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GUNTA GUTMANIS
PIRACICABA
Estado de São Paulo – Brasil
Novembro – 2003
CLONAGEM DO cDNA QUE CODIFICA
A ENZIMA UDP-GLICOSE PIROFOSFORILASE
DE BATATA (Solanum tuberosum L.)
GUNTA GUTMANIS
Bióloga
PIRACICABA
Estado de São Paulo – Brasil
Novembro – 2003
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Gutmanis, Gunta
Clonagem do cDNA que codifica a enzima UDP-glicose pirofosforilase de batata (Solanum
tuberosum L.) / Gunta Gutmanis. - - Piracicaba, 2003.
63 p. : il.
CDD 633.491
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
Em memória de meus amados pais Ansis e Erna
Gutmanis, pelo amor e carinho dedicados e pela
orientação que deram à minha vida,
DEDICO
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
Página
RESUMO................................................................................................................... x
SUMMARY................................................................................................................ xii
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 3
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 11
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 29
5 CONCLUSÕES.................................................................................................. 48
ANEXOS.................................................................................................................... 49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 58
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
mg Miligrama
MilliQ Água destilada deionizada e estéril por filtragrem a 0, 2 µm
ml Mililitro
mM Milimolar
MOPS Ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico
mRNA RNA mensageiro
NCBI National Center for Biotechnology Information
ng Nanograma (10-6 grama)
nm Nanômetro
Oligo (dT) Oligo desoxitimidina trifosfato (oligonucleotídeo poli- T)
ORF Seqüência aberta de leitura (open reading frame)
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
Pfam Protein family
pmoles Picomoles
primer Oligonucleotídio iniciador
p/v Peso por volume
PVP Polivinilpirrolidone
q.s.p. Quantidade suficiente para
RNA Ácido ribonucléico
RNase Ribonuclease
rpm Rotações por minuto
RT-PCR Síntese de cDNA por uma transcriptase reversa, seguida de PCR
SDS Dodecil sulfato de sódio
Taq DNA polimerase da bactéria Thermus aquaticus
Tm Melting temperature
Tris Tris-hidroximetil-aminometano
U Unidades de enzima
UDP Uridinedifosfato
UGPase UDP -glicose pirofosforilase
ix
RESUMO
tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos
com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de
dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de
transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial
foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi
confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases
revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência
do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos
conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao
substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise
de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de
eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na
avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e
no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto.
CLONING OF cDNA ENCODING POTATO (Solanum tuberosum L.)
UDP-GLUCOSE PYROPHOSPHORYLASE
SUMMARY
The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the
derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases
from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites,
Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in
substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot
analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt
(Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the
impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco
(Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.
1 INTRODUÇÃO
O objetivo do presente trabalho foi clonar o cDNA que codifica a enzima UDP-
glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9), que posteriormente será utilizado na
avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses
da parede celular e no desenvolvimento de plantas. Primeiramente, serão avaliadas
plantas de fumo (Nicotiana tabacum), usadas como sistema modelo para análises
preliminares, e em seguida, eucalipto (Eucalyptus grandis), visando melhorar as
propriedades da fibra e da polpa que afetam a produção e a qualidade do papel destinado
a diferentes usos como, por exemplo, impressão ou embalagens.
2 REVISÃO DE LITERATURA
está envolvida com o amadurecimento de frutos como a banana (Pua et al., 2000) e
tomate (Picton et al., 1993). Em mamíferos, a UDP-glicose é um importante
intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos em várias funções
metabólicas que dependem do tipo de tecido.
2002). Esses trabalhos mostram a existência de uma inter-relação dos vários substratos
envolvidos na síntese da celulose e hemiceluloses, de tal forma que os fluxos de carbono
para esses dois compostos é altamente regulado.
glucurônico (F igura 1). Essa reação é irreversível e o produto formado pode ser
diretamente transferido para a síntese da parede celular ou ser fosforilado pela enzima
glucoronoquinase (EC 2.7.1.43) e em seguida, desfosforilado pela enzima glucoronato 1-
fosfato uridiltransferase (EC 2.7.7.44) (Loewus et al., 1962; Loewus & Murthy, 2000).
Até o momento não é conhecida qual das rotas de síntese do UDP- glucoronato é a
mais importante nas plantas. Existem evidências de que as duas vias metabólicas
coexistem, variando a importância de cada uma durante o desenvolvimento da planta
(Roberts e Loewus, 1973; Dalessandro e Northcote 1977a, 1977b; Witt, 1992).
Parede Celular
Hemiceluloses
Parede Celular
UDP -Xilose
4.1.1.35
2.7.7.44 2.7.1.43
UDP-glucoronato Glucoronato 1-P Ácido
Glucorônico
2.4.1.17 3.2.1.31
1.1.1.22
1.13.99.1
UDP-Glicose
5.4.2.2
Parede Celular
Figura 1- Representação esquemática da formação das hemiceluloses, celulose e ácido glucorônico a partir
do açúcar glicose 6-P e da via de oxidação do mio-inositol. 5.5.1.4, mio -inositol-1-fosfato
sintase (MIPS); 3.1.3.25, mio-inositol monofosfatase (IMP); 1.13.99.1, mio-inositol oxigenase;
3.2.1.31, β-glucuronidase; 2.7.1.43, glucoronoquinase; 2.4.1.17, glucoronosil-transferase;
2.7.7.44, glucoronato 1-fosfato uridililtransferase; 5.4.2.2, fosfoglucomutase; 2.7.7.9, UDP-
glicose pirofosforilase; 1.1.1.22, UDP-glicose desidrogenase, 4.1.1.35, UDP-glucoronato
descarboxilase; 2.4.1.12, celulose sintase
8
NCBI
NCBI (National Center for Biotechnology Information) é um centro de informação
biotecnológica, criado pelo governo americano em 1988, que gera bancos de dados de
domínio público com acesso via Internet através da página eletrônica
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, desenvolve programas para a análise de dados, como
BLAST e ORF Finder, e mantém intercâmbio de dados com outros centros de pesquisa
internacionais através de atualizações diárias, o que faz com que esses bancos estejam em
constante crescimento.
Algumas das opções de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) utilizadas foram:
a. BlastN: confronta a seqüência de nucleotídeos a ser analisada contra as seqüências de
nucleotídeos disponíveis na base de dados do NCBI.
b. BlastX: confronta a seqüência de nucleotídeos a ser analisada contra as seqüências de
proteínas disponíveis na base de dados do NCBI.
12
KEGG
A Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto – KEGG (Kanehisha et al., 2002) –
através da página eletrônica http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html, apresenta um
sistema de busca com diversas alternativas. Permite a procura de vias metabólicas e
regulatórias a partir de nomes de vias, produtos ou códigos (número EC), ou ainda,
permite a comparação de uma seqüência ao seu banco de dados.
CLUSTAL W
A similaridade entre diferentes seqüências de aminoácidos e entre suas respectivas
seqüências de nucleotídeos, obtidas no NCBI ou KEGG, foi examinada através do
programa Clustal W (1.82). O programa Clustal W Multiple Sequence Alignments
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) produz alinhamento biologicamente significativo de
diversas seqüências de DNA ou de proteínas, calcula o melhor pareamento para as
seqüências escolhidas e as alinha de forma que as similaridades e diferenças possam ser
observadas (Thompson et al., 1994).
Para extração de RNA total utilizou-se o método de Salzman et al. (1999), a partir
de tubérculo de batata, conforme descrição abaixo.
A260 x Fc x Fd
[RNA] =
1000
A qualidade do RNA foi analisada com base na relação A260/ A280 , onde valores
maiores que 1,6 indicam boa qualidade do RNA extraído. A qualidade também foi
observada após desnaturação, através de eletroforese em gel de 1,5% agarose em tampão
TAE 1 X (Anexo D) (Sambrook et al., 1989).
uma vez com auxílio do Dynal MPC–S (concentrador magnético de partículas). Essa
lavagem é feita removendo-se o tubo do magneto, ressuspendendo os Oligo (dT)25 em
100 µl de tampão de ligação e recolocando o tubo no magneto. Depois de 30 segundos, o
sobrenadante é pipetado e o tubo, contendo os Oligo (dT) 25 limpos, removido do
magneto.
attL 1
561 TCGGGCCCCA AATAATGATT TTATTTTGAC TGATAGTGAC CTGTTCGTTG CAACAAATTG
Not I
621 ATGAGCAATG CTTTTTTATA ATGCCAACTT TGTACAAAAA AGCAGGCTCC GCGGCCGCCC
Asc I
681 CCTTCACCAA GGGTGGGCGC GCCGACCCAG CTTTCTTGTA CAAAGTTGGC ATTATAAGAA
attL 2
741 AGCATTGCTT ATCAATTTGT TGCAACGAAC AGGTCACTAT CAGTCAAAAT AAAATCATTA
O programa Pfam (Bateman et al., 2002) versão 10.0 contém modelos para 6.190
famílias de proteínas, baseados em seqüências de proteínas dos bancos de dados
Swissprot e SP-TrEMBL.
O retorno da consulta pode conter símbolos que indicam se o Score é bom quando
comparado a outros membros da família Pfam. O símbolo !! sinaliza um alinhamento
altamente significativo e, portanto, indica que a seqüência é membro da família de
proteínas (Pfam) citada. O valor E é uma medida mais quantitativa da significância
estatística, sendo que, quanto menor o valor E, maior a semelhança.
O DNA genômico total foi extraído de folhas de batata e de eucalipto por meio do
método CTAB (Doyle & Doyle, 1987). Discos de 100 mg de tecido foliar jovem foram
coletados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a –80ºC. As amostras depois
de pulverizadas em cadinho de porcelana (previamente esterilizado a 200ºC, por 8 horas),
com auxílio de nitrogênio líquido, foram transferidas para tubos eppendorf estéreis,
contendo 700 µl de tampão de extração com â- mercaptoetanol (Anexo R), previamente
aquecido (65ºC), agitadas em vórtex e deixadas 15-20 minutos a 55 -60ºC, com
homogeneização suave em intervalos de 5 minutos. As amostras foram deixadas à
temperatura ambiente por 5 minutos, e em seguida, adicionou-se 600 µl de CIA. As
amostras foram homogeneizadas invertendo-se os tubos 25 vezes e centrifugadas a
18.000 x g, a 4ºC, por 7 minutos.
O volume de 600 µ l da fase superior foi transferido para novo tubo (evitando-se
perturbar a interface), ao qual foram adicionados 200 µl de tampão de extração, porém
sem β-mercaptoetanol. Foram feitas duas extrações adicionais com 600 µl de CIA, como
descrito acima, para completa remoção da interface.
25
A fase superior foi novamente transferida para novo tubo, à qual foram
adicionados 600 µl de isopropanol para a precipitação do DNA. Após homogeneização
suave a amostra foi centrifugada a 18.000 x g, a 4ºC, por 15 minutos.
O precipitado foi lavado com 600 µl de etanol 70%, e mantido a -20ºC por 20
minutos, antes da centrifugação por 15 minutos, a 4ºC, a 18.000 x g. Após secagem, o
precipitado foi ressuspendido em 30 µl de tampão TE (Anexo S) acrescido de 10 µg de
RNase e mantido a 37ºC, por 1 hora.
Para a análise de Southern blot o DNA genômico total foi digerido com uma
enzima de restrição que não reconhece sítios internos à ORF da UGPase e outro que
reconhece. Com o auxílio do web site http://rebase.neb.com/rebase/rebtools.html– New
England Biolabs NEBcutter – opção “List 0 cutters” definiu-se quais as enzimas que
poderiam ser utilizadas.
O DNA foi desnaturado por uma série de lavagens do gel, em solução ácida (HCl
0,25 M) por 10 minutos para a depurinação, básica (NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M) por 30
minutos para a desnaturação, e duas lavagens de 15 minutos cada para a neutralização
(NaCl 1,5 M; Tris-HCl 0,5 M pH=7,2; EDTA 1 mM), todas intercaladas com enxágües
em água MilliQ estéril.
27
fornecido pelo kit. A reação se deu durante 5 minutos. O excesso de líquido foi retirado
com auxílio de uma régua, antes da selagem das bordas do saco plástico.
Pelas buscas nos bancos de dados genéticos do NCBI e KEGG foi possível obter
uma relação de organismos cujo gene que codifica a enzima UGPase já foi seqüenciado.
Este gene foi encontrado em uma ampla gama de organismos, desde bactérias até
mamíferos. Em plantas, o gene já foi seqüenciado em Amorpha fruticosa, Arabidopsis
thaliana, Hordeum vulgare, Musa acuminata, Oryza sativa, Pyrus pyrifolia e Solanum
tuberosum, entre outras espécies.
gi|15823775| ------MAVTADVKLEGLRAATDKLDQISENEKSGFISLVSRYLSGEAEQIEWSKIQTPT 54
gi|1212996| ---MAAAAVAADSKIDGLRDAVAKLGEISENEKAGFISLVSRYLSGEAEQIEWSKIQTPT 57
gi|6625908| ---------MADAKIAKLQSAVAELNQISENEKSGFISLVSRYLSGEAEQIEWSKIQTPT 51
gi|218001| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|15237947| ------MAATATEKLPQLKSAVDGLTEMSENEKSGFINLVSRYLSGEAQHIEWSKIQTPT 54
gi|17026394| -----MAATATDNKLSNLKSAVAGLNQISENEKKGFINLVSRYLSGEAQHVEWSKIQTPT 55
gi|19911799| ---------MATGVIDKLKSHVATLSQISENEKNGFINLVARSVSGEAQHVDWSKIETPT 51
: *: . * ::***** ***.**.* :****::::****:***
Número de Acesso
GI Protein id Cultivar
ao GenBank
Referências: (1) Katsube et al., 1990; (2) Spychalla et al., 1994; (3) Borovkov et al., 1997; (4)
Sowokinos et al. 1 , 2002.
_______________
1
SOWOKINOS, J.R.; VIGDOROVICH, V.; ABRAHAMSEN, M.S. Molecular cloning and sequence
anomalies of UDP-glucose pyrophosphorylase cDNAs from cold-sweetening-sensitive and resistant
potatoes. Trabalho não publicado.
34
gi|1388021| MVTATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863909| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863913| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863911| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863915| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|218001| MATATTLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISENEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|21599| MATAATLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISDNEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863905| MATAATLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISDNEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863907| MATAATLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISDNEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
gi|28863903| MATAATLSPADAEKLNNLKSAVAGLNQISDNEKSGFINLVGRYLSGEAQHIDWSKIQTPT 60
*.**:************************:******************************
EXTREMIDADES 5’
gi|21599|] ATGGCTACTGCTGCTACTCTT----- 21
gi|28863903| ATGGCTACTGCTGCTACTCTT----- 21
gi|28863905| ATGGCTACTGCTGCTACTCTT----- 21
gi|28863906| ATGGCTACTGCTGCTACTCTT----- 21
gi|28863911| ATGGCTACTGCTACTACTCTT----- 21
gi|28863915| ATGGCTACTGCTACTACTCTT----- 21
gi|28863909| ATGGCTACTGCTACTACTCTT----- 21
gi|28863913| ATGGCTACTGCTACTACTCTT----- 21
gi|218001| ATGGCTACTGCTACTACTCTT----- 21
gi|1388021| ATGGTCACTGCTACTACTCTT----- 21
**** ****** ********
EXTREMIDADES 3’
gi|1388021| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|218001| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|21599| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863913| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863903| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863909| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863905| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863906| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863911| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
gi|28863915| AATGGACCTGAGGATATATAG 21
*********************
ë St
2,0 kb ––
1,6 kb ––
1,0 kb ––
0,5 kb ––
Figura 7- Perfil eletroforético do produto de RT-PCR obtido com primers específicos para
amplificar o gene da UGPase (1,4 kb) de Solanum tuberosum (St). A primeira
canaleta (ë) corresponde ao marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder -
Invitrogen
2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
Figura 8- Perfil eletroforético obtido na análise dos clones transformantes. A primeira canaleta
corresponde ao marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder – Invitrogen (ë). A
sexta e sétima canaletas correspondem ao produto de PCR dos clones 1 e 2,
respectivamente
compreendida entre os sítios de anelamento dos primers M13. Desta forma, o tamanho
menor (-32 pb) encontrado não significa necessariamente que o inserto não esteja
completo. A seqüência consenso do inserto e a correspondente seqüência deduzida de
aminoácidos, de acordo com o código IUPAC (Anexo A), encontram-se na Figura 9.
ATGGCTACTGCTGCTACTCTTTCTCCTGCTGAGTCCGAAAAGCTCAACAATCTCAAATCT 60
M A T A A T L S P A E S E K L N N L K S 20
GCCGTCGCCGGTCTTAATCAAATCAGTGAAAATGAGAAATCTGGATTTATTAACCTTGTC 120
A V A G L N Q I S E N E K S G F I N L V 40
GGTCGCTATCTAAGTGGAGAAGCGCAACACATTGACTGGAGTAAGATCCAGACGCCAACT 180
G R Y L S G E A Q H I D W S K I Q T P T 60
GATGAGGTGGTGGTGCCATATGACAAGTTAGCACCTCTTTCTGAAGATCCCGCAGAGACT 240
D E V V V P Y D K L A P L S E D P A E T 80
AAGAAGCTTTTGGACAAACTTGTTGTCCTGAAGCTCAATGGAGGCTTGGGAACAACAATG 300
K K L L D K L V V L K L N G G L G T T M 100
GGATGCACTGGTCCCAAATCAGTTATTGAAGTTCGTAATGGTTTGACATTCCTTGACTTG 360
G C T G P K S V I E V R N G L T F L D L 120
ATTGTCAAGCAAATTGAGGCCCTCAATGCCAAATTCGGATGCAGTGTTCCCCTGCTTTTG 420
I V K Q I E A L N A K F G C S V P L L L 140
ATGAATTCGTTCAACACCCATGATGATACACTGAAGATTGTAGAAAAATATGCGAACTCA 480
M N S F N T H D D T L K I V E K Y A N S 160
AACATTGATATTCATACATTCAATCAGAGCCAGTACCCTCGCCTGGTTACGGAAGACTTT 540
N I D I H T F N Q S Q Y P R L V T E D F 180
GCCCCACTTCCATGCAAAGGCAATTCTGGAAAAGATGGNTGGNACCCTTCANGTCATGGT 600
A P L P C K G N S G K D G W X P S X H G 200
GATGTTTTCCNTTCTTTGATGAATAGTGGAAAGCTTGGTGCACTACTAACCAAAGGAAAG 660
D V F X S L M N S G K L G A L L T K G K 220
GAATATGTTTTTGTNGCAAATTAAGATAACTTGGGTGCCATTGTTGATTTGAAAATCTTA 720
E Y V F V A N * D N L G A I V D L K I L 240
GATATTCATCTGATCNTAACCAAAATTGAGTATGGCATGGAGGTNACTCCCAAAACTTTA 780
D I H L I X T K I E Y G M E V T P K T L 260
GTTGTCAAAGGTGGCNCTTTAATCTCATATGAAGGAAAAGTNCAGCTGCTGGAAATAGCA 840
V V K G G X L I S Y E G K V Q L L E I A 280
CAAGCCCNTGATGAACATGTCAATGAATTCAAGTCAATTGAAAAATTCAAAATTTTCAAT 900
Q A X D E H V N E F K S I E K F K I F N 300
ACCAACAACTTGTGGGTGAATCTGAGTGCTATTAAAAGACTTGTAGAAGCAGATGCACTC 960
T N N L W V N L S A I K R L V E A D A L 320
AAGATGGAGATTATTCCCAACCCAAAGGAAGTGGACGGAGTCAAAGTTCTTCAACTTGAA 1020
K M E I I P N P K E V D G V K V L Q L E 340
ACTGCTGCCGGTGCTGCAATTAAGTTTTTTGACCGGGCAATTGGTGCTAATGTTCCTCGA 1080
T A A G A A I K F F D R A I G A N V P R 360
TCTCGTTTCCTTCCCGTGAAAGCAACTTCAGATTTGCTCCTTGTTCAGTCTGATCTTTAC 1140
S R F L P V K A T S D L L L V Q S D L Y 380
ACCTTGACTGATGAGGGCTATGTTATCCGAAACCCGGCCAGGTCGAATCCATCCAACCCA 1200
T L T D E G Y V I R N P A R S N P S N P 400
TCCATCGAGTTGGGACCTGAATTCAAGAGGGTGGCCAACTTCTTAGGCCGTTTCAAGTCT 1260
S I E L G P E F K R V A N F L G R F K S 420
ATTCCCAGCATCATTGATCTAGATAGCTTGAAGGTGACCGGTGATGTATGGTTCGGATCC 1320
I P S I I D L D S L K V T G D V W F G S 440
GGCGTTACCCTAAAGGGGAAAGTGACTGTTGCAGCCAAATCAGGAGTGAAGCTAGAAATT 1380
G V T L K G K V T V A A K S G V K L E I 460
CCAGATGGTGCTGTGNNGCCAC
P D G A V X P
A análise da seqüência consenso por meio do pro grama BlastX revelou alta
homologia (valor E = 0.0) com UGPases de diferentes cultivares de batata (Katsube et
al., 1990; Spychalla et al., 1994, Borovkov et al., 1997; Sowokinos et al., 2002), bem
como de outras espécies vegetais (Tabela 2).
UTP--glucose-1-
5.3e-
!! UDPGP 32 445 1 480 824.3 glocal phosphate
245
uridylyltransferase
Figura 10- Representação diagramática da extensão do domínio UDPGP (em verde) em relação à
seqüência deduzida a partir do cDNA codificador da UGPase de batata, obtida no
programa Pfam. A figura é idêntica à de diferentes gi(s) da enzima em batata
O resultado obtido indica que o gene que codifica a UGPase está presente no
genoma de eucalipto e que este pode ser amplificado por meio de PCR mesmo com os
primers desenhados para a batata. Entretanto, as condições de amplificação precisam ser
aprimoradas.
ë Eg
1,6 kb ––
1,0 kb ––
0,5 kb ––
Eimert et al. (1996) também concluíram que a UGPase é codificada por um único
gene em cevada. No entanto, a hipótese de um único gene é difícil de se ajustar às
evidências dadas pelo polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP)
46
que indicam a presença de pelo menos três genes codando UGPase em cevada
(Kleinhofs, citado por Eimert et al., 1996).
St Eg
HindIII PstI Hind III PstI
kb
12,2 –
7,0 –
5,0 –
4,0 –
3,0 –
2,0 –
1,6 –
1,0 –
47
Figura 12- Análise de Southern blot do DNA genômico de Solanum tuberosum (St) e de
Eucalyptus grandis (Eg) parcialmente digeridos com as enzimas de restrição HindIII
e PstI. O produto da reação de RT-PCR da UGPase de batata foi utilizado como
sonda
5 CONCLUSÕES
ANEXO F. Tampão de lavagem B para purificação de mRNA (de acordo com kit
Dynabeads mRNA Purification da Dynal
Componente Concentração Final
Tris-HCl (pH 7.5) 10 mM
LiCl 0,15 M
EDTA 1 mM
Água MilliQ tratada com DEPC q.s.p. 4 ml
Autoclavar
ANEXO K. Meio LB
Componente p/v (%)
Bacto triptona 1,0
Bacto extrato de levedura 0,5
NaCl 1,0
Ágar bacteriológico (para meio sólido) 1,0
Ajustar pH 7.0
Água MilliQ q.s.p. 1 L
ANEXO S. Tampão TE
Componente Concentração Final
Tris-HCl pH 8.0 10 mM
EDTA pH 8.0 1 mM
Água MilliQ q.s.p.
57
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