UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL QM2382

YOSELIN APONTE 09-11056 MIÉRCOLES, 15 DE NOVIEMBRE DE 2017

ADRIANA UMBRÍA 12-10638

COMPARACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA DE DOS REFRESCOS COMERCIALES POR

CROMATOGRAFÍA DE FASE INVERSA Y EL MÉTODO DE PATRÓN EXTERNO

RESUMEN

Se utilizó la técnica de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) con un detector de UV-Visible a una
longitud de onda de 254nm con una columna para cromatografía de reparto en fase inversa, donde la fase
estacionaria fue de C18 y la fase móvil fue una solución de metanol y agua en una proporción de 40:60. Para
determinar la concentración de cafeína en dos refrescos comerciales Pepsi-Cola y Coca-Cola se realizó una
curva de calibración con estándares de cafeína anhídrida resultando ser sus concentraciones de (117,3 ± 0,3) ppm
y (140,2 ± 0,3) ppm respectivamente.

PALABRAS CLAVES: Cromatografía Líquida, HPLC, fase inversa, cafeína, refresco.

INTRODUCCIÓN

La cafeína (ver figura 1), es una sustancia que se encuentra naturalmente en las hojas, semillas y frutas. Es
parte de un grupo de compuestos llamados metilxantinas y su nombre sistemático es 1,3,5-trimetilxantina. La
cuantificación de la cafeína en alimentos es de gran importancia, dado que la cafeína es un compuesto
farmacológicamente activo, pues este es un estimulante del sistema nervioso, por ello debe cuidarse la dosis de
cafeína que se consume diariamente. La cafeína es una de las sustancias más consumida en el mundo la cual se
encuentra en diversos alimentos como el café, el té, el chocolate y en bebidas carbonatadas. En la siguiente
figura se puede observar la estructura molecular de la cafeína.
O
CH3
H3C N
N

O N N

CH3
Figura 1.- Estructura molecular de la cafeína

1
 La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) es una de las cromatografías más utilizadas por su
sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas y es ideal para la separación de especies
no volátiles.1 Cada especie tiene un tipo de afinidad por la fase estacionaria lo que hace que esta sea brevemente
retenida por esta fase, por eso cada especie se desplaza por la columna con una determinada velocidad. De
acuerdo con esta velocidad y la longitud de la columna esta especie tendrá un tiempo determinado en llegar al
detector, este tiempo es llamado tiempo de retención 𝑡𝑅 . En un cromatograma se pueden observar los picos de
las distintas especies de una muestra los cuales serán proporcionales a su concentración, además estos aparecerán
en el tiempo de retención característico para cada especie.

La cromatografía de reparto es un tipo de cromatografía líquida en la cual se pueden distinguir dos tipos
cromatografía: cromatografía líquido-líquido y cromatografía de fase unida químicamente. En la actualidad los
métodos con fase unida químicamente son los que predominan debido a las desventajas que presenta los sistemas
líquido-líquido como la pérdida de fase estacionaria por disolución de la fase móvil. Las columnas para
cromatografía de fase unida químicamente se basan en la relación con las polaridades relativas de la fase móvil y
estacionaria, donde se pueden distinguir dos tipos: cromatografía en fase normal y cromatografía en fase inversa.
En la cromatografía en fase inversa, la fase estacionaria es no polar y la fase estacionaria es relativamente no
polar. En cromatografía de fase normal se encuentra lo contrario a en fase inversa.1 Por lo tanto, la escogencia
del tipo de cromatografía dependerá de la polaridad del analito en la solución de la muestra, teniendo en cuenta
que una fase estacionaria polar interactúa más con los compuestos polares y viceversa.

En esta práctica se pretende cuantificar la cafeína en dos bebidas carbonatadas comerciales de diferentes
marcas. Por la naturaleza de la molécula de la cafeína se sabe que esta puede ser detectada en el rango del
espectro ultravioleta y es una molécula polar, por lo tanto, se determinó que hay condiciones óptimas para su
cuantificación utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia mediante cromatografía de reparto en fase
inversa con un detector UV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Para la realización de esta práctica se requirió de cafeína anhídrida marca SIGMA, metanol, pipetas
volumétricas 3, 4, 5, 6, 7 y 8 mL, balones aforados de 50, 100 y 200 mL, un cromatógrafo líquido de Water
Millipore con detector de UV-visible, con una columna de C-18 marca Resolve con partículas de 5 μm y
dimensiones de (3,9x150) mm. El espectrofotómetro se ajustó a 254 nm como sistema de detección. La fase
móvil a utilizar es una solución metanol-agua (40:60) y un flujo de 0,6 mL/min y el volumen de cada inyección
es de 15 μL.

Se tomó una alícuota de cada refresco, se colocaron por separado en un vial y se desgasificaron.
Posteriormente se preparó una solución madre acuosa de cafeína disolviendo (0,17014 ± 0,00001) g de cafeína
anhídrida en 200mL de agua destilada resultando una solución cuya concentración es de (850,7 ± 0,2) μg/mL; a
partir de la solución madre de cafeína se prepararon soluciones patrones entre 50 y 140 μg/mL para establecer la
curva de calibración. Seguidamente los patrones se filtraron por una membrana de 0,2 μm y se fueron inyectando
en la columna para su posterior análisis, se realizó la curva de calibración con los datos obtenidos. Finalmente se
filtraron cada una de las muestras y se midieron sus señales de absorbancia.

2
RESULTADOS

A continuación, se presenta la curva de calibración en la que se presenta la absorbancia de los distintos

patrones en función de la concentración de cafeína.

0.06

y = 0.0004x + 0.0029
0.05 R² = 0.9986
Absorbancia (ua)

0.04

0.03

0.02

0.01

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Concentración de cafeína (μg/mL)

Gráfico 1.- Curva de calibración. Absorbancia en función de la concentración de cafeína

En el gráfico 1, a partir de los datos de absorbancia de los patrones se obtuvo la curva de calibración, la
cual se adapta perfectamente a una recta donde se puede observar que el rango lineal fue de (50-140) µg/mL de
cafeína. Por lo tanto, se obtuvieron los siguientes parámetros mediante el uso de mínimos cuadrados para dado
rango: la pendiente fue de m = 0,00039 ± 0,00001, la intersección de b = 0,0029 ± 0,0007 y el coeficiente
correlación al cuadrado de R2 = 0,9986 ± 0,0005.

Para determinar la concentración de las muestras de bebidas carbonatadas se utilizó la ecuación de la recta
obtenida de la curva de calibración donde a una absorbancia obtenida para cada una de las muestras observadas
en la tabla 1, se logró despejar la concentración contenida en la muestra de cafeína. Por lo tanto, se obtuvieron
los resultados en la siguiente tabla:

Tabla 1.- Datos obtenidos en diferentes marcas de bebidas carbonatadas.

Marca Absorbancia (±0,001 ua) Concentración (...±0,3μg/mL) TR (±1 seg)

Pepsi-Cola 0,049 117,3 237
Coca-Cola 0,057 140,2 234

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Se utilizó un detector de UV-Visible debido a que la cafeína puede absorber energía en este rango del
espectro, donde se eligió específicamente a 254 nm ya que esta es una longitud de onda en la que la cafeína
presenta gran absorción, ciertamente la cafeína presenta absorción a otras longitudes de onda, sin embargo, se
eligió esta para evitar interferencias por otros componentes de los refrescos a la hora de hacer la medición de las
muestras.

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 Utilizando la técnica de HPLC mediante cromatografía de fase inversa se determinaron los tiempos de
retención a partir de los picos en el cromatograma para los estándares de cafeína y las muestras de bebidas
carbonatadas. De acuerdo con el envase de dichas bebidas entre los ingredientes se señala la presencia de
cafeína. Los tiempos de retención obtenidos para los estándares de cafeína y las muestras de bebidas fueron
exactas en un porcentaje de 4,5% de diferencia para la marca de Coca-Cola y un porcentaje de 3,3% de
diferencia en Pepsi-Cola, por lo tanto, confirma la identificación del pico del cromatograma de las muestras a un
mismo tiempo de retención de los estándares con la cafeína. De modo que, relacionando los picos del
cromatograma obtenidos en la curva de calibración y los picos de las muestras se logró determinar la
concentración de cafeína en las bebidas carbonatadas de diferentes marcas. Obteniéndose los resultados de la
tabla 1.

Se realizó una comparación de las concentraciones obtenidas de la tabla 1 con los resultados obtenidos por
Mumin, Akhter, Abedin y Hossain2. Donde, Mumin et. al2 también realizaron un análisis cuantitativo mediante
HPLC con cromatografía en fase inversa a las bebidas carbonatadas para Pepsi-Cola y Coca-Cola. Al realizar la
comparación se obtuvo que en la concentración de cafeína en la Pepsi-Cola hay una diferencia de 16% y en
Coca-Cola una diferencia de 7% de concentración de cafeína. Cabe acotar, que las muestras obtenidas en este
análisis fueron obtenidas y producidas en Venezuela; en cambio en los resultados obtenidos por Mumin et. al2 las
muestras fueron obtenidas por Bangladesh Tea Research Institute. Sin embargo, se pudo observar que hay una
buena exactitud con los resultados obtenidos comparando con Mumin et. al2.

De acuerdo con los resultados de concentraciones obtenidos para ambas marcas de bebidas carbonatadas la
concentración de cafeína en la Coca-Cola es mayor al de Pepsi-Cola en un porcentaje de 19%. Este resultado es
de gran importancia para el conocimiento general dado que se recomienda un mínimo consumo de cafeína al
día, y por tanto, es importante saber la concentración de cafeína en bebidas carbonatadas de consumo común.

CONCLUSIONES

Utilizando la cromatografía líquida de alta eficiencia con una columna de reparto en fase inversa con un
detector de UV-Visible se determinó la concentración de cafeína en dos refrescos comerciales: Pepsi-Cola y
Coca-Cola resultando ser sus concentraciones de (117,3 ± 0,3) µg/mL y (140,2 ± 0,3) µg/mL respectivamente. Y
se tiene una diferencia de 19% entre las concentraciones de cafeína en ambas marcas de bebidas carbonatadas,
siendo la Coca-Cola la que mayor concentración de cafeína tiene.

REFERENCIAS

1. Skoog, D. (2001) Principios de Análisis Instrumental (5ta ed) España – McGraw-Hill/Interamericana de

España. Pag 730-732, 786-828.

2. Mumin M. A., Akhter K. F., Abedin M. Z. and Hossain M. Z. (2006). Determination and
Characterization of Caffeine in Tea, Coffee and Soft Drinks by Solid Phase Extraction and High
Performance Liquid Chromatography (SPE-HPLC). Malaysian Journal of Chemistry, Vol. 8, No. 1,
045-051.

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ANEXOS

En esta sección se presenta los datos obtenidos para la curva de calibración del gráfico 1, el cual se
obtuvieron los valores de absorbancia y el tiempo de retención mediante el cromatograma obtenido. los valores
se encuentran en la siguiente tabla:

Tabla 1.- Datos obtenidos para los estándares de cafeína.

Patrón Cafeína (...±0,0006μg/mL) Absorbancia (±0,001 ua) TR promedio (±1 seg)

1 51,0420 0,023 264
2 68,0560 0,030 252
3 85,0700 0,036 240
4 102,0840 0,043 234
5 119,0980 0,049 240
6 136,1120 0,057 240
Promedio 245