C en presencia de CaCl 10 mM 2 ( PAG segundo 0.1) (Fig. 4
glucosa 33.55 ± 1.9 ). El sitio de titulación activo de la enzima con PNPGB determinó la
sacarosa 42.66 ± 1.8 concentración de la enzima para ser 15,0 l m (basado en OD mide), con 40%
Lactosa 39.16 ± 1.8 sitios activos.
Fructosa 48.16 ± 1.9

Maltosa 21.92 ± 1.7

Las fuentes de nitrógeno cloruro Efecto de los inhibidores y los iones metálicos sobre la actividad enzimática

de amonio 0

Extracto de malta 43.99 ± 1.9

Extracto de levadura 31.19 ± 1.2 La proteasa alcalina probado era casi sin perturbaciones en presencia de
peptona 39.19 ± 1.0 EDTA que muestra un aumento de la actividad relativa de 96%, y menos
Leche desnatada 47.92 ± 2.1 actividad (30%) en presencia de Na 2 ?.
Cloruros de metales Los resultados (Tabla 3 ) También mostró que la enzima se inhibió

CaCl 2 42.35 ± 2.1 completamente por el inhibidor de serina proteasa (PMSF) en ambos 5 y 10

MgCl 2 42.55 ± 3.9 concentraciones mM, lo que sugiere su naturaleza serina (Adinarayana et al. 2003

ZnCl 2 39.77 ± 2.8 ). Entre los iones metálicos controladas sobre la actividad enzimática, Ca 2? y Mg 2? iones

FeCl 2 38.68 ± 2.9 aumento de la actividad relativa de hasta 82 y 85%, respectivamente. Una

CuCl 2 31.29 ± 1.8 proteasa de serina de Bacillus subtilis DR8806 fue estimulada por K ?, Ca 2 ?, mg 2? y

Control (único medio basal) 12.45 ± 3.7
Todos los resultados se presentan como media ± SD 3 Biotech
por Giri et al. ( 2011 ) Tenía la actividad máxima a pH 9 con una fuerte
disminución de la actividad en valores de pH inferiores a pH
9. Un extracelular hrtA-como serina proteasa por B. subtilis
DR8806 exhibió una alta actividad en el intervalo de pH de 5
Fe 2? a una concentración de 10 mM hasta 134, 129, 128 y 112%,
respectivamente. Considerando que, Na? iones no tuvieron ningún efecto
significativo sobre la actividad enzimática (Farhadian et al. 2015 ). actividad de
metal y la disminución en la presencia de Co 2 ?, Ni 2? fue observado por Farhadian
et al. ( 2015 ), Shah et al. ( 2010 ), Priya et al. ( 2014 ), Ibrahim et al. ( 2011 ) Y Jain et
al. ( 2012 ). Por el contrario, nuestros resultados

123
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Tabla 2 Resumen de la purificación de proteasa de serina alcalina producida por Bacillus caseinilyticus

método fi cación Puri La actividad total (U) La proteína total la actividad de c Puri pliegue fi Rendimiento

(mg / ml) especificaciones (U / mg) cación (%)

de enzima en bruto 5.93 1.38 4.3 1.00 100

precipitación con sulfato Ammomium 8.52 1.20 7.1 1.65 48

Diálisis 9.60 1.00 9.6 2.23 35

cromatografía en columna de celulosa DEAE 11,59 0.13 89.2 20,74 18

Efecto de disolventes polares y no polares sobre la actividad enzimática

El efecto de diferentes disolventes orgánicos en la estabilidad de manifiesto

que la actividad de la enzima no tuvo ningún efecto con hexano (99,7%),
mientras que, efecto moderado se encontró con acetona (90,9%), benceno
(95,8%), y tolueno (89,6%); mientras que, cloroformo bajó la actividad de la
proteasa alcalina (69,8%) (tabla 3 ). Del mismo modo proteasa alcalina
producida por la bacteria marina B. fi UDA CAS 7 era bastante estable en
presencia de tensioactivos aniónicos y no iónicos y disolventes orgánicos
(Neelamegam et al. 2014 ). Hexano, tolueno y butanol al 10% (v / v)
condujeron a disminuir la actividad y la presencia de DMSO en contraste
aumentar la proteasa de serina por B. subtilis DR8806. En contraste, el
etanol y el metanol a todas las concentraciones ensayadas mejorado
fuertemente la actividad de la enzima en comparación con el control
Figura 1 SDS PAGE de la proteasa purificada serina alcalina de Bacillus caseinilyticus (Farhadian et al. 2015 ). Jain et al. ( 2012 ) Mostraron la proteasa se activó
con disolventes, tales como, DMSO y hexano. Además, Rai y Mukheerje
demostraron subtilisina-como serina proteasa aislada de B. subtilis DM04
aumentó su actividad con hexano, metanol y etanol (Rai y Mukherjee 2010 ).
mostró una actividad moderada en Zn presencia 2 ?, Co 2? y Ni 2? iones. La enzima Una proteasa de B. pumilus 115b se ha inactivado por tolueno y benceno
de este estudio mostraron una menor actividad en la presencia de Fe 2? y Cu 2? iones.
(Rahman et al.

Efecto de diferentes sustratos en la actividad enzimática

Varios sustratos se ensayaron para estudiar la actividad de la proteasa
alcalina. Entre caseína, albúmina de suero bovino, gelatina y albúmina de
huevo, proteasa mostró alta actividad (94%) en caseína (Tabla 3 ). Sin
embargo, la enzima podría hidrolizar varias otras proteínas como BSA,
gelatina y albúmina de huevo, que es una característica importante de esta
proteasa alcalina. Adinarayana et al. ( 2003 ) Informaron hallazgo similar que
la caseína era un buen sustrato para la proteasa producida por B. subtilis. Nuestroblanqueadores, agentes oxidantes y otros aditivos que pueden estar presentes
resultado estaba en consonancia con hallazgo de Dubey et al. ( 2006 ) Que
mostró caseína era el sustrato más preferible. Se habían demostrado la
actividad en presencia de gluten de trigo fue sólo el 20%, en comparación
con la caseína. Además, proteasas producidas por B. halodurans 373 cas6
(Annamalai et al. 2013 ), B. cereus
TKU006 (Wang et al. 2009 ) y B. subtilis DR8806 (Farhadian et al. 2015 )
Mostraron la mayoría de la actividad hacia la caseína como sustrato.
2007 ).
Efecto de diferentes tensioactivos y el agente oxidante en la actividad
de la proteasa alcalina
Un buen proteasa detergente debe ser compatible y estable con todos los
compuestos detergentes comúnmente utilizados, tales como, tensioactivos,
en la formulación (Gupta et al. 2005 ). Por lo tanto diferentes tensioactivos y
agente oxidante en diferentes concentraciones se ensayaron para determinar
su efecto sobre la actividad de la proteasa alcalina. Entre el probado (Tween
20, SDS y H 2 O 2), H 2 O 2 estaba mostrando muy menos efecto sobre la actividad
de la proteasa alcalina que muestra una actividad relativa de hasta el 91 y el
86% después del tratamiento con 0,5 y 1% H 2 O 2, respectivamente (Tabla 4 ).
En un informe similar, Joo et al. ( 2003 ) reportó que Bacillus clausii 1-52
proteasa exhibido actividad relativa de hasta

123
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Figura 2 Los espectros de PFM de serina proteasa alcalina de Bacillus caseinilyticus
Fig. 3 Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de la proteasa de serina alcalina de Bacillus
caseinilyticus
114% después del tratamiento con 1% de H 2 O 2. La proteasa producida a
partir de Bacillus alcalophilus TCCC11004 estaba exhibiendo actividad
69,2% en presencia de 1% de H 2 O 2
(Cheng et al. 2010 ). Nuestros resultados mostraron que SDS podría haber
mejorado la interacción de la enzima con el sustrato y esto podría resultar
en una mayor actividad relativa de Tween 20. Cheng et al. ( 2010 ) Informó
de que la proteasa producida a partir de Bacillus alcalophilus TCCC11004
fue estable en 0,5% SDS y retuvo 70,3% de su actividad inicial después de
1 h de incubación.
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Fig. 4 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de la proteasa alcalina de Bacillus
caseinilyticus
Aplicación de proteasa purificada en la eliminación de manchas de sangre
En el experimento de eliminación de manchas de sangre, manchas de sangre se
retiraron completamente dentro de 30 min en el conjunto A [combinación de detergente
(5 mg / ml) y la enzima purificada (2 ml)], mientras que, las manchas de sangre fueron
no eliminan por completo cuando solamente la enzima era usado (conjunto D) (Fig. 5 ).
Banerjee et al. ( 1999 ) Informó de que la proteasa alcalina termoestable de
Bacillus brevis manchas de sangre elimina con combinación de
123
53 Página 8 de 10 3 Biotech (2016) 6:53

Tabla 3 Efecto de los inhibidores, iones metálicos (5 mM), sustratos (1 mg /

ml) y los disolventes orgánicos (10%) sobre la actividad de la proteasa alcalina producida por Bacillus
caseinilyticus

Inhibidor / activador Actividad relativa%

PMSF 0

EDTA 96 ± 3.9

CuCl 2 44 ± 4.1

ZnCl 2 78 ± 2.1

MgCl 2 85 ± 4.0

NaCl 30 ± 2.7

CaCl 2 82 ± 3.6

FeCl 2 54 ± 3.9

CoCl 2 62 ± 2.1

NiCl 2 58 ± 4.2

Caseína 94 ± 2.5
Fig. 5 Aplicación de la proteasa purificada de Bacillus caseinilyticus en la eliminación de manchas
Albúmina de suero bovino 40 ± 4.1
de sangre. UNA Cloth lavó con proteasa (2 ml) más de surf sobresalir detergente (5 mg / ml), segundo
Gelatina 64 ± 3.7 paño lavó con olas sobresalir detergente (5 mg / ml) solo, do paño de control con mancha de

albúmina de huevo 85 ± 2.9 sangre re paño lavó con proteasa (2 ml) solo, mi tela se lavó con agua destilada estéril

hexano 99.7 ± 2.6

Acetona 90.93 ± 1.8

Benceno 95.8 ± 2.2

Conclusión
tolueno 89.6 ± 3.5

Cloroformo 69.8 ± 3.9

Todos los resultados se presentan como media ± Dakota del Sur
Tabla 4 Efecto de diferentes tensioactivos y el agente oxidante en la estabilidad de la
proteasa alcalina producida por Bacillus caseinilyticus
La enzima (proteasa alcalina serina) producido por Bacillus caseinilyticus era
purificó usando amonio método sulfato de precipitación (60%), diálisis y fi
nalmente con cromatografía en columna de celulosa DEAE. La proteína
purificada tiene un peso molecular de 66 kDa. PMSF inhibió completamente
la actividad de la proteasa alcalina que indica que como una proteasa de
serina. La enzima purificada mostró su actividad y estabilidad a altas

Los tensioactivos / agentes oxidantes Concentración (%) Actividad relativa% temperaturas y rango de pH. La enzima también mostró su variada
estabilidad en presencia de diferentes inhibidores, iones metálicos, agentes
Tween 20 0.5 66 ± 3.9
tensioactivos, agente oxidante, disolventes polares polares, no y tenía la
1.0 42 ± 2.1
capacidad de hidrolizar diferentes sustratos que indican la posibilidad de
SDS 0.5 81 ± 2.9
explotación comercial de la serina proteasa alcalina en el detergente para la
1.0 55 ± 3.5 ropa industria.
H2 O2 0.5 91 ± 4.0

1.0 86 ± 2.6

Todos los resultados se presentan como media ± Dakota del Sur

7 mg / ml de detergente? enzima (2 ml) durante 25 min y similar, en un otro
informe, manchas de sangre se retiraron completamente dentro de 15 min en
combinación de detergente (6 mg / ml) y la enzima purificada a partir de Virgibacillus
halodenitri fi latas RSK CAS1, mientras que, se tardó 20 minutos cuando sólo
se usó la enzima (Ramamoorthy et al. 2014 ). Por lo tanto, nuestros resultados
indican claramente que la adición de la enzima a un detergente comercial
mejoraría el rendimiento del detergente de forma significativa en el proceso de
eliminación de manchas de sangre y, posiblemente, podría ser utilizado en la
fabricación de la limpieza de detergente a la escala industrial.
Expresiones de gratitud MT y SVR gracias Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno
de la India, para proporcionar FTSYS subvenciones para proyectos (SB / FT / LS-320/2012 y SB /
FT / LS-115/2012, respectivamente).
Cumplimiento de las normas éticas
El conflicto de intereses Los autores declaran que no existe conflicto de intereses de la
publicación de este artículo.
Acceso abierto En este artículo se distribuye bajo los términos de la licencia Creative
Commons Atribución 4.0 Licencia Internacional ( http: //
creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), Que permite el uso ilimitado, distribución y
reproducción en cualquier medio, siempre que se dé crédito apropiado al autor (s)
original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si
se han realizado cambios.

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