Actividad y evaluación antitrypanosomal del mecanismo de acción de dehidrodieugenol

aislado de Nectandra leucantha (Lauraceae) y su derivado metilado contra Trypanosoma

cruzi

abstracto
Antecedentes: a partir de una selección previa de la biodiversidad brasileña para la
actividad antiprotozoaria, el extracto de hexano de las hojas de Nectandra leucantha
(Nees & Mart.) (Lauraceae) demostró actividad contra Trypanosoma cruzi. La separación
cromatográfica de este extracto proporcionó dehydrodieugenol bioactivo (1). Además, se
preparó el derivado metilado 2 (dehidrodieugenol dimetil éter) y también se probó frente a
T. cruzi.
Objetivo: examinar el potencial terapéutico de los compuestos 1 y 2 contra T. cruzi, así
como para elucidar el mecanismo de acción del compuesto bioactivo 1 contra T. cruzi.
Métodos / Diseño del estudio: El extracto de hexano crudo de las hojas se sometió a
etapas cromatográficas para proporcionar el compuesto bioactivo 1. Para analizar el
efecto del grupo metilo adicional en la actividad antiparasitaria de 1, se preparó el
derivado 2 (ninguno es compuesto de interferencia de ensayo en pan - PAINS). Estos
compuestos se evaluaron in vitro frente a T. cruzi (formas de tripomastigote y amastigote)
y se analizaron para determinar el efecto potencial en las células hospedadoras mediante
la producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno. Finalmente, se investigó el
efecto de la membrana plasmática del compuesto 1 más potente en tripomastigotes de T.
cruzi.
Resultados: Compuestos 1 y 2 mostraron actividad contra amastigotes de T. cruzi.
Aunque ambos compuestos estimularon la actividad contra amastigotes intracelulares, la
producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno de las células huésped no se
alteraron, sugiriendo una actividad antiparasitaria distinta de la activación de la célula
huésped. Considerando 1 el compuesto más efectivo contra T. cruzi, se investigó la
interferencia en la membrana plasmática de los tripomastigotes utilizando la sonda
fluorescente SYTOX® Green. Después de una incubación a corto plazo, la fluidez y la
integridad de la membrana plasmática se alteraron por completo, lo que sugiere que es un
objetivo principal para el compuesto 1 en T. cruzi.
Conclusión: los compuestos 1 y 2 eliminaron selectivamente los parásitos intracelulares
sin la activación de la célula huésped y podrían ser andamios importantes para la
búsqueda de nuevos compuestos exitosos.

Introducción
Las enfermedades parasitarias son responsables de una considerable morbilidad y
mortalidad en todo el mundo, especialmente en los países subdesarrollados y en
desarrollo. Entre ellos, la enfermedad de Chagas, producida por Trypanosoma cruzi, se
produce en todos los países de América Latina y está estrechamente relacionada con el
bajo desarrollo social y económico. El tratamiento clínico de esta enfermedad implica el
uso de compuestos tóxicos, como benznidazol. Basado en este escenario, los productos
naturales aislados de las plantas podrían ser fuentes importantes de nuevos prototipos
para el desarrollo de nuevas drogas contra el protozoo tropical causante de
enfermedades.
Estudios previos de nuestro grupo demostraron que neolignans aislado del extracto de
hexano de ramitas de Nectandra leucantha (Lauraceae) mostró actividad antileishmanial
contra los parásitos Leishmania donovani
Como una continuación de nuestros estudios previos, en el presente trabajo,
dehidrodieugenol (1) se aisló del extracto de hexano de hojas de N. leucantha por primera
vez. Como se informó anteriormente, se observó una mejora del potencial antiparasitario
cuando se introdujo un grupo metilo adicional en la estructura de compuestos
relacionados, como el ehidrodieugenol B.
Con base en estos resultados, se preparó un derivado metilado 2 (dehidrodieugenol
dimetil éter) y antitripanosomal in vitro
La actividad de ambos compuestos se evaluó contra formas extracelulares e
intracelulares de T. cruzi. Además, los compuestos 1 y 2 se analizaron para el efecto
potencial en células huésped a través de la producción de óxido nítrico y especies
reactivas de oxígeno. Finalmente, se investigó el efecto de la membrana plasmática del
compuesto 1 más potente (dehidrodieugenol) en tripomastigotes de T. cruzi.

materiales y métodos

Productos químicos y reactivos Sephadex LH-20 y Silicagel 60 F 254 se usaron para CC y

separaciones analíticas de TLC, respectivamente. Para toda extracción se usaron
procedimientos de cromatografía, solventes de grado analítico. Los medios MTT,
resazurina, SDS (sulfato de sodio), benznidazol (2-nitroimidazol), miltefosina, RPMI-PR-
1640 y M-199. SYTOX® Green y H 2 DCf-DA. Los espectros de 1H y 13C RMN se
registraron en un espectrómetro Bruker Daltonics Ultrashield 300 Avance III A 300 y 75
MHz, respectivamente, usando CDCl3 como disolvente y TMS como patrón interno. Los
espectrómetros MicroTOF QII Bruker Daltonics y GCMS-QP2010 Plus Shimadzu se
usaron para registrar los espectros de masas. Las separaciones de HPCCC se realizaron
en el instrumento Spectrum HPCCC, equipado con dos bobinas con una columna
semipreparativa, hecha de un tubo de politetrafluoroetileno, bomba HPLC, detector UV
Knauer K-1800 y un colector de fracciones con bastidores tipo Superfrac B. Discos de
filtro de fibra de vidrio Chromafil Xtra GF-100/25, tamaño de poro 1,0 μm.

Material vegetal
Las hojas de N. leucantha se recolectaron en el área de Mata Atlántica de la ciudad de
Cubatão, estado de São Paulo, Brasil en marzo de 2014. El material de la planta fue
identificado por el Prof. MSc. Euder G. A. Martins. Se ha depositado un espécimen de
comprobante (EM357) en el Herbario del Instituto de Biociencias, Universidad de São
Paulo, SP, Brasil. Extracción y aislamiento de constituyentes químicos Las hojas de N.
leucantha (2,54 kg) se secaron, se pulverizaron y fue extraído en un sistema
automatizado ASE 350 usando hexano como disolvente en temperatura ambiente.
Después de la evaporación del disolvente a presión reducida, se obtuvieron 55 g de
extracto de hexano en bruto. Este material se disolvió en n-hexano (200 ml) y se repartió
usando ACN (4 x 200 ml). Después de la evaporación del solvente, se obtuvo la fase de
ACN
(34.1 g) mostró actividad antitripanosomal y fue sometido a separación utilizando HPCCC
semipreparativa. A este enfoque, parte de la fase de ACN bioactiva seca (500 mg) se
disolvió en 2,5 ml de hexano: EtOAc: MeOH: H 2 O para inyección. Se determinó que la
cromatografía estacionaria era la capa de disolvente orgánico menos densa que indicaba
una separación del modo de cabeza a cola. La velocidad de rotación se ajustó a 1600
rpm, y la longitud de onda de detección fue λ = 210 nm. Para la elución de compuestos, la
fase se bombeó a un caudal de 5,0 ml / min, mientras que para la extrusión de
metabolitos residuales, la fase estacionaria se bombeó con un caudal de 10,0 ml / min.
Este procedimiento produjo 75 fracciones que se agruparon en cuatro grupos después del
análisis de TLC. Fracción D (22.5 mg) actividad antitrypanosomal
se sometió a fraccionamiento CC con Sephadex LH-20 para proporcionar 1 (5,1 mg - 99%
de pureza por HPLC). Parte del compuesto 1 (3,0 mg, 9 \ mu mol) se metiló para
proporcionar el compuesto 2 (3,2 mg, 9 \ mu mol, rendimiento 100%) con 99% de pureza.

Animales
Los ratones BALB / c y los hámsters Golden fueron suministrados por la instalación de
cría de animales del Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, y mantenidos en jaulas esterilizadas
bajo un ambiente controlado, recibiendo agua y alimento a voluntad. Procedimientos
animales fueron realizados con la aprobación de la Comisión de Ética en Investigación, de
acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Academia
Nacional de Ciencias

Parásitos y células de mamíferos

Trypomastigotes T. cruzi (cepa Y) se mantuvieron en LLCMK2 (ATCC CCL 7) células que
usan medio RPMI-1640 suplementado con 2% de suero de ternero a 37 ° C. Los
amastigotes se recogieron del bazo de hamsters infectados mediante centrifugación
diferencial. Los macrófagos peritoneales se recogieron de la cavidad peritoneal de ratones
hembra BALB / c lavando con RPMI-1640 sin rojo de fenol, complementado con suero
bovino fetal al 10%. Las células LLC-MK2 y NCTC se mantuvieron en medio RPMI-1640
sin rojo de fenol y se suplementaron con 10% de proteína fetal. suero bovino a 37 ° C en
una incubadora humidificada con CO 2 al 5%

Actividad antitrypanosomal
Los compuestos 1 y 2 se probaron contra tripomastigotes de T. cruzi durante 24 h y la
viabilidad se determinó mediante el colorante de rezasurina. Los compuestos 1 y 2 se
disolvieron en DMSO puro y se diluyeron en medio RPMI-1640 para determinar los
valores de CI50. Los tripomastigotes libres obtenidos de cultivos LLCMK2 se contaron en
un hemocitómetro Neubauer y sembrado a 1 × 10 6 microplacas. Compuestos 1 y 2
fueron incubados durante 24 h a 37 ° C en una incubadora humidificada al 5% de CO 2.
Compuestos 1, 2 y benznidazol (fármaco estándar) se diluyeron en serie (2 veces),
utilizando duplicados, con concentraciones que varían de 100 a 0,78 μM. La viabilidad de
los trypomastigotes fue verificada mediante colorante de resazurin (Alamar Blue®)
utilizando un lector de microplacas multimodo FilterMax F5, Molecular Devices, lector de
microplacas fluorimétricas a 570 nm. El efecto sobre T. cruzi amastigotes intracelular se
realizó en macrófagos previamente infectados con tripomastigotes derivados de cultivos
celulares. Las tripomastigotas derivadas de cultivo celular se añadieron a los macrófagos
a una relación 5: 1 (parásitos / macrófagos) y se incubaron durante 4 h. Compuestos 1 y 2
se incubaron con parásitos durante 48 h a 37 ° C en una incubadora 5% de CO 2
humidificado. Al final del ensayo, los cubreobjetos de vidrio se fijaron con MeOH, se
tiñeron con Giemsa y se observaron en un microscopio óptico.
La carga del parásito se definió como el número medio de macrófagos infectados de 500
células. Para evitar la toxicidad de las células y los parásitos, una concentración final de
0,5% de DMSO (v / v) por pocillo, incluidos los pozos de control.
Citotoxicidad contra células de mamíferos
Para determinar los valores CC50, las células NCTC se sembraron a 6x104 células por
pocillo en microplacas de 96 pocillos, se incubaron los compuestos ensayados en una
concentración de rango de 200 μM a 1,6 μM, usando benznidazol como fármaco
estándar. Todos los compuestos probados fueron diluidos en serie (2 veces), utilizando
duplicados durante 48 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Los valores de SI
se determinaron usando la siguiente relación: CC50 contra células de mamífero / CI50
contra parásitos. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo MTT como se
describió anteriormente

Evaluación de la permeabilidad de la membrana plasmática

Trypomastigotes de T. cruzi se lavaron en PBS, se sembraron a 2 × 10 6 / pocillo y se
incubaron con 1 μM de SYTOX® Green durante 15 min a 24 ° C. El compuesto 1 se
añadió a su valor de CI _ {99} respectivo y se midieron cinco unidades de fluorescencia
arbitrarias cada 20 minutos durante un total de 80 minutos. La permeabilización máxima
se obtuvo con 0,1% de Triton X-100. La intensidad de fluorescencia se determinó
utilizando el lector de microplacas multimodo FilterMax F5, Dispositivos molecular, lector
de microplacas fluorimétricas con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y
520 nm, respectivamente. Los siguientes controles internos se usaron en la evaluación: i)
la fluorescencia de fondo del compuesto 1 en las respectivas longitudes de onda, ii) la
posible interferencia de DMSO, iii) tripomastigotes no tratados, y iv) medio sin células. Las
muestras se analizaron por triplicado.

Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Trypomastigotes: los tripomastigotes de T. cruzi se lavaron con HBSS y se incubaron con
el compuesto 1 en el valor IC 99 durante 60 y 120 min. Se usó azida sódica (10 mM)
como control positivo. Para este ensayo se usaron los mismos controles internos de la
evaluación de la permeabilidad de la membrana plasmática.

Macrófagos: la detección de ROS también se realizó en macrófagos peritoneal de ratones

BALB / c después de la estimulación con los compuestos 1 y 2. Las células se lavaron con
medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de ternero, se sembraron 2x105 /
pocillo durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO2. Posteriormente, se añadió el
compuesto 1 a una concentración no tóxica (valor IC 50 contra amastigotes intracelulares,
15 μM) y el compuesto 2 a 100 μM, con ambos compuestos durante un período de 2 h. Se
usaron los siguientes controles internos en la evaluación: (i) la fluorescencia de fondo de
los compuestos en las respectivas longitudes de onda, (ii) medio sin células, (iii)
macrófagos sin tratamiento (control negativo), (iv) se usó LPS como control positivo (20
μM). Las muestras se probaron por duplicado.
Para ambos ensayos (T. cruzi y macrófagos), se añadió la sonda fluorescente H 2 DCf-DA
(5 μM), y las células se incubaron durante 15 min. La intensidad de fluorescencia se
detectó utilizando un lector de microplacas fluorimétricas con longitudes de onda de
excitación y emisión de 485 y 520 nm, respectivamente.

Producción de macrófagos con óxido nítrico

Los macrófagos peritoneales de ratones BALB / c (2 x 106 / pocillo) se lavaron con medio
RPMI-1640 suplementado con 10% de FSB sembrado por 24 ha 37ºC con 5% de CO2.
Las células se incubaron con los compuestos 1 y 2 en sus respectivos valores de IC50 e
IC 99 durante 24 h (concentraciones no tóxicas). Como control positivo, se usó LPS a 20
μM. Los macrófagos sin tratamiento se usaron como control negativo. El contenido de
nitrito en los sobrenadantes de cultivo de macrófagos tratados durante 24 horas se
analizó mediante el ensayo de Griess. Los resultados obtenidos se extrapolaron a partir
de una curva estándar preparada con NaNO2 a diferentes concentraciones (0 a 400 μM).
Las muestras se probaron por duplicado.

análisis estadístico
Los datos obtenidos representan la media y la desviación estándar de las muestras
duplicadas de dos ensayos independientes. Los valores de IC50 o CC50 se calcularon
usando curvas de dosis-respuesta sigmoideas en el software GraphPad Prism 5.0, y los
intervalos de confianza del 95% se incluyen entre paréntesis. La prueba ANOVA se usó
para el valor p de significación.
Cálculo de propiedades ADMET in silico y análisis de compuestos de interferencia pan-
ensayo (PAINS) Se calcularon algunas propiedades ADMET para los compuestos 1 y 2
utilizando cuatro servicios web diferentes. El servidor AdmetSAR se usó para predecir
carcinogenicidad, mutagenicidad AMES, penetración de la barrera hematoencefálica,
absorción intestinal humana, inhibición de las cinco isoformas más importantes del
citocromo P450, así como su promiscuidad de inhibición y permeabilidad de las células
Caco-2. El servidor ACD / I-Lab se usó para predecir genotoxicidad, unión a proteínas
plasmáticas y volumen de distribución. El potencial para la inhibición de hERG se predijo
utilizando el servidor Pred-hERG y la toxicidad oral de roedores mediante el uso del
servidor PROTOX. El análisis de los compuestos de interferencia pan-ensayo - PAINS se
realizó utilizando el servidor False Positive Remover.

Resultados y discusión

Caracterización química
Se compararon los espectros 1H y 13C NMR así como los datos MS de los compuestos 1
y 2 con los reportados en la literatura, permitiendo la identificación de dehidrodieugenol y
dehidrodieugenol dimetil éter (Fig. 1), respectivamente, en 99 % de pureza según lo
indicado por HPLC.

Actividad antitrypanosomal
Los Compuestos 1 y 2 demostraron un efecto tripanocida contra tripomastigotes en la
concentración más alta probada de 100 μM y exhibieron valores IC50 de 11.5 μM (9.3 a
14.2 μM) y 55.6 μM (40.6 a 79.0 μM), respectivamente (Tabla 1). El Compuesto 1 mostró
eficacia contra amastigotes de T. cruzi y demostró un valor de IC50 de 15.1 μM (13.3 a
17.1 μM). El compuesto 2 fue inactivo contra amastigotes a las concentraciones probadas.
Se usó benznidazol como fármaco estándar y dio como resultado valores IC50 de 16,4
μM frente a tripomastigotes y 5,5 μM frente a amastigotes intracelulares.
El compuesto 2 no mostró citotoxicidad (CC50> 200 μM) a las células NCTC, excepto el
dehidrodieugenol (1), que mostró un valor CC50 de 58.2 μM. El fármaco estándar,
benznidazol, mostró un valor de CC50> 200 μM (Tabla 1). Cuando se considera la
actividad antiparasitaria (amastigotes) y la citotoxicidad de los compuestos, fue posible
calcular el índice de selectividad (SI), que muestra valores de 3.9 a compuesto 1 y> 36 a
benznidazol. Esta es la primera descripción de la actividad antitrypanosomal de
dehydrodieugenol (1) en la literatura y los resultados obtenidos indican que este
compuesto mostró una selectividad frente a amastigotes intracelulares de T. cruzi.
Estudios recientes han informado de la actividad antiparasitaria de dehidrodieugenol (1)
contra formas de promastigotes de Leishmania amazonensis (valor IC 50 de 42.20 μg / ml
o 129.4 μM), lo que indica el potencial de este compuesto contra parásitos.
Como se describió, la metilación completa de 1 para proporcionar 2 resultó en una
disminución en la actividad antileishmanial observada (valor IC50 de 47,75 μg / ml o 134,8
μM). En el presente trabajo, un mismo efecto fue detectado desde el tratamiento de las
formas tripomastigotes de T. cruzi con el compuesto 1, que muestra el grupo hidroxilo
libre en el anillo aromático, ejerció el efecto antiparasitario y realzó la actividad l
antitrypanosomal contra los tripomastigotes.
Considerando la efectividad del compuesto 1 contra dos de etapas clínicamente
relevantes del T. cruzi, se investigaron los posibles mecanismos de muerte celular. Se ha
sugerido que la membrana plasmática de los parásitos protozoarios es un objetivo
potencial para los fármacos antiparasitarios. La permeabilidad de la membrana plasmática
de T. cruzi se observó con el colorante SYTOX® Green, un cromosoma y un cromosoma
fluorescente verde contra tinción que es impermeable a las células vivas y exhibe> 500
veces mayor potenciación de la fluorescencia después de unirse a los ácidos nucleicos.

La exposición de tripomastigotes de T. cruzi

El compuesto 1 condujo a un aumento gradual en la afluencia verde SYTOX ®,
demostrando una alteración dependiente del tiempo en la permeabilidad de la membrana
plasmática (Fig. 2). Considerando el fluorescente unidades arbitrarias (AU), el compuesto
1 aumentó significativamente (p <0,05) la fluorescencia, facilitando una alta afluencia de
SYTOX® Green en T. cruzi en el momento inicial de la incubación, dando como resultado
niveles de fluorescencia cercanos al control positivo de Triton X-100 a los 80 min. Se usó
DMSO al 0,5% como control interno y no produjo ninguna alteración. Este resultado
sugiere que el compuesto 1 alteró la fluidez y la integridad de la membrana plasmática de
los parásitos de T. cruzi. Teniendo en cuenta las diferencias de la constitución de la
membrana plasmática entre estos parásitos protozoarios y las células de mamíferos, es
posible prever una especificidad de fármaco diferente a estas membranas.
Fenilpropanoides se ha demostrado que afectan la permeabilidad de la membrana
plasmática de las bacterias. Si la permeabilidad causada por el compuesto 1 resultara en
poros, la extravasación de iones, agua y glucosa a través de la bicapa lipídica podría
haber contribuido a la muerte del parásito. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales
para investigar el efecto del compuesto 1 en la membrana de T. cruzi.
Teniendo en cuenta que las drogas pueden inducir estrés oxidativo en parásitos
protozoarios, se evaluó la producción de ROS por tripomastigotes de T. cruzi en presencia
del compuesto 1 usando la sonda fluorescente H 2 DCf-DA. No se observaron cambios en
la producción de ROS hasta 120 minutos de incubación en comparación con los parásitos
no tratados. Azida sódica se usó como control positivo (ROS up-regulation) y se usó para
normalización. Dentro de las mitocondrias, el sitio primario de producción de ROS es la
cadena de transporte de electrones, que implica cuatro complejos asociados a proteínas
Aunque una gran cantidad de fármacos afecta a las mitocondrias, contribuye a una
regulación positiva de ROS, el objetivo principal del compuesto 1 en T. cruzi podría estar
relacionado con la membrana plasmática.
Las drogas pueden ejercer un efecto directo en los parásitos, pero la activación de las
células del huésped puede iniciar el estallido de oxígeno, lo que lleva a muestras de ROS
y NO dañinas, lo que contribuye a la eliminación de los parásitos intracelulares. Teniendo
en cuenta la eficacia de los compuestos 1 y 2 frente a las formas intracelulares de los
parásitos estudiados, la producción de ROS por los macrófagos se evaluó después de la
incubación en concentraciones no tóxicas.
Nuestros datos demostraron que la producción de ROS en macrófagos peritoneales se
suprimió cuando las células se incubaron con los compuestos 1 y 2 durante 120 h (figura
3). La activación de las células por LPS bacteriano dio como resultado un ROS de más
alta producción, que también fue regulada negativamente por los compuestos 1 y 2.
Además, los macrófagos incubados con los compuestos 1 y 2 no demostraron alteración
de la producción de NO en comparación con las células no tratadas (Fig. 4). Los
macrófagos tratados con LPS potenciaron los niveles de NO en comparación con las
células no tratadas. Además, el compuesto 2 fue capaz de suprimir la producción de NO
de macrófagos tratados con LPS. Estos resultados sugieren una acción directa de los
compuestos 1 y 2 en amastigotes intracelular de T. cruzi, sin la necesidad de activación
de la célula huésped.
La metilación del compuesto 1 que produce 2 provocó la supresión de NO en los
macrófagos activados. Se ha descrito que los productos naturales aislados de plantas
ejercen un efecto antiinflamatorio mediante la inhibición de iNOS, una enzima responsable
de regular al alza de niveles NO en las celdas. Aunque 1 y 2 suprimieron la producción
de ROS y 2 suprimió los niveles de NO de los macrófagos tratados con LPS, este efecto
no mostró interferencia con el efecto antiparasitario. Además, otros neolignanos naturales
de N. leucantha también han demostrado un efecto antileishmanial sin la activación de la
célula huésped (producción de NO)
Análisis in silico
Está bien establecido que las propiedades farmacocinéticas y de toxicidad deficientes
(ADMET) representan una de las principales razones de las fallas de fármacos
candidatos en los ensayos clínicos. Por lo tanto, es conveniente utilizar herramientas
computacionales para predecir las propiedades ADMET en las primeras etapas del
proceso de descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, los compuestos 1 y 2 eran
sometidos a un cálculo in silico de propiedades ADMET usando los servicios web
admetSAR, Pred-hERG, ACD / I-Lab y PROTOX. Los resultados detallados del análisis de
propiedades de ADMET se muestran en la Tabla 2. Estos compuestos fueron
pronosticados como no mutagénicos, no carcinogénicos, no genotóxicos, débiles
bloqueantes de hERG, con baja toxicidad oral de roedores (DL50 con rabia entre 1.9 y 2.2
g / kg), absorción intestinal humana moderada y permeabilidad de células Caco-2, y con
volúmenes aceptables de distribución (VD con furia entre 0.72 y 3.32 l / kg). De lo
contrario, ambos compuestos mostraron algunas propiedades desfavorables, como la
penetración de la barrera hematoencefálica, alta promiscuidad con las cinco isoformas
CYP principales (CYP1A2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6 y CYP3A4) y alta afinidad de
unión a proteínas plasmáticas (> 93%).

Los compuestos 1 y 2 también se sometieron a un análisis computacional adicional para

identificar las subestructuras presentes en los compuestos de interferencia panassay
(PAINS). Este análisis tiene un valor sustancial durante el cribado de los compuestos
porque la actividad aparente de los PAINS se debe generalmente a su reactividad en
lugar de unión no covalente, formación de agregados y por interacciones inespecíficas
con proteínas de tampón en un alto porcentaje de bioensayos. Ninguno de los
compuestos analizados contiene las subestructuras de PAINS, en consecuencia, hay una
baja probabilidad de que sus actividades biológicas sean artefactos causados por la
reactividad.

Conclusión
Dehydrodieugenol (1) se aisló por primera vez de N. leucantha, muestra una potente
actividad antitripanosomal contra ambas formas de parásitos, incluidos los amastigotes
intracelulares. Además, este compuesto causó una rápida alteración de la permeabilidad
de la membrana plasmática de T. cruzi, lo que provocó la muerte del parásito. Finalmente,
el compuesto 1 y el compuesto metilado 2 eliminaron los parásitos dentro de los
macrófagos a través de una vía ROS e independiente de NO.
Además, estos dos compuestos mostraron propiedades ADMET calculado favorable y no
contiene PAINS en sus estructuras. Juntos, estos resultados podrían ser útiles para
desarrollar compuestos más potentes contra los parásitos protozoarios.