UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
Y BIOQUÍMICA II

CINÉTICA ENZIMÁTICA

El objetivo de la práctica es la determinación de algunas de las características cinéticas

de la enzima fosfatasa alcalina del intestino delgado de cerdo, mediante el estudio del
efecto de la concentración de la enzima y del sustrato, de la temperatura, del pH y del
fosfato inorgánico, sobre la actividad de la enzima. Utilizando las gráficas sobre la cinética
de la enzima, se determinarán los parámetros velocidad máxima, KM y KI.

La enzima fosfatasa alcalina pertenece a la clase de fosfatasas denominadas

fosfomonoesterasas u ortofosfórico-monoéster-fosfohidrolasas (E.C. 3.1.3.1), que
catalizan la reacción general:

O O

R – O – P – O- + H2O R - OH + HO – P – O-

OH OH

Para las determinaciones cinéticas se utilizará el método de Bessey, Lowry y Brock,

usando como sustrato el para-nitrofenilfosfato (p-NFP), incoloro y haciendo las
cuantificaciones espectrofotométricas del para-nitrofenol, de color amarillo, formado en la
reacción.

MATERIALES Y REACTIVOS:

Espectrofotómetro Amortiguador Tris 20 mM, pH 9.6

Baños a 37°C y 50°C
Baños de hielo y de agua hirviendo
Vasos de precipitados de 50 ml
Matraz Erlenmeyer de 100 ml
Mortero
Bisturí
Micropipetas
Probeta de 10 ml
Centrífuga refrigerada
Gradilla con tubos de ensayo
Amortiguadores de pHs 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 10.5
p-Nitrofenilfosfato (p-NFP) 2 mM
p-Nitrofenol (p-NF) 2 mM
Solución de fosfatos 0.01 M
Glicerol
Mucosa intestinal de cerdo (Extracto enzimático)
Agua destilada
Arena lavada
NOTAS IMPORTANTES:
Tenga muy en cuenta las siguientes observaciones, necesarias para el éxito de la
práctica.

1. Trate de medir con la mayor precisión los volúmenes en cada tubo de reacción.
Use la micropipeta o la combinación de pipetas que sea la más adecuada para la
exactitud de las medidas.

2. Evite la contaminación del sustrato, p-nitrofenilfosfato, con la preparación

enzimática. Lo más conveniente es que use una pipeta de manera exclusiva para
medir los volúmenes de p-NFP y otra diferente para la preparación enzimática.

3. Siempre agregue la preparación enzimática de última en cada tubo de reacción. El

tiempo de la reacción se mide a partir del momento en que se agrega la enzima.
Las reacciones se realizarán a temperatura ambiente, excepto las del punto 5, que
se efectuarán a diversas temperaturas.

4. Después de los 10 minutos de reacción, añada en todos los tubos 0.5 ml de NaOH
1N, para parar la reacción. La actividad de la enzima se medirá mediante la
cuantificación espectrofotométrica a 405 nm del p-nitrofenol (p-NF) formado.

5. La velocidad de la reacción en cada tubo resultará del cálculo de las micromoles

de p-NF formado/ml de preparación enzimática x 10 minutos de reacción. Utilice la
curva de calibración obtenida en el punto 2 para estos cálculos. Tenga en cuenta
que la velocidad se da por ml de preparación enzimática. Haga las conversiones
necesarias.

6. Las concentraciones finales del p-NF (punto 2) y del p-NFP (puntos 4 y 7) deben
calcularse en cada tubo, a partir de los volúmenes y concentraciones iniciales. Se
puede usar la relación.

Vinicial . Cinicial = Vfinal . Cfinal

PROCEDIMIENTOS:

1. Preparación de un extracto crudo de fosfatasa alcalina del intestino de cerdo.

Cada grupo de estudiantes recibirá una porción del intestino delgado de cerdo
lavado. Ábralo longitudinalmente, raspe cuidadosamente la mucosa utilizando la
parte roma de una cuchilla de bisturí y transfiera los raspados a un mortero. Añada
una pequeña cantidad de arena lavada (cantidad que pueda coger con la punta del
bisturí); 1 ml de Buffer Tris pH 9.6 y triture el material por unos 5 minutos. Pase la
mezcla a un tubo de centrífuga, agregue 10 ml de buffer Tris y lave el mortero 2
veces, cada una de ellas con 10 ml de buffer Tris. Agregue los lavados al tubo de
centrífuga. Añada 0.5 ml de glicerol (su función es la de inhibir las enzimas
 proteolíticas). Centrifugue a 2000 r.p.m. por 5 minutos. Transfiera el sobrenadante
a un Erlenmeyer de 100 ml, rotúlelo con el número de su grupo de trabajo y
colóquelo inmediatamente en un baño de hielo.

2. Elaboración de una curva patrón del para-nitrofenol:

Como el para-nitrofenol (p-NF) es el resultado de la acción de la enzima sobre el

para-nitrofenilfosfato (p-NFP), es de gran importancia disponer de una curva
patrón que correlacione los valores de absorbancia a 405 nm, con la concentración
de p-NF presente en el tubo de ensayo, para evaluar la actividad de la enzima y
demás parámetros cinéticos relacionados con dicha enzima.

Prepare 6 tubos de ensayo de la siguiente forma:

Tubo Blanco
Contenido número 1 2 3 4 5 6
Buffer Tris 20 mM pH 9.6,
(ml) 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
p-NF 2 mM, (ml) 0.00 0.025 0.050 0.075 0.100 0.150
Agua, (ml) 3.50 3.475 3.450 3.425 3.400 3.350
NaOH 1N, (ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

Agite suavemente los tubos. Coloque el tubo # 1 en el espectrofotómetro y ajuste a

100% de transmitancia (0 de absorbancia).
Lea la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos: 2, 3, 4, 5 y 6. Calcule la
concentración de p-NF en cada uno de los tubos (en micromoles) y elabore una
curva en papel milimetrado de absorbancia vs. Concentración de p-NF.

Nota: tenga en cuenta esta gráfica para los cálculos de la concentración del p-
nitrofenol formado en las reacciones que se efectuarán en los puntos siguientes de
la práctica.

3. Determinación de la actividad enzimática o variación de la velocidad de la

reacción con la concentración de la enzima a una misma concentración de
sustrato.

Prepare 6 tubos de la siguiente forma:

Tubo número Blanco

Contenido 1 2 3 4 5 6
Buffer Tris 20 mM pH 9.6,(ml)
030 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
p-NFP 2 mM, (ml) 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
Agua, (ml) 4.40 4.35 4.30 4.20 4.15 4.10
Preparación enzimática, (ml) 0 0.050 0.100 0.200 0.250 0.300

Prepare los tubos añadiendo los reactivos en el orden indicado, agregue por
último la enzima, sea cuidadoso al medir los volúmenes. Cuando todo esté listo
 añada la cantidad de enzima indicada con intervalos de un minuto entre un tubo y
otro. Agite para mezclar bien y garantizar que la solución sea homogénea. A los 10
minutos exactos después de añadir la enzima, pare la reacción adicionando 0.5 ml
de NaOH 1N.

Lea la absorbancia a 405 nm de cada tubo, utilizando como blanco el tubo # 1.

Exprese la actividad de su preparación como micromoles de p-NFP transformado
(iguales a los micromoles de p-NF que se producen) por 10 minutos de reacción.
Elabore el gráfico correspondiente.

4. Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática:

Prepare 8 tubos de la siguiente forma:

Tubo Blanco
Contenido número 1 2 3 4 5 6 7 8
Buffer Tris 20 mM pH
9.6,(ml) 030 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
p-NFP 2 mM, (ml) 0.075 0.150 0.30 0.60 1.00 1.25 1.5 0.00
Agua, (ml) 4.375 4.30 4.15 3.85 3.45 3.20 2.95 4.45
Preparación 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
enzimática, (ml)

Deje los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos exactos. Añada a cada uno
de ellos 0.5 ml de NaOH 1 N. Lea la absorbancia a 405 nm de cada uno de ellos
contra el tubo # 8 (usado como blanco). Calcule la concentración del sustrato (p-
NFP) en cada uno de los tubos.
Haga una gráfica de velocidad de reacción (micromoles de p-NF formadas/ml de
preparación enzimática x 10 min.) vs. Concentración del sustrato (milimoles x litro).

5. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática:

Prepare 7 tubos de la siguiente forma:

Tubo Blanco Blanco

Contenido número 1 2 3 4 5 6 7
Buffer Tris 20 mM pH
9.6,(ml) 030 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
p-NFP 2 mM, (ml) 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
Agua, (ml) 4.15 4.15 4.15 4.15 4.15 4.40 4.40
Preparación 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0 0
enzimática, (ml)
Baño
Agua Agua
Temperatura de Ambiente 37°C 50°C Ambiente
hirviendo hirviendo
hielo

Incube por 10 minutos exactos los tubos a la temperatura indicada para cada uno de ellos.
Añada después del tiempo de incubación, 0.5 ml de NaOH 1 N y lea la absorbancia de los
tubos marcados 1, 2, 3 y 4 contra el tubo # 6 (blanco) y la del tubo # 5 en el baño de agua
hirviendo, contra el tubo # 7 (blanco). Explique por qué se deben utilizar dos blancos, uno
a temperatura ambiente y el otro a temperatura del baño de agua hirviendo.
Elabore la gráfica de actividad enzimática (velocidad de la reacción) vs. Temperatura.

6. Efecto del pH sobre la actividad enzimática:

Prepare 8 tubos de la siguiente forma:

Tubo Blanco
Contenido número 1 2 3 4 5 6 7 8
Buffer de pH,(ml) 10.5 10.0 9.60 9.0 8.0 6.0 5.0 9.6
0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
p-NFP 2 mM, (ml) 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30
Agua, (ml) 4.15 4.15 4.15 4.15 4.15 4.15 4.15 4.40
Preparación 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.0
enzimática, (ml)

Mezcle bien, deje los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos exactos. Siga
las instrucciones de la parte 3 y lea la absorbancia a 405 nm de cada uno de los
tubos contra el blanco (tubo # 8).
Elabore la gráfica de actividad enzimática vs. pH.

Preguntas para contestar en su informe:

1. ¿Cómo es la variación de la velocidad de la reacción con relación a la

concentración de la enzima?
2. ¿Qué tipo de cinética presenta la fosfatasa alcalina del intestino delgado de
cerdo?
3. ¿Cuál es el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de esta enzima?
4. ¿Cuáles son la temperatura y el pH óptimos de esta enzima en las condiciones
de la práctica?
5. ¿Cuál es la Vmax y el valor de la K M de la fosfatasa alcalina con el p-NFP
como sustrato? ¿Cómo interpreta estos valores?

NOTA IMPORTANTE!
Cada grupo de trabajo en el laboratorio deberá realizar los puntos 1, 2, 4 y alguno de
los otros (3, 5 ó 6) y deberá completar su informe trabajando con los datos obtenidos
por los demás grupos. Esto, con el fin de descongestionar el trabajo en el laboratorio y
para hacer posible que la práctica se realice cuidadosamente por cada uno de los
grupos. Para la asignación del punto adicional al 1,2 y 4, que trabajará cada grupo, se
deberá consultar al profesor o al asistente de docencia.
UNIVERSIDAD DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
Y BIOQUÍMICA I
CINÉTICA ENZIMÁTICA

HOJA DE REPORTE

ASISTENTES A LA PRÁCTICA: FECHA: _____________

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Punto 2. Elaboración de una curva patrón del p-nitrofenol.

Datos:

Tubo número 1 2 3 4 5 6
A405 nm
[p-nitrofenol]*
*en micromoles de p-nitrofenol.

Gráfica: pegue aquí la gráfica elaborada sobre papel milimetrado.

Punto 3. Actividad enzimática vs. Concentración de enzima.

Datos:

Tubo número 1 2 3 4 5 6
A405 nm
Enzima, ml
Velocidad*
*micromoles de p-NF/ min de reacción.

Gráfica:
Punto 5. Actividad enzimática vs. Temperatura.

Datos:

Tubo # 1 2 3 4 5 6 7
A405 nm
Temperatura
Velocidad*
*micromoles de p-NF/ml de preparación enzimática. Minutos de reacción.

Gráfica:
Punto 4. Actividad enzimática vs. Concentración de sustrato.

Datos:

Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8
A405 nm
[p-NFP], mM
Velocidad*
*milimoles de p-NF/ml de preparación enzimática. Minutos de reacción.

Gráfica:
Punto 6. Actividad enzimática vs. pH.

Datos:

Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 8
A405 nm
pH
Velocidad*
*milimoles de p-NF/ml de preparación enzimática. Minutos de reacción.

Gráfica: