Manual Fundamentos de Biociencias 2018-2

Facultad de Medicina
Área de Bioclínica
MANUAL DE LABORATORIO
FUNDAMENTOS DE BIOCIENCIAS
3 DIRECTIVAS
RECTOR MANUAL ESCRITO Y DISEÑADO POR

MANUAL PRACTICO BIOCIENCIAS - PRIMER SEMESTRE
Dra. María Clara Rangel Galvis

DOCENTES BIOQUIMICA
DECANO Paula Mendoza de Mendoza
Dr. Hugo Cárdenas López Bióloga, MSc
DIRECTOR ÁREA BIOCLÍNICA Claudia Liliana Bueno

Dra. Zoila Castañeda Bacterióloga, MSc
COORDINACIÓN DE EDICIÓN Sandra Milena Duitama

Paula Mendoza De Mendoza Lic .Química, MSc
Claudia Liliana Bueno
COLABORADORES
Flor Alba Fajardo R.
Centro de Diseño y Comunicación
DISEÑO Y DIAGRAMACIÓN
Centro de Diseño y Comunicación
Facultad de Creación y Comunicación
Facultad de Medicina
Área de Bioclínica
Contenido
Prólogo 5
Normas básicas de laboratorio 6
Normas de comportamiento en el laboratorio

32 de bioquímica 7
Indicaciones para lograr el cumplimiento de los objetivos

de las prácticas 8
Práctica No. 1
Análisis espectrofotométrico 9
Práctica No. 2
Identificación y caracterización de carbohidratos
en una muestra de orina 21
Práctica No. 3
Identificación y caracterización de lípidos en suero 31
Práctica No. 4
Identificación de las propiedades químicas
y biológicas de las proteínas 45
Práctica No. 5
Enzimas Óxido - reducción. Succinato deshidrogenasa 59
Práctica No. 6
Cinética enzimática de la asparto aminotransferasa 67
4
Prólogo
El manual práctico de la asignatura de Fundamentos de Biociencias fue diseñado para
estudiantes de primer semestre de Medicina de la Universidad del Bosque y tiene como
objetivo principal integrar los conceptos teóricos de las biomoléculas, su composición
química y funciones biológicas en el contexto celular, con las actividades prácticas a fin
de construir un conocimiento sólido para futuras asignaturas. Asimismo, la aplicación
de estas prácticas de laboratorio permitirá fortalecer las habilidades y destrezas cien-
tíficas de los estudiantes en el laboratorio de bioquímica.
El contenido general del texto está constituido por seis prácticas de bioquímica que
se desarrollaran durante el semestre, acorde con los contenidos teóricos y los
objetivos de aprendizaje establecidos para esta asignatura. Estas guías de laboratorio
han sido actualizadas y adaptadas a las necesidades de los estudiantes y de la
universidad con el propósito de contribuir a su formación profesional. En cuanto al
componente de bioquímica, la primera práctica de laboratorio tiene como fin la
iden- tificación de los principios básicos de la espectrofotometría como técnica de
5 rutina en el laboratorio clínico y el análisis de muestras con concentración
desconocida. Las prácticas 2, 3 y 4 tienen como objeto la identificación de las
propiedades químicas y biológicas de los carbohidratos, lípidos, aminoácidos y
proteínas a partir de técnicas sencillas, como cromatografía en capa fina y pruebas

colorimétricas. Las prácticas 5 y 6 están diseñadas para comprender el mecanismo de
acción de las enzimas y la determinación de valores asociados a su actividad, como
Km y Vmax.
Cada guía de laboratorio está compuesta por los objetivos, la introducción del tema
que será útil para el desarrollo de las actividades experimentales, una preparación
previa que complementará los conceptos teóricos, una descripción de los materiales y
reactivos requeridos, la metodología, una explicación del manejo de datos y tablas de
resultados para facilitar el análisis posterior, los temas de aplicación que les ofrecerá
información adicional y las referencias bibliográficas, las cuales han sido complemen-
tadas con material didáctico seleccionado de diferentes páginas web. Adicionalmente,
al finalizar cada guía se encuentra adjunto un formato que guiará a los estudiantes en la
discusión y la integración de los resultados con los temas de aplicación.
Esperamos que disfruten el desarrollo de estas prácticas de laboratorio y les sean de
gran utilidad en el futuro!
Luz Yurany Moreno

Paula Marcela Mendoza
Normas básicas de laboratorio
1. Ingrese y salga del laboratorio en las horas establecidas para la práctica.
2. Use siempre bata blanca, limpia, con manga larga, en buen estado y apuntada.
3. Colóquese la bata antes de ingresar al laboratorio y retíresela después de salir.
4. Use siempre guantes de látex desechables para manipular las muestras biológicas
y piezas del anfiteatro.
5. No ingiera alimentos ni bebidas dentro de los laboratorios.
6. Mantenga el cabello recogido y si es necesario use gorro.
7. No retire el material biológico del laboratorio.
8. Sólo ingrese al laboratorio con los implementos y útiles que va a utilizar; deje la
maleta en su locker, no en la entrada del laboratorio.
9. No manipule ni cambie de posición las piezas del Museo de Anatomía.
6 10. Mantenga limpio su sitio de trabajo después de cada disección y práctica de
laboratorio.
11. Use los pipeteadores para manipular las sustancias químicas.
12. No manipule reactivos ni equipos sin la supervisión del docente encargado.

13. Apague el microscopio después de utilizarlo.
14. Para encender los mecheros solicite la colaboración de la auxiliar.
15. Descarte los elementos (agujas, hojas de bisturí, lancetas, etc.) solamente en el
biocontenedor.
16. Descarte el material peligroso y no peligroso en los recipientes determinados
para cada fin.
Normas de comportamiento en el laboratorio de bioquímica
1. No olvide CUMPLIR las medidas de bioseguridad
2. Maneje con cuidado el material, equipos y reactivos que hay en el laboratorio,
recuerde que son para usted y sus compañeros.
3. Trabaje CUIDADOSA Y ORGANIZADAMENTE para evitar accidentes en el
laboratorio.
4. Mantenga su celular apagado durante la práctica.
5. Recuerde que en el laboratorio no se come, no se fuma, no se usan cosméticos,
sacos, gorras, sombreros, bufandas, ni ningún otro accesorio. Tampoco entre al labo-
ratorio equipos de sonido.
6. Recuerde dejar su maleta en el locker, al laboratorio debe ingresar únicamente
guías, cuaderno, textos de consulta y lapiceros. Recuerde llevar siempre bata blanca,
limpia, en buen estado abotonada y sin remangar.
7
7. Los estudiantes deben traer guantes para cada práctica.
8. Antes de iniciar la práctica revise el material de vidrio. Reporte a la auxiliar, el
material que no se encuentre en buen estado. Después de realizada la práctica, por
favor lavar el material utilizado (según las indicaciones) y dejar su sitio de trabajo
limpio y organizado, tal como lo recibió.
9. Sea puntual, ya que después de 5 minutos de pasada la hora de entrar al laborato-
rio, no se permitirá el ingreso de estudiantes.
10. Se llamará a lista a la entrada del laboratorio. Recuerde que debe presentar excu-
sa justificada, en caso de no asistir a la práctica (leer reglamento).
11. Se recomienda trabajar de manera organizada para que el tiempo destinado al
laboratorio sea bien aprovechado. Recuerde dejar el material de laboratorio en condi-
ciones adecuadas para que el grupo siguiente lo encuentre en óptimas condiciones.
Indicaciones para lograr el cumplimiento de los objetivos
de las prácticas
1. Como preparación previa a la práctica, el estudiante debe leer y comprender el
marco teórico de la guía, revisando con mayor detalle el fundamento químico en el
que se basa la metodología y complementar la información con artículos de actuali-
zación indicados por los docentes (esta información la encontrará una semana antes
en el aula virtual o en la fotocopiadora).
2. Con el objetivo de verificar la preparación previa del tema, se realizarán QUICES
sobre cada práctica.
8
Práctica No. 1
Laboratorio de Bioquímica
Análisis espectrofotométrico
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Identificar la función de una curva espectral en un compuesto definido.
» Determinar la función de una curva de calibración
» Reconocer al análisis espectrofométrico como una técnica de uso común en el
laboratorio para la determinación de concentraciones de muestra desconocidas.
» Determinar la concentración de una muestra problema.
9 Introducción
El estudio a nivel bioquímico de cualquier macromolécula requiere el uso de técnicas
analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su carac-
terización fisico – química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesible y
utilizado es la espectrofotometría en general, y la espectrofotometría UV – visible en
particular. Se pueden cuantificar e identificar biomoléculas con el empleo de reactivos
específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto colo-
reado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectrofotometría consiste en la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV – visible. Las longi-
tudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la
que se absorben depende de su estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza iónica, constante dielétrica) por lo que dicha técnica constituye un
valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis
en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por
una molécula se origina un salto energético desde un estado basal o fundamental
E1, a un estado de mayor energía o estado excitado, E2 y solo se absorberá la
energía que permite el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de
estados excitados (o bandas) que la distinguen del resto de moléculas. Como
consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula
(espectro de absorción) constituye una característica de identidad de la misma. Por
último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado
energético fundamental.
En espectroscopía el término luz no solo aplica a la forma visible de la radiación electro-
magnética, sino también a las formas ultravioleta (UV) e infrarrojo (IR), que son imper-
ceptibles para el ojo humano. En espectroscopía de absorción se utilizan las regiones
del ultravioleta (195 – 400 nm) y el visible (400 – 780 nm) (Figura 1). (Ver figura 1 en la
siguiente página)
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 – 400 nm. Es
una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura
común. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos,
sistemas aromáticos, grupos carbonilo y otros heteroátomos tiene su máxima absorción
en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y
cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores como pH, concentración de
sal y el disolvente, que alteran la carga de las moléculas, provocan un
desplazamiento de los espectros UV.
10-4 10-5 10-7 10-8 10-10 10-13

ondas de radio rayos infrarrojos luz visible ultravioleta x-rayos γ
(gama)rayos
red violet
Orange yellow green blue
Long de λ -7 -7 -7 -7 -7
onda (in meters) 6.5-7x10 5.9-6.5x10 5.7-5.9x10 4.9-5.7x10 4.2-4.9x10 4-4.2x10-7
Figura 1. Espectro electromagnético. Tomado de http://www.revisionworld.com/files/spectrum%20copy.jpg

10
En la región visible se aprecia el color de una solución que corresponde a las longitudes
de onda de luz que transmite y no a las que absorbe. El color que absorbe es complemen-
tario al color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario
utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada (Tabla 1). [1]
Tabla 1. Relación entre longitud de onda, color que absorbe una molécula y color que refleja. [1]
Longitud de onda aproximada (nm) Color de luz que absorbe Color de luz que se refleja
390 – 435 Violeta Amarillo verdoso
435 – 490 Azul Amarillo
490 – 580 Verde Rojo
580 – 595 Amarillo Azul
595 – 650 Naranja Azul verdoso
650 – 780 Rojo Verde azulado
Transmitancia y Absorbancia
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz
o cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará
pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It
La Transmitancia de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de
luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la
cantidad de luz que incidió sobre ella, Io y se representa normalmente como tanto
por ciento:
%T = It/ Io x 100. La Transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad
de la luz incidente y la luz transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y
la concentración de la muestra no es lineal, pero asume una relación logarítmica
inversa.
La absorbancia es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica
la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = - log T. Cuando la intensidad incidente y transmitida son
iguales (Io = It), la transmitacia es el 100% e indica que la muestra no absorbe a una
longitud de onda determinada, y entonces A es igual al log 1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de
la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
Ley de Lambert – Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de
onda fija) y concentración de un cromóforo en solución.
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende
11
de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad, denominada coeficiente de extin-
ción, que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones

o unidades de ε depende de la concentración (c) y I. La segunda dimensión (I) se
expresa en cm mientras que la primera (c) se expresa, siempre que sea posible, en
concentración molar (M), con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1 cm-1. La ley
de Lambert – Beer se cumple para soluciones diluidas. [1]
Curva Espectral o Espectro de Absorción

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz
absorbida a diferentes valores de longitud de onda (λ). A partir de una solución diluida
de un compuesto, cuya absorbancia máxima entra en el rango de medida del espec-
trofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a
un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a caracterizar. A
partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el compuesto presenta
la mayor absorbancia (λmax). Esta λ se utilizará al realizar determinaciones cualitativas
y cuantitativas del compuesto (Figura 2). El espectro de absorción de un cromóforo
depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula.
Espectro de absorción del ion [Ti (H2O)6]3+
1
0,8
Absorbancia
0,6
0,4
0,2
0
380 420 460 500 540 580 620
Longitud de onda (nm)
Figura 2. Representación gráfica de una curva espectral de un compuesto específico, el cual muestra una mayor
absorción 470 nm.
Curva de Calibración
Para obtener una curva de calibración de un compuesto se preparan soluciones de dife-
rentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de
absorbancia a la λmax. Estos valores de absorbancia se representan en el eje Y y los de
concentración en el eje X. Se debe observar que a bajas concentraciones, el aumento
de concentración corresponde con un incremento lineal de la absorbancia (zona de
cumplimiento de la Ley de Lambert - Beer). A concentraciones altas la linealidad se
pierde y se observa que la línea es aplanada, por lo que las medidas son poco fiables.
A partir de esta curva es posible determinar la ecuación de la recta (y= A + Bx, en donde
“y” es igual al dato de absorbancia, “A” es el punto de intersección, “B” es la pendiente de
la gráfica, y “x” corresponde a la valor de concentración) mediante regresión lineal, para
lo cual es necesario determinar a: punto de intersección, b: pendiente y r: coeficiente de
correlación. De esta manera es posible despejar X (concentración) de la ecuación y reem-
plazar Y por la absorbancia registrada para la muestra (Figura 3). [1]
12
1,5
y = 0,384x - 0,029
Absorbancia
1
R2 = 0,999
0,5
0
0 1 2 3
Concentración
Figura 3. Representación gráfica de una curva de calibración para un compuesto específico a una λ determinada,
la cual muestra una linealidad entre la absorbancia y la concentración.
Las muestras se deben leer en un rango de absorbancia de 0.1 a 0.9 para que los datos
sean confiables.
Preparación previa
Defina regresión lineal y determine la ecuación de la recta en la calculadora para los
siguientes datos:
X (concentración) Y (Absorbancia)
2 0.12
4 0.24
8 0.48
16 0.96
a:
b:
r:
Materiales y reactivos
Materiales
3 Balones aforados de 50 ml
10 tubos de ensayo
Gradilla
Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 ml
Reactivos
Naranja de metilo 100 mg/L
Muestra de sangre
Muestras problema (A y B) de concentración desconocida de naranja de metilo
13
Procedimiento
Curva Espectral para la solución de Hemoglobina

1. Pipeteé 0.5 ml de la muestra de sangre, llévelos al balón aforado de 50 ml y afore
con H2O destilada.
2. Antes de iniciar las mediciones, fije el espectrofotómetro a 0 de Absorbancia (Abs)
y 100% T con un blanco de H2O destilada.
3. Lea las absorbancias de la solución preparada en las siguientes longitudes de onda:
400, 420, 440,460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
4. Registre los datos obtenidos y grafique en una hoja de papel milimetrado. Re-
cuerde que la Absorbancia se gráfica en el eje Y y la  en el eje X.
Curva Espectral para la solución de Naranja de Metilo

1. Pipeteé 5 ml de la solución stock de Naranja de metilo 100 mg/L, llévelos al ba-
lón aforado de 50 ml y afore con H2O destilada.
2. Determine el factor de dilución (fd) y la concentración de la solución diluida.
3. Antes de iniciar las mediciones, fije el espectrofotómetro a 0 de Abs y 100% T
con un blanco de H2O destilada.
4. Lea las absorbancias de la solución preparada en las siguientes longitudes de onda:

400, 420, 440, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
Registre los datos obtenidos y grafique en una hoja de papel milimetrado. Recuerde
que la Abs se gráfica en el eje Y y la λ en el eje X.
Curva de calibración para la solución de Naranja de Metilo
1. Pipeteé 5 ml de la solución patrón de Naranja de metilo 100 mg / L, llévelos a un
balón aforado de 50 ml y afore con H2O destilada.
2. Determine la concentración y el factor de dilución de esta solución.
3. A partir de esta solución prepare una serie de diluciones de concentración cono-
cida de la siguiente manera:
Reactivos Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Naranja de metilo 1 ml 2 ml 4 ml 8 ml 10 ml
H2O destilada 9 ml 8 ml 6 ml 2 ml -
Factor de dilución (fd)
Concentración
14 Tabla 2. Preparación de las diluciones para la curva espectral.
4. Determine el factor de dilución (fd) y la concentración de cada uno de los tubos.

5. Registre la Abs de cada uno de los tubos.

6. Grafique los datos obtenidos en un papel milimetrado, recuerde que en el eje Y
se ubican los datos de Abs y en el eje X, la concentración. Determine la ecuación
de la recta.
7. El docente le entregará dos soluciones del compuesto que está analizando y us-
ted debe determinar la concentración de cada una de ellas, teniendo en cuenta la
ecuación de la recta.
Bibliografía
ABRIL, N., BÁRCENA, A., et al. Espectrofotometría: Espectros de Absorción y Cuan-
tificación Colorimétrica de Biomoléculas. 2000.
SKOOG, D.A. y WEST, D.M. Química Analítica Ed. McGraw-Hill México. 2001.
BISHOP, ML., FODY, EP., SCHOEFF, LE. Química Clínica. Principios, Procedimien-
tos y Correlaciones. Quinta edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2007.
HENRY J. El Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marban libros. Edición en espa-
ñol. 2007
BAYNES, JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Medica. Segunda edición. Elsevier
Mosby. Madrid, España.2006.
GAW A., COWAN, RA., O`REILLY, DSt., STEWART, MJ., SHEPHERD, J. Bioquímica
Clinica. Texto Ilustrado en color. Segunda edición. Harcourt. 2001. Madrid, España.
http://www.youtube.com/watch?v=pxC6F7bK8CU
https://ezproxy.unbosque.edu.co/login?url=https://accessmedicin
a.mhmedical.com/book.aspx?bookid=1441
FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICAS DE LABORATORIO FUNDAMENTOS DE BIOCIENCIAS
FORMATO DE RESULTADOS ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO
Resultados
Análisis espectrofotométrico
1. Curva Espectral de hemoglobina
Tabla 1. Datos obtenidos para la curva espectral de hemoglobina
λ (nm) Abs (%)T
400
420
440
15 460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
660
680
700
Gráfica 1. Por favor grafique los datos de Absorbancia y Transmitancia para cada longitud de onda (λ (nm) vs Abs)
y (λ (nm) vs T%)
Conclusión de la gráfica:
2. CURVA ESPECTRAL DE NARANJA DE METILO
Determinación de la concentración de la solución de Naranja de metilo utilizada para la
determinación de la longitud de onda en donde este compuesto presenta mayor absorción:
5 ml
Naranja de Medio
100 mg/ L
50 ml
CALCULOS
16
Tabla 2. Datos obtenidos para la curva espectral de naranja de metilo a una concentración de:
Por favor registre los datos de Absorbancia y Transmitancia para cada longitud de onda
( λ (nm) vs Abs) y (λ (nm) vs T%)
λ Abs (%)T
(nm)
400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
660
680
700
Gráfica 2. Curva espectral de naranja de metilo a una concentración de

17
3. Preparación curva de calibración naranja de metilo
Determine de la concentración de las diluciones de Naranja de metilo utilizadas para

la curva de calibración de este compuesto:
Volumen
final 10 ml
1 ml
5 ml 2 ml
4 ml
Naranja de Medio
100 mg/ L
8 ml
50 ml
10 ml
Concentración:
CÁLCULOS:
Fd = Volumen total / Volumen soluto o Concentración final = Concentración Stock/Fd

dilución
TUBO 1: TUBO 4:
Fd 1: Fd 4:
Concentración 1: Concentración 4:
TUBO 2: TUBO 5:
18
Fd 2: Fd 5:
Concentración 2: Concentración 5:
TUBO 3:
Fd 3:
Concentración 3:
4. Determinación concentración muestras problema a y b

Tabla 3. Datos obtenidos para la curva de calibración de naranja de metilo a nm
Concentración
Concentración Naranja de metilo (mg/L) Naranja de Abs.
metilo (mg/ml)
Gráfica 3. Curva de calibración de naranja de metilo a nm (mg/ml vs Abs)
19
Ecuación de la recta
a:
b:
r:
Determinación de la concentración de las muestras problema A y B.
Abs muestra A: Abs muestra B:

CÁLCULOS
Concentración de la muestra muestra problema A:

Concentración de la muestra problema B:
5.
Consulta
Consulte y sustente tres exámenes que se empleen en el laboratorio clínico que
utilicen la espectrofotmetría de absorción en luz UV o visible.
Por favor solo escriba fundamento o utilidad, no mencione procedimiento detallado.
20
Práctica No. 2
Identificación y caracterización de carbohidratos en una muestra de orina
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Reconocer la propiedad reductora de los carbohidratos mediante la prueba de
Benedict
» Identificar las propiedades químicas de los carbohidratos mediante cromatografía
en papel
» Identificar la presencia o ausencia de carbohidratos en la orina de un paciente
» Establecer las posibles causas de la excreción de carbohidratos en la orina
21
Introducción
Propiedades químicas de los carbohidratos

Los carbohidratos, hidratos de carbono o glúcidos son moléculas orgánicas compuestas
por carbono, hidrógeno y oxígeno unidos mediantes enlaces covalentes, los cuales
poseen gran cantidad de energía, que es liberada al romperse estos enlaces. Una parte
de esta energía es aprovechada por el organismo consumidor, y otra parte es alma-
cenada en el organismo. Los carbohidratos son moléculas polares que fácilmente se
solubilizan en agua y se clasifican de acuerdo a la cantidad de carbonos o por el grupo
funcional que tienen adherido.
Los glúcidos más simples, los monosacáridos, están formados por una sola molécula;
no pueden ser hidrolizados a glúcidos más pequeños. La fórmula química general de
un monosacárido es (CH2O)n, donde n es cualquier número igual o mayor a tres, su
límite es de 6 carbonos. Los monosacáridos poseen siempre un grupo carbonilo en uno
de sus átomos de carbono y grupos hidroxilo en el resto, por lo que pueden conside-
rarse polialcoholes. Los monosacáridos se clasifican de acuerdo a tres características dife-
rentes: la posición del grupo carbonilo, el número de átomos de carbono que contiene y
su quiralidad. Si el grupo carbonilo es un aldehído, el monosacárido es una aldosa; si el
grupo carbonilo es una cetona, el monosacárido es una cetosa. Los monosacáridos más
pequeños son los que poseen tres átomos de carbono, y son llamados triosas; aquéllos
con cuatro son llamados tetrosas, los que poseen cinco son llamados pentosas, seis son
llamados hexosas y así sucesivamente. Los sistemas de clasificación son frecuentemente
combinados; por ejemplo, la glucosa es una aldohexosa (un aldehído de seis átomos de
carbono), la ribosa es una aldopentosa (un aldehído de cinco átomos de carbono) y la
fructosa es una cetohexosa (una cetona de seis átomos de carbono) (Figura 1).
Cada átomo de carbono posee un grupo de hidroxilo (-OH), con la excepción del primero
y el último carbono, todos son asimétricos, haciéndolos centros quirales con dos posibles
configuraciones cada uno (el -H y -OH pueden estar a cualquier lado del átomo de
carbono). Debido a esta asimetría, cada monosacárido posee un cierto número de
isómeros. Por ejemplo la aldohexosa D-glucosa, tienen la fórmula (CH2O)6, de la cual,
exceptuando dos de sus seis átomos de carbono, todos son centros quirales, haciendo que
la D-glucosa sea uno de los estereoisómeros posibles. En el caso del gliceraldehído, una
aldotriosa, existe un par de posibles esteroisómeros, los cuales son enantiómeros y
epímeros (la 1,3-dihidroxiacetona, la cetosa correspondiente, es una molécula simétrica
6
CH OH
2
6 C-OH 1 CH2OH
5
O O
H H
H 5 H HO 2
4 1
OH H α 4 3
HO OH OH
3 2
H OH OH H
Figura 1. Estructuras en proyección Haworth de una aldohexosa (Pirano) y una aldopentosa (Furano). Tomado de
Robert Horton, Laurence A. Moran, K. Gray Scrimgeour, Marc D. Perry y David Rawn. Principles of Biochemistry,
4 th ed, Pearson Prentice Hall, 2006, pág. 228 – 231.
que no posee centros quirales). La designación D o L es realizada de acuerdo a la orienta-

ción del carbono asimétrico más alejado del grupo carbonilo: si el grupo hidroxilo está a
la derecha de la molécula es un azúcar D, si está a la izquierda es un azúcar L. Como los
D azúcares son los más comunes, usualmente la letra D es omitida. Adicionalmente, son
22 la forma biológica primaria de almacenamiento y consumo de energía.
Los oligosacáridos son polímeros formados por 2 a 20 unidades de monosacáridos, dentro
de los cuales los más comunes son los disacáridos formados por dos moléculas y, por
tanto, al hidrolizarse producen dos monosacáridos libres, los cuales se unen mediante un
enlace covalente conocido como enlace glucosídico, tras una reacción de deshidratación
que implica la pérdida de un átomo de hidrógeno de un monosacárido y un grupo hidro-
xilo del otro monosacárido, con la consecuente formación de una molécula de H2O, de
manera que la fórmula de los disacáridos es C12H22O11 (Figura 2).
CH2OH CH2OH
5
H O H H O HO
H H
1 4
OH H α OH H
HO O H
H OH H OH
Figura 2. Formación de un enlace glucosídico tras la interacción de dos monosacáridos. Tomado de LEHNINGER
David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 238 – 288.
Por último, los polisacáridos son polímeros de más de 20 unidades de monosacáridos,

entre los cuales los más comunes son el almidón, el glucógeno y la celulosa. Los polisacá-
ridos pueden ser clasificados como homopolisacáridos, cuando sus unidades de carbohi-
dratos son iguales, o heteropolisacáridos, cuando sus unidades básicas son diferentes. [1-3]
Importancia Biológica y Médica de los Carbohidratos

Los carbohidratos se encuentran ampliamente distribuidos en plantas y animales; los
cuales tienen importantes funciones a nivel metabólico y estructural. En plantas, la
glucosa es sintetizada a partir de dióxido de carbono y agua mediante la fotosíntesis y
es almacenada como almidón o usada para la síntesis de celulosa. Los animales pueden
sintetizar glucosa a partir de moléculas como el glicerol (procedente de la degradación
de ácidos grasos) y algunos aminoácidos; sin embargo, preferencialmente utilizan los
carbohidratos procedentes de las plantas como fuente de energía.
La glucosa es el carbohidrato más importante del metabolismo; muchos de los carbo-
hidratos que son ingeridos en la dieta, son transportados al torrente sanguíneo como
glucosa, y otros azúcares, como galactosa y fructosa, pueden entrar a la vía glucolí-
tica mediante la acción enzimática de diversas proteínas. Esta hexosa es la principal
fuente de energía para los mamíferos (excepto para los rumiantes) y la fuente universal
de energía para el feto. Es el precursor de la síntesis de todos los otros carbohidratos
en el cuerpo, incluyendo del glucógeno (reserva energética en células de mamíferos),
pentosas (precursores de nucleótidos para síntesis del material genético), lactosa y
mucopolisacáridos (localizados en la matriz extracelular)
La deficiencia en la actividad de alguna de las enzimas encargadas del metabolismo de
los carbohidratos genera una serie de enfermedades. Entre las más comunes, se encuen-
tran las enfermedades asociadas al metabolismo de la galactosa y fructosa, conocidas
como galactosemia y fructosuria, respectivamente. Así mismo, la deficiencia o ausencia
de las enzimas encargadas del metabolismo del glucógeno, puesto que se generan
23 anormalidades en el proceso de síntesis o degradación del mismo, lo cual se
relaciona generalmente con un agrandamiento del hígado (hepatomegalia) e
hipoglicemia.
Por otra parte, la diabetes es una de las enfermedades más comunes relacionada
con el metabolismo de glucosa y se manifiesta por un incremento anormal en la
concentración de este azúcar en el torrente sanguíneo. Esta enfermedad puede ser
ocasionada por diversos factores, entre ellos: la deficiencia en la producción de una
hormona polipeptídica conocida como insulina por las células β del páncreas, la cual
es la encargada de inducir la entrada de glucosa a todas las células del cuerpo (Tipo
1) o por la deficiencia enzimática de otras proteínas involucradas en el metabolismo
de este carbohidrato (Tipo 2) (Fig 3). [4-5]
Normal cell Type 1 diabetes cell Type 2 diabetes cell
This is a normal cell. Insulin is present and In type 1 diabetes, insulin is not produced; In type 2 diabetes, insulin is present, but
is taken into the cell to facilitate proper so, there is nothing to signal the cells to the signal for proper glucose uptake and
glucose uptake and metabolism. taken in glucose and metabolize it. metabolism is lost. The problem could be in
the insulin itself or in any one of the proteins
involved in glucose uptake and metabolism.
Insulin Insulin receptor Glucose Colsed glucose transporter Open glucose transporter Altered insulin receptor
Figura 3. Representación gráfica de la diabetes tipo 1 y tipo 2 comparado con una célula normal. Tomado de
LITWACK Gerald. Human Biochemistry and Disease. Ed. Elsevier Inc. 2008, pág. 134.
Consulta previa
1. ¿En qué consiste y que permite identificar la prueba de Benedict? Esquematice la

reacción que se lleva a cabo y los intermediarios que se forman.
2. ¿Cuál es el fundamento químico de una cromatografía en papel? Identifique fase
móvil y estacionaria de la práctica que usted va a realizar.
3. Defina el término Razón de frente (Rf) y diga cómo se determina.
Reactivos
Patrón de Glucosa 1 %
Patrón de Sacarosa 1%
24
Patrón de Lactosa
Reactivo de Benedict
Papel filtro Wathman Nº 2

Butanol / Ácido acético / H2O d (1:1:1)
Ácido ftálico
Butanol
Anilina
Muestra de orina estudiante (orina control)
Muestra de orina paciente
Materiales
5 tubos de ensayo
Pipeta graduada de 1ml
Pipeta graduada de 5 ml
Gradilla
Pipeteador
Caja de petri
Algodón
Capilares
Procedimiento
Tabla 1. Poder Reductor de los Carbohidratos mediante la prueba de Benedict
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

H2O d 1 ml - - - - -
Glucosa 1% - 1 ml - - - -
Sacarosa 1% - - 1 ml - - -
Lactosa 1% - - 1 ml - -
Orina estudiante - - - - 1 ml -
Orina Paciente - - - - - 1 ml
Benedict 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Caliente los tubos en un baño de María que se encuentre en ebullición durante 10 min
y registre los resultados obtenidos, recuerde que un precipitado café, rojizo o amarillo
le indica que la prueba es positiva.
25
Separación e Identificación de Carbohidratos en una Muestra de Orina de
un Paciente Mediante Cromatografía en Papel

Ubique el papel filtro sobre una hoja cuadriculada, determine el centro de la circun-
ferencia y señálelo con un lápiz. A partir de este punto, mida 2 cm hacia el exterior
y dibuje cuatro puntos ubicados simétricamente el uno del otro, estos puntos son los
sitios donde se llevará a cabo la aplicación de los patrones (Glucosa y Lactosa) y las
muestras (Orina control y orina del paciente) (Figura 4).
Glc
Centro del papel filtro
2cm
Lac Op Sitios de siembra
Oe
Figura 4. Esquema del papel filtro que se utilizará en la cromatografía para la separación de carbohidratos.
Una vez tenga listo el papel filtro y los capilares, proceda a aplicar cada uno de los
patrones y las muestras. Aplique una gota y deje secar, repita la aplicación 2 veces más.
Perfore el papel filtro en el centro e introduzca un trozo de algodón que le sirva para
hacer un canal entre la fase móvil y la fase estacionaria para que el solvente suba por
capilaridad a través del algodón.
Ubique el papel filtro y el algodón en la caja de petri, la cual tiene la fase móvil y ha
sido previamente saturada durante 1 hora a temperatura ambiente, deje eluir hasta que
el solvente llegue al extremo del papel y marque con un lápiz hasta donde corrió el
solvente. Deje secar y sumerja el papel en el revelador formado por una solución de
ácido ftálico con anilina, retire, seque y exponga al calor. Con un lápiz marque cada
una de las manchas que aparezcan después de revelar y determine el Rf.
Resultados
Nombre del paciente al cual se le analizó la muestra de orina:
Tabla 1. Resultados de la prueba de Benedict

26
Tubo Positivo / Negativo Color
H 2O
Glucosa
Sacarosa
Orina Estudiante
Orina Paciente
Tabla 2. Rf obtenidos para los patrones y muestras analizados

por cromatografía en papel
Patrón/muestras Rf Color
Glucosa
Lactosa
Orina Estudiante
Orina Paciente
Discusión de resultados
1. Discuta cual es el fundamento de la reacción de Benedict y diga porqué se deter-
mina que un azúcar es reductor o no, químicamente.
2. Explique el fundamento químico de la cromatografía en papel.
3. Exponga las características químicas de los carbohidratos que le permitieron correr
y ser separados en la fase estacionaria.
4. Una vez definido el azúcar excretado en la orina del paciente mediante los Rf de
los patrones, sugiera cuales podrían ser las razones por las cuales se esté excretando
este azúcar.
Bibliografía
MURRAY R. Harper´s Illustrated Biochemistry. Ed. McGraw-Hill Companies, Inc. ed.
26th. 2003, pág. 102 – 110.
LEHNINGER D. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 238 – 288.
MATHEUS C. K. VAN HOLDE KE y AHERN KG. Biochemistry. Ed Addison- Wesley.
ed.3ª. 2003.
MALLIKARJUNA R. Medical Bichemistry. Ed. New Age International (P) Limited, Pu-
blishers. ed. 2da. 2006, pág. 82 – 95.
LITWACK G. Human Biochemistry and Disease. Ed. Elsevier Inc. 2008, pág. 132 - 188
BISHOP, ML., FODY, EP., SCHOEFF, LE. Química Clínica. Principios, Procedimientos y
Correlaciones. Quinta edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2007.
HENRY J. El Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marban libros. Edición en español.
2007
27 BAYNES, JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Medica. Segunda edición. Elsevier
Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil P. eds. Harper.
Bioquímica ilustrada, 29a edición New York, NY: McGraw-Hill; 2013.
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https://www-medicapanamericana-com.ezproxy.unbosque.edu.co/digital/ebooks/buscador
http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp03/0302002.html
http://www.attano.com/video/7196-Classification-of-carbohydrates
http://chem-ilp.net/labtecnichiques/TLCAanimation.htm http://
chem-ilp.net/labtecnichiques/TLCAvideo.htm
28
FORMATO DE RESULTADOS IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN UNA
MUESTRA DE ORINA
Resultados
Identificación y caracterización de carbohidratos en una muestra de orina.
Tabla 1. Resultados obtenidos en la prueba de Benedict para los carbohidratos patrón, muestra de orina estudiante
y muestra de orina paciente
TUBO Positivo / Negativo Color Reductor

29 H 2O
Glucosa
Sacarosa
Lactosa
Orina Estudiante
Orina Paciente
Esquematice con estructuras la reacción entre glucosa y el reactivo de Benedict:
Tabla 2. Rf de los carbohidratos patrón y de las muestras de orina estudiante y paciente:
Patrón /muestras Rf
H 2O
Glucosa
Lactosa
Orina Estudiante
Orina Paciente
Cálculos para la determinación del Rf de los patrones y las muestras:
El azúcar presente en la muestra de orina del paciente es __________________________.

Discusión de Resultados:
Para realizar sus análisis de resultados tenga en cuenta los siguientes conceptos, los
cuales deben relacionados en la discusión:
1. Carácter Reductor de los carbohidratos
2. Características de separación de los carbohidratos en la cromatografía en papel.
3. Posibles causas de excreción de glucosa en orina, tenga en cuenta los valores de
referencia para glucosa en orina y plasmática pre-prandial y post prandial.
Consulta:
1. ¿Cuáles son las causas de excreción de otros azúcares como galactosa y
fructosa en la orina?
2. Consulte la técnica que actualmente se está empleando en los laboratorios clínicos
para determinar la concentración de glucosa en sangre y en orina.
30 3. ¿Cuáles son las concentraciones normales de glucosa normales en el torrente

sanguíneo?
Práctica No. 3
Identificación y caracterización de lípidos en una muestra de suero
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Identificar las propiedades químicas de los lípidos
» Diferenciar estructuralmente un lípido anfipático de un lípido apolar
» Determinar la presencia de lípidos en una muestra de suero de un paciente
» Establecer las posibles causas del incremento de los niveles lípidos en suero del
paciente.
31 Introducción
Propiedades Químicas de los lípidos
Al igual que las proteínas y carbohidratos, los lípidos son componentes de todos los
organismos vivos; sin embargo, no son tan diversos estructuralmente. Estas moléculas
son comúnmente definidas como sustancias orgánicas insolubles en agua pero alta-
mente solubles en compuestos orgánicos no polares. Los lípidos se caracterizan por
ser moléculas hidrofóbicas (apolares) o anfipáticas (contienen una región polar y una
no polar). En la figura 1 se muestra una clasificación y la relación entre los lípidos de
importancia biológica.
Lípidos
Ácidos Grasos Esteroides Vitaminas Terpenos

Liposolubles
Isoprenoides
Eicosanoides Triacilgliceroles Ceras Esfingolípidos
Glicerofosfolípidos Ceramidas
Plasmalógenos Fosfatidatos Esfingomielinas Cerebrósidos
Gangliósidos
Fosfatidiletano- Fosfatidilcolina Otros fosfolípidos Otros

lamina glucoesfingolípidos
Fosfatidilserina Fosfatidilinositol
Fosfolípidos Glucoesfingolípidos
Figura 1. Clasificación general y relación estructural de los lípidos. Tomado de Robert Horton, Laurence A.
Moran, K. Gray Scrimgeour, Marc D. Perry y David Rawn. Principles of Biochemistry, 4 th ed, Pearson Prentice
Hall, 2006, pág. 254.
Los ácidos grasos son los lípidos más simples, tiene la fórmula general R-COOH, en donde
R representa una cadena hidrocarbonada. Estos lípidos se diferencian uno de otro por la
longitud de la cadena, presencia y ubicación de dobles enlaces y el número de ramifi-
caciones. Los ácidos grasos que no presentan ningún doble enlace se denominan ácidos
grasos saturados y los que presentan al menos un solo doble enlace se clasifican como
insaturados (monoinsaturados o poliinsaturados). Generalmente, el doble enlace tiene una
configuración cis que le confiere propiedades físicas, químicas y biológicas importantes.
Otra clasificación lipídica de vital importancia son los triglicéridos, moléculas neutras
formados por glicerol esterificado con tres ácidos grasos. Sin embargo, los grupos hidro-
xilo del glicerol pueden estar esterificados solo con un ácido graso (monoacilglicerol) o
con dos ácidos grasos (diacilglicerol).
Los glicerofosfolípidos, al igual que los triglicéridos, tienen un esqueleto de glicerol
esterificado con dos ácidos grasos en el C1 y C2 del glicerol, pero presenta un grupo
fosfato en el C3, el cual puede interaccionar con diversas moléculas como la colina,
serina, etanolamina, entre otras. Estas moléculas convierten a estos lípidos en los menos
apolares (Tabla 1). [1 - 3]
O
X = Cabeza polar
(R1) C O 1
CH2
(R2) C O CH O
32 2
O 3
CH2 O P O X
-
O
Precursor de X Nombre del glicerofosfolípido

Fórmulas de - O - X
(HO X) resultante
Agua O H Ácido fosfatídico

+
Colina O CH2CH2N(CH3)3 Fosfatidilcolina (Lecitina)
+
Etanolamina O CH2CH2NH3 Fosfatidiletanolamina

+
NH3
Serina O CH2 CH Fosfatidilserina
-
COO
Glicerol O CH2CH CH2OH Fosfatidilglicerol
OH O
O CH2OCR3
O R4COCH
Fosfatidilglicerol O CH2CH CH2 O P O CH2 Difosfatidilglicerol
(Cardiolipina)
-
OH O
H OH
6 5
O H
myo - inositol OH H Fosfatidilinositol
1 4
OH HO
H OH
2 3
H H
Tabla 1. Estructura de los glicerofosfolípidos más comunes. Tomado de Robert Horton, Laurence A. Moran, K. Gray
Scrimgeour, Marc D. Perry y David Rawn. Principles of Biochemistry, 4 th ed, Pearson Prentice Hall, 2006, pág. 260.
Los esfingolípidos están formados por un esqueleto de esfingosina, un alcohol rami-

ficado con un doble enlace trans entre los C4 y C5, un grupo amino en el C2 y un
grupo hidroxilo en los C1 y C3. La interacción de un ácido graso con el grupo amino
del C2 de la esfingosina permite la formación de la ceramida. A partir de la ceramida
se derivan los esfingolípidos, entre ellos: cerebrósidos y gangliósidos que contienen
residuos de carbohidratos y son clasificados como glucoesfingolípidos.
Por último, se encuentran los esteroides, vitaminas lipídicas y terpenos, los cuales han
sido clasificados como isoprenoides puesto que sus estructuras están relacionadas con
moléculas isoprenoides de cinco carbonos. En general, los esteroides contienen cuatro
anillos fusionados, tres anillos de 6 carbonos (A, B y C) y un anillo de 5 carbonos (D).
El colesterol es un importante lípido de este grupo, presenta un grupo –OH en el anillo
A de su estructura, esta característica lo convierte en un lípido anfipático (Figura 2); sin
embargo, la esterificación de este grupo funcional con un ácido graso lo convierte en
una molécula altamente hidrofóbica, conocida como éster de colesterol. [1 - 3]
12
11 17
1 9 H 13 14 16
2 15
10 H 8
H
3 5 7
HO
4 6
33 Figura 2. Estructura química del colesterol. Tomado de LEHNINGER David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega.
Ed. 4th. 2004, pág. 255.
Importancia Biológica y Médica de los Lípidos

Los lípidos son importantes constituyentes de la dieta, no solo por su alto valor energético
sino por el contenido de ciertas moléculas esenciales en el cuerpo, como las vitaminas
liposolubles y los ácidos grasos omega 3 y 6. En el cuerpo, los lípidos son principalmente
almacenados en el tejido adiposo, donde sirven como aislantes térmicos en el tejido
subcutáneo y alrededor de ciertos órganos. Los lípidos no polares actúan como aislantes
eléctricos que permiten la propagación rápida de las ondas despolarizantes a lo largo de
los nervios mielinizados. Adicionalmente, los lípidos y proteínas son constituyentes de la
célula que se localizan principalmente en la membrana celular y mitocondrial. Además,
formando parte de las lipoproteínas ayudan al transporte de lípidos procedentes de la
dieta y a los provenientes de síntesis endógena en el torrente sanguíneo.
Exógeno Endógeno
Lípidos de la dieta Ácidos biliares LDL
y colesterol
Receptores de LDL
Colesterol
endógeno
Intestino Colesterol de Receptores Tejido extrahepático
la dieta l de LDL
Receptor de
remanentesr
Quilomicrones Remanentes de VLDL IDL HDL

quilomicrón
Capilares Capilares
Lipoproteína lipasa Lipoproteína lipasa
Ácidos grasos libres
Ácidos grasos libres
Tejido adiposo y muscular
Tejido adiposo y muscular
Figura 3. Transporte de lípidos a través del torrente sanguíneo y lipoproteínas involucradas. Tomado de Robert
Horton, Laurence A. Moran, K. Gray Scrimgeour, Marc D. Perry y David Rawn. Principles of Biochemistry, 4 th ed,
Pearson Prentice Hall, 2006, pág. 204.
Los ácidos grasos constituyen una de las más importantes fuentes de energía para
ciertos órganos, como el hígado, músculo esquelético, cardíaco y hacen parte de los
triglicéridos, los cuales son almacenados en el tejido adiposo en vacuolas específicas
en el citoplasma celular. Además de los ácidos grasos que son ingeridos en la dieta,
también son sintetizados endógenamente y son transportados por el torrente sanguíneo
en forma de triglicéridos, por medio de las lipoproteínas (Figura 3).
Los fosfolípidos y esfingolípidos se localizan principalmente en la membrana celular,
en el tejido nervioso, y la proporción de cada uno de ellos depende del tipo de
tejido. Adicionalmente, dependiendo del radical que los diferencie entre ellos,
inducen diferentes respuestas celulares, por ejemplo algunos de estos lípidos son
inmunomoduladores, mitogénicos, anti-microbianos, entre otros. Otro importante
lípido es el colesterol, que hace parte de los esteroles y es un componente estruc-
tural de la membrana lipídica, principalmente de mamíferos. Además, es el precursor
de las hormonas esteroideas (progesterona, estrógenos y testosteronas), sales biliares
y la vitamina D. El colesterol es ingerido en la dieta y es sintetizado endógenamente
por casi todas las células pero en mayor medida en el hígado. Para ser transportado
34 por el torrente sanguíneo y almacenado debe convertirse en un éster de colesterol.
Cuando se elevan sus niveles en sangre se acumula en las paredes de los vasos
sanguíneos formando placas, las cuales han sido relacionadas con enfermedades
cardiovasculares que aumentan la probabilidad de sufrir de un ataque cardiaco.

La comprensión de la bioquímica de los lípidos es necesaria para el entendimiento de
importantes áreas biomédicas, por ejemplo: obesidad, diabetes mellitus, arteriosclerosis
y el papel de varios ácidos grasos poliinsaturados en la nutrición y la salud. [4 - 6]
Preapración Previa
1. Dibuje la estructura de los lípidos que se analizarán en el laboratorio y clasifique-
los según su naturaleza química en polares, anfipáticos y apolares.
3. Describa el fundamento de la cromatografía en capa fina.
4. ¿Qué es la silicagel?
Reactivos
Estándar de lípidos: Colesterol, Oleato de colesterol, Trioleina, Mezcla de fosfolípidos
(fosfatidilinositol (PI), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), lisofosfatidilcolina)
Diclorometano
Metanol
Yodo sublimado
Materiales
» Placas de silicagel 10 x 20
» Capilares
» Mechero
» Cámaras de cromatografía
» Cámara de revelado
» 5 tubos de 1.5 ml
» Gradilla para tubos de 1.5 ml
Procedimiento
Antes de iniciar la aplicación de los patrones y las muestras es necesario:
Utilizar guantes, cualquier contacto de sus manos con la placa se evidenciará en el

revelado.
Preparación de la muestra de suero

Usted recibirá una muestra de suero que ha sido previamente tratada de la siguiente
manera:
1. Se toman 5 ml de una muestra de sangre, se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min

y se separa la fase de color amarillo que corresponde al suero sanguíneo.
2. 1 ml del suero se mezcla con una mezcla de 1ml de cloroformo y 0.5 ml de metanol
3. La mezcla anterior se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min y se separa la fase
35 orgánica, la cual será empleada en la siembra para la identificación de lípidos pre-
sentes en la muestra.
Preparación de las placas de silicagel

1. Usted recibirá una placa donde se encuentran marcados los sitios de aplica-
ción, para cada uno de los patrones (OC, T, C y F) y para la muestra de suero del
paciente(S). (Figura 5).
1 cm
2,5 cm 1 cm
OC T C F S
Figura 5. Representación gráfica de la placa de silicagel con las líneas de siembra
2. Caliente las placas a 100 ºC durante 30 seg con el objeto de deshidratarlas y evitar
que cambie la polaridad de las mismas durante el corrido cromatográfico por la
presencia de moléculas de H2O. Esta parte será realizada por los docentes.
3. Aplique sobre la línea una gota de cada una de las muestras en el siguiente orden:
Oleato de colesterol, Trioleina, Colesterol, Mezcla de fosfolípidos y muestra de suero
del paciente. Recuerde que los capilares y las siembras no deben ser mezclados, de
lo contrario se obtendrán resultados erróneos.
4. Introduzca la placa en la cámara de cromatografía que previamente han sido satu-
rada con la fase móvil y tape inmediatamente.
Para efectos de separar cada uno de los lípidos aplicados, se empleará la fase móvil:
Diclorometano / Metanol / H2O d (90:34:2)
5. Una vez finalizada la elución del disolvente sobre la placa de silicagel, saque la
placa, marque con un lápiz el frente del Disolvente y espere a que seque a temperatura
ambiente.
6. Introduzca la placa en la cámara de revelado, la cual ha sido previamente saturada
con I2 y espere a que las bandas se visualicen.
7. Marque con lápiz cada una de la bandas y determine el Rf para los patrones y los
lípidos encontrados en la muestra de suero.
Resultados
Nombre del paciente al cual se le analizó la muestra de suero:
Tabla 1. Rf obtenidos para los patrones y muestra analizada.
Patrón/muestras Rf
Oleato de colesterol
Trioleina
Colesterol
36
Mezcla de fosfolípidos
Suero del paciente
1. Sustente claramente el corrido de cada uno de los lípidos utilizados como estándar
en la práctica de laboratorio, para esto es necesario tener en cuenta la estructura
química de cada uno y el fundamento de la cromatografía en capa fina.
2. Defina porqué el I2 permite la tinción de los lípidos
3. Una vez determinado el Rf de los patrones y de las bandas encontradas en el
suero sanguíneo del paciente, determine cuales lípidos se encontraron presentes
en la muestra.
Consulta
1. Describa brevemente por medio de una gráfica el transporte de los lípidos a través
del torrente sanguíneo.
2. Realice una tabla en donde diferencie cada una de las lipoproteínas involucradas
en el transporte de lípidos en el torrente sanguíneo, incluya densidad, composición
lipídica y proteica.
3. Sustente lo que sucede al organismo cuando se evidencia el incremento en la
concentración de quilomicrones y LDL en el torrente sanguíneo, incluya las posi-
bles causas.
4. Describa el método que actualmente se emplea en el laboratorio para la cuantifi-
cación de triglicéridos y colesterol en una muestra de suero.
Bibliografía
MURRAY R. Harper´s Illustrated Biochemistry. Ed. McGraw-Hill Companies, Inc. ed.
26th. 2003, pág. 111 – 121.
LEHNINGER D. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 343 – 366.
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2003.
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LITWACK G. Human Biochemistry and Disease. Ed. Elsevier Inc. 2008, pág. 189 - 238.
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BAYNES,JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Medica. Segunda edición. Elsevier Mosby.
Madrid, España. 2006.
37
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http://accessmedicina.mhmedical.com.ezproxy.unbosque.edu.co/content.aspx?booki
d=1441&sectionid=100481432. Accessed julio 26, 2018..
38
FORMATO DE RESULTADOS IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS EN UNA MUESTRA
DE SUERO
Resultados
Identificación y caracterización de lípidos en una muestra de suero
Dibuje los resultados obtenidos en la cromatografía después de revelar con el
reactivo de I2 sublimado:
39
Tabla 1. Rf de los lípidos patrón y los obtenidos en la muestra de suero del paciente:
Patrón/muestras Rf
Oleato de colesterol
Trioleina
Colesterol
Mezcla de fosfolípidos
Suero del paciente
Los posibles lípidos presentes en la muestra de suero del paciente

fueron: , ,
Esquematice con estructuras la reacción de entre el I2 sublimado y un ácido graso
monoinsaturado:
Sustente el corrido de cada uno de los lípidos utilizados como patrones, para esto tenga
en cuenta la estructura química de cada uno y el fundamento de la cromatografia en
capa fina.
a. Oleato de colesterol
40
b. Trioleina
c. Colesterol
d. Fosfolípidos
Consulta:
1. Explique brevemente el transporte de triacilgliceroles y éster de colesterol desde la
ingesta (vía exógena) hasta el hígado y desde el hígado a los tejidos periféricos (vía
endógena):
41
2. Sustente lo que sucede al organismo cuando se evidencia un incremento de quilomi-

crones o LDL en el torrente sanguíneo, incluya las posibles causas.
Qulimocrones:
LDL:
42
Práctica No. 4
Identificación de las propiedades químicas y biológicas de las proteínas
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Reconocer la presencia de aminoácidos y proteínas en una solución mediante
pruebas de coloración
» Realizar una cromatografía en capa fina para separar diferentes clases de aminoá-
cidos.
» Identificar los aminoácidos presentes en una muestra de suero.
43 » Determinar el comportamiento de las proteínas cuando son expuestas a condicio-
nes extremas de pH
» Determinar el comportamiento de las proteínas cuando son expuestas a diferentes
concentraciones de sal.
» Reconocer la importancia biológica de las proteínas como agentes catalizadores y
estructurales de la célula.
Introducción
Propiedades químicas de las proteínas
Las proteínas son polímeros de gran tamaño constituidos por monómeros, conocidos
como aminoácidos que tienen la estructura común que se muestra en la figura 1, y se dife-
rencia por el radical que se encuentra unido al carbono α de la estructura base. El radical
(R) es quien determina las características químicas del aminoácido y su comportamiento
en ambientes hidrofóbicos e hidrofílicos. Del número de radicales se derivan 20 aminoá-
cidos comunes que hacen parte de la composición estructural de una proteína.
Formas L y D de los aminoácidos
R R
H OH HO H
N C C C C N
H O O H
H H
Carbono asimétrico
Figura 1. Estructura general de un aminoácido. Tomado de LITWACK Gerald. Human Biochemistry and Disease.
Ed Elsevier Inc. 2008, pág. 45.
Los humanos pueden sintetizar 12 de los 20 aminoácidos comunes a partir de interme-

diarios de procesos metabólicos que ocurren en la célula, conocidos como glucólisis
(oxidación de la glucosa) y ciclo de Krebs, por lo tanto lo aminoácidos restantes deben
ser ingeridos en la dieta.
Enlace peptídico
Aminoácido Aminoácido
HR HR
H N C C OH H N C C OH
HO HO
H2 O
Cadena polipeptídica
H R HR
H N C C N C C OH
H O H O
Figura 2. Formación de un enlace peptídico. Tomado de LITWACK Gerald. Human Biochemistry and Disease. Ed.
Elsevier Inc. 2008, pág. 54.
44
Las proteínas son el resultado de la interacción covalente del grupo carboxilo (-COOH)
de un aminoácido con el grupo amino (-NH3) de otro aminoácido, permitiendo la
formación de un enlace peptídico que se representa en la figura 2.

La organización estructural de una proteína se clasifica en cuatro niveles
dependiendo del grado de complejidad de las interacciones covalentes y débiles
que pueda establecer: estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La
estructura primaria hace referencia a la secuencia de aminoácidos que constituyen la
proteína e incluyen los puentes disulfuro que se pueden formar en la misma secuencia;
la secundaria, determina el plegado local de ciertas regiones polipeptídicas de la
proteína, entre ellas: hoja plegada β y hélice α; la terciaria, que corresponde al
plegado global de la cadena, depende de la secuencia de aminoácidos que
constituyan la proteína debido a que estos establecen interacciones débiles (puentes
de hidrógeno, fuerzas de Van der walls, electrostáticas e hidrofóbicas) que determinan
la estructura tridimensional y la cuaternaria hace referencia a las interacciones que
se establecen entre diferentes cadenas polipeptídicas (ver Figura 3 en la siguiente
página).
Por otra parte, las proteínas son susceptibles a cambios drásticos en el ambiente en
el cual se encuentre, entre ellos: 1) La concentración de hidrogeniones (pH), puesto
que a medida que se incrementa o disminuye la concentración de hidrogeniones en el
medio, la carga de los radicales de los aminoácidos polares cambia y por tanto ciertas
interacciones débiles pueden aparecer o desaparecer, de tal manera que la estructura
de la proteína puede cambiar y afectar negativamente la función biológica de la misma;
2) La concentración de sal, puesto que las sales producen un incremento de iones en
la solución incrementando la cantidad de puentes salinos entre la proteína y los iones,
lo que puede aumentar la solubilidad de la proteína en medio acuoso; sin embargo,
una elevada concentración de sal puede inducir la precipitación de la proteína. [1 - 3]
Importancia Biomédica de las Proteínas

Las proteínas están presentes en todas las células de humanos, animales, plantas y
microorganismos. Estas macromoléculas constituyen el 50% del peso seco de una
célula. De forma general, las proteínas se clasifican de acuerdo a su función en globu-
lares (con actividad catalítica o enzimática) y fibrosas (con función estructural). En la
siguiente lista se nombran algunas de las funciones específicas que tienen las proteínas:
HO O
Estructura
C Primaria
Estructura H H
Primaria
N
Estructura
Secundaria
H O H O H
C N C N C N
C C N C C N C C
H
C C CC
N
O H O H O C
H HO
45 H O H O H N C
N C C
C C C O
N C N C N HO
C C C C H
C C N C N C N CC
N
O
C
O H O H O
H HO
NC
NC C
O
C
Lamina plegada β HO
H
alfa hélice C N C
CN
O
O
Estructur
Estructura
a
terciaria
tericaria
Estructura
Cuaternaria
Figura 3. Niveles de organización estructural de una proteína. Tomado de http://academic.brooklyn.cuny.edu/

biology/bio4fv/page/prot_struct-4143.JPG
Están involucradas en el transporte de sustancias en el cuerpo, por ejemplo: La hemog-

lobina es la encargada de transportar oxígeno y la albúmina transporta ácidos grasos en
el torrente sanguíneo.
Las enzimas son proteínas encargadas de catalizar reacciones químicas en la célula,
por ejemplo: α - amilasa encargada de romper los enlaces glucosídicos  14 del
almidón en el proceso de digestión.
Actúan en la defensa del cuerpo en contra de agentes foráneos, por ejemplo: las
inmunoglobulinas.
Envían señales específicas a determinadas células, por ejemplo: la hormona insulina.
Tienen un papel fundamental en la contracción muscular.
Controlan la expresión de genes y la traducción de proteínas, por ejemplo: las histonas.
Pueden actuar como sistemas amortiguadores, por ejemplo: las proteínas plasmáticas.
Proporcionan fuerza y elasticidad a los órganos y al sistema vascular, por ejemplo: el
colágeno y la elastina de la matriz ósea y ligamentos.
Algunas proteínas son componentes estructurales de órganos y tejidos, por ejemplo:
la queratina presente en el cabello y la epidermis. [4 - 5]
Pueden ser fuente de energía en situaciones especiales como por ejemplo en la inanición.
Preparación previa
46 1. Defina enzima y proteína estructural.
2. Defina Punto Isoelétrico (pI).
3. Describa la reacción que sucede cuando un aminoácido o proteína reacciona con

el reactivo de Biuret, Ninhidrina y Xantoproteíca.
Reactivos
Ovalbúmina 0.1 %
Biuret
Ácido Nítrico (HNO3) concentrado
Ácido Sulfúrico (H2SO4) concentrado
Ácido Clorhídrico Fumante (HCl)
Ácido Acético Glacial (CH3COOH)
Hidróxido de Sodio (NaOH) 10%
Sulfato de Amonio sólido ((NH4)2SO4)
Solución saturada de Sulfato de Amonio
Fase móvil para la cromatografía de aminoácidos: Butanol (35%), Acetona (35%),
Ácido acético (7%), Agua (23%)
Revelador: solución de ninhidrina (3ml) al 7,5% en 50 ml de una mezcla 1:1 de
butanol-acetona.
Fase estacionaria: celulosa
Patrones de aminoácidos (Cisteína, Fenilalanina-Glutamato, Glicina, Tirosina-Lisina,
Leucina, Alanina, Hisitidina, Asparagina, Prolina.)
Materiales
» 12 tubos de ensayo
» Gradilla
» Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 ml
» Probetón
» Espátula
» Baño de María
Procedimiento
Reacciones de identificación de proteínas y aminoácidos
1. Prueba de Biuret
En un tubo de ensayo agregue 2 ml de la proteína Ovalbúmina al 0.1 % y adicione 2 ml
del reactivo de Biuret, mezcle y evidencie el cambio de color. Haga lo mismo en otro
tubo pero reemplace la ovoalbumina por H2O destilada.
2. Cromatografía de aminoácidos
47
Activar la placa por deshidratación en horno de calentamiento a 80 ºC durante 1
minuto. Siembre una gota de los patrones de aminoácidos sobre la línea de aplicación
de la placa cromatográfica. Identifique los patrones aplicados de la siguiente manera:
Cisteína: C, Fenilalanina-Glutamato: F-E, Glicina: G, Tirosina-Lisina: Y-K, Leucina: L,

Alanina: A, Hisitidina: H, Asparagina: N, Prolina: P, Suero del paciente: S.
Recuerde mezclar muy bien los tubos con los patrones y el suero, antes de realizar la siembra
Para el corrido cromatográfico coloque las placas en la cámara, ciérrela y espere 50
minutos hasta que la fase móvil haya alcanzado la línea de frente del solvente. Saque la
placa y revélela con ninhidrina, déjela secar a 80°C hasta que aparezcan las muestras.
Determine los Rf para cada uno de los patrones de aminoácidos y compárelos con las
manchas reveladas en la muestra de suero.
Comportamiento de las proteínas al ser sometidas a condiciones drásticas

de pH
Tabla 1. Efecto del pH sobre las proteínas
H2SO4 HCl HNO3 CH3COOH NaOH Ovalbúmina

Tubo 1 1 ml - - - - 2 ml
Tubo 2 - 1 ml - - - 2 ml
Tubo 3 - - 1 ml - - 2 ml
Tubo 4 - - - 1 ml - 2 ml
Tubo 5 - - - - 1 ml 2 ml
Mezcle, deje reposar y registre los resultados obtenidos.
Efecto de la concentración de sal sobre las proteínas

En el probetón pipetee 4 ml de ovalbúmina al 0.1% y adicione 4ml de la solución satu-
rada de (NH4)2SO4, agite y agregue (NH4)2SO4 sólido hasta saturar la mezcla. Deje en
reposo y registre los resultados obtenidos.
Resultados
Tabla 2. Resultados de los Rf de los patrones de aminoácidos y de la muestra de suero.
MUESTRA Rf
CISTEINA
FENILALANINA-GLUTAMATO
GLICINA
TIROSINA-LISINA
LEUCINA
ALANINA
HISTIDINA
ASPARAGINA
PROLINA
SUERO
48
Tabla 3. Resultados de las prueba de identificación de proteínas y aminoácidos
PRUEBA POSITIVO / NEGATIVO COLOR CARACTERÍSTICO

H2O d Ovalbúmina 0.1 %
Biuret
Tabla 4. Resultados del efecto del pH sobre las proteínas
ÁCIDO O BASE RESULTADO

H2SO4
HCl
HNO3
CH3COOH
NaOH
Tabla 5. Resultados del efecto de la concentración de sal sobre las proteínas
Concentración de
RESULTADO
(NH4)2SO4
Sin saturar
Saturada
1. Sustente con base a la estructura de los aminoácidos separados en la cromatografía
su migración de acuerdo a su polaridad y al solvente empleado.
2. Determine los aminoácidos que encontró en la muestra de suero.
3. Describa con estructuras las reacciones que se llevan a cabo en las reacciones de
coloración de proteínas y aminoácidos. Discrimine cual le permite reconocer ami-
noácidos y cual proteínas.
4. Describa claramente el comportamiento de las proteínas en ácidos y bases fuertes.
Sustente su comportamiento, tenga en cuenta la estructura tridimensional de las
proteínas y la función biológica.
5. Sustente claramente los resultados obtenidos en el tratamiento de la Ovalbúmina con
diferentes concentraciones de sal.
Bibliografía
MURRAY R. Harper´s Illustrated Biochemistry. Ed. McGraw-Hill Companies, Inc. ed. 26th.
2003, pág. 14 – 59.
LEHNINGER D. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 75 - 153.
MATHEUS C. K. VAN HOLDE KE y AHERN KG. Biochemistry. Ed Addison- Wesley. ed.3ª.
2003.
blishers. ed. 2da. 2006, pág. 13 - 48.
49 LITWACK G. Human Biochemistry and Disease. Ed. Elsevier Inc. 2008, pág. 33 - 91.
HENRY J. El Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marban libros. Edición en español. 2007

BAYNES,JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Medica. Segunda edición. Elsevier Mosby.
Madrid, España.2006.
http://pharmaxchange.info/press/2012/11/thin-layer-chromatography-tlc-principle- with-
animation/
http://accessmedicina.mhmedical.com.ezproxy.unbosque.edu.co/content.aspx?booki
d=1441&sectionid=100481432. Accessed julio 26, 2018..
50
FORMATO DE RESULTADOS IDENTIFICACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS DE
LAS PROTEÍNAS
Resultados
Identificación de las Propiedades Químicas y Biológicas de las Proteínas
Tabla 1. Rf obtenidos para los patrones de aminoácidos y una muestra de suero de un paciente
Patrón/muestras Rf
Cisteína
51 Fenilalanina
Glicina
Glutamato
Lisina
Tirosina
Alanina
Prolina
Leucina
Histidina
Asparagina
Suero
Tabla 2. Resultados obtenidos para la identificación de proteínas mediante la prueba de Biuret
Positivo / Negativo Color

H2O d Ovalbúmina H2O d Ovalbúmina
Tabla 3. Resultados del efecto de pH sobre la solubilidad de las proteínas
Acido /Base Resultado

H2SO4
HCl
HNO3
CH3COOH
NaOH
Tabla 4. Resultados del efecto de la concentración de (NH4)2SO4 sobre la solubilidad de las proteínas
(NH4)2SO4 Resultado
Sin saturar
Saturada
1. Cromatografía de aminoácidos:
Dibuje la estructura de los 20 aminoácidos y clasifíquelos de acuerdo a sus propie-
dades de polaridad.
52
Aminoácidos Apolares
Aminoácidos Polares sin carga

Aminoácidos Polares con carga
Comprare y justifique la diferencia del corrido cromatográfico de las siguientes pare-

jas de aminoácidos:
a. Lisina (K) vs Fenialanina (F):
b. Aspartato (D) vs Leucina (L):

53
c. Fenialanina (F) vs Tirosina (Y):
d. Cisteína vs Cistina:
2. Pruebas de identificación de aminoácidos y proteínas mediante reacciones

de coloración.
Esquematice con estructuras las reacciones generales que permiten la identificación
de aminoácidos y proteínas:
a. Reacción de Ninhidrina
b. Reacción de Biuret
3. Efecto del pH sobre la solubilidad y estructura de las proteínas (Sustente los
resultados obtenidos teniendo en cuenta concentración de hidrogeniones en el me-
dio, fuerzas débiles que determinan la estructura de la una proteína y su punto
isoeléctrico).
4. Efecto de la concentración de sal sobre la solubilidad de una proteína (Tenga en

cuenta los conceptos de salting in y salting out)
54
Consulta
1. Describa el método que actualmente se emplea para la cuantificación de proteínas
totales en una muestra de suero.

55
Práctica No. 5
Enzimas Óxido - reducción. Succinato deshidrogenasa.
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Comprender el mecanismo de acción de una enzima de óxido – reducción.
» Identificar a diferentes moléculas orgánicas como efectores de la catálisis enzimática.
» Reconocer la función biológica de los diferentes inhibidores y el tipo de inhibición.
Introducción
56 Las reacciones de oxidación reducción llamadas también redox; son aquellas en
las que tiene lugar una transferencia de electrones desde una especie que actúa
como dador de electrones (el agente reductor) a otra especie que es aceptora
de electrones (el agente oxidante). También puede considerarse reacciones de
oxidación aquellas en las cuales ocurre la pérdida de átomos de hidrógeno o la
ganancia de oxígeno existiendo siempre, paralelamente, sus correspondientes
reacciones de reducción para formar el redox. Sin embargo, muchas oxidaciones
biológicas pueden tener lugar sin la participación de oxígeno molecular, por
ejemplo las reacciones de deshidrogenación, que son catalizadas por enzimas
como la succinato deshidrogenasa.
La succinato deshidrogenasa es una flavoenzima clasificada en el grupo de las
óxido–reductasas, la cual cataliza la conversión de succinato a fumarato, en un
proceso que involucra dos semi-reacciones, inicialmente el sustrato se oxida
mediante una transferencia de dos electrones que son aceptados por FAD (Flavin
dinuclotido de adenina) que actua como cofactor de la enzima y queda en estado
completamente reducido (FADH2), luego, el cofactor se regenera a su estado
oxidado transfiriendo estos equivalentes reductores directamente a la cadena
respiratoria.
La succinato deshidrogenasa es un enzima clasificada en el grupo de las oxido –
reductasas, la cual cataliza la conversión de succinato a fumarato y la producción de
FADH2.
Es la única enzima unida a la membrana interna mitocondrial que participa en el ciclo
de Krebs y hace parte de la cadena de transporte de electrones.
Aunque esta enzima es más pequeña y más simple que el complejo I, contiene
cinco grupos prostéticos de dos tipos y cuatro subunidades. Las subunidades D y C
son proteínas integrales de membrana, cada una con tres hélices
transmembranales. Estas contienen un grupo hemo b y un sitio de unión a la
ubiquinona, el aceptor final en la reacción catalizada por el complejo II.
Las subunidades A y B se extienden al interior de la matriz mitocondrial, estas
contienen tres centros de 2Fe - 2S, unidos al FAD y un sitio de unión al sustrato,
succinato.
La transferencia de electrones del sustrato al FAD, se realiza mediante los centros
de Fe – S (Figura 1).
57
Sitio de unión
del sustrato
Acetyl-CoA Citrato Isocitrato
α-cetoglurato
Oxaloacetato
FAD
Malato
Succinyl-CoA
Succinato
Fumarato
Ciclo de Krebs
Centros
Citoplasma Fe - S
B
NADH membrana
NAD+
biquinona Q 02
Q
QH2 H20
Hemo b QH2
QH2
Citocromo c
D
Periplasma Cardiolipina C
Figura 1. Representación gráfica de la estructura tridimensional de la succinato deshidrogenasa. Tomado de LEH-

NINGER David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 699.
Consulta previa
1. Mencione tres ejemplos de enzimas de óxido – reducción, incluya la reacción ca-
talizada e identifique las moléculas que actúan como sustrato, producto y coenzima.
2. Mencione las coenzimas que generalmente son empleadas por estas enzimas,
identifique de cual vitamina son procedentes y su estructura química.
3. Consulte los inhibidores de las enzimas que ejemplificó en el numeral 1 y señale
que tipo de inhibición realizan.
Materiales y métodos
Reactivos
1. Músculo cardiaco
2. Arena lavada
57 3. Buffer fosfatos 0.1 M pH 7.4

4. Malonato de sodio 1% en buffer fosfatos
5. Succinato de sodio 1% en buffer fosfatos

6. Azul de metileno 0.02%
7. HCl 6N
8. Aceite mineral
Materiales
» Pipeta graduada de 10 ml
» Baño de hielo
» Centrífuga
» 2 tubos de centrifuga
» 8 tubos de ensayo
» Beaker de 250 ml
» Mechero
» Pinzas para tubo de ensayo
» Gradilla
» Pipeteador
» Baño de María
Procedimiento
(Esta parte del procedimiento será realizada previamente por los docentes)
1. Lavar un trozo del tejido cardiaco (aproximadamente 5g) con agua destilada.
2. Cortar en trozos pequeños en un mortero, agregar arena y macerar el tejido.
3. Adicionar 5 ml de buffer fosfatos pH 7.4 y continuar macerando hasta obtener una
pasta fina.
4. Agregar 15 ml más de la solución buffer, pasar la mezcla a un beaker y colocarlos
en un baño de hielo durante 5 min agitando ocasionalmente.
5. Centrifugar la suspensión por 10 min a 3000 rpm y transferir el sobrenadante a un
tubo de ensayo en hielo.
Esta fracción soluble contiene la enzima succinato deshidrogenasa y una serie de molé-
culas adicionales, entre ellas: otras enzimas (por ejemplo: citocromo oxidasa y la cito-
cromo reductasa) y coenzimas, incluyendo el FAD. Por esta razón, se debe tener en
cuenta que la enzima no se encuentra pura, sino en un sistema enzimático.
Después de recibir el extracto enzimático, rotule siete tubos como lo indica la tabla y
agregue en su orden los siguientes reactivos:
Tabla 1. Determinación de las propiedades catalíticas de la succinato deshidrogenasa.
BS BE 1 2 3 4 5
Succinato de Sodio - 1 1 1 1 1 1
1% (ml)
Buffer Fosfatos 3 3 2 2 2 1.5 1
pH 7.4 (ml)
Azul de metileno 1 1 1 1 1 1 1
0.02% (ml)
58 Malonato de sodio - - - - - - 1
1% (ml)
BS : Blanco de sustrato - BE : Blanco de enzima
Preincubar los tubos a 37ºC durante 5 min y sin sacarlos del Baño de María adicionar
el extracto enzimático, así:
El extracto enzimático que le va a adicionar al tubo 1, debe ser previamente calentado
a la llama directamente durante 2 min con agitación constante.
El extracto enzimático que le va a adicionar al tubo 3, debe adicionarle previamente
0,5 ml de HCl 6N.
BS BE 1 2 3 4 5
Extracto enzimático 1 - 1 1 1 1.5 1
Una vez añadida la enzima, agitar los tubos y adicionar 1 ml de aceite mineral en cada
uno, para establecer condiciones relativamente anaeróbicas. Anotar el tiempo en que
inició la reacción de cada tubo e incubar durante 10 min a 37ºC. Registre los cambios
evidenciados a los 5 y 10 min.
Resultados
Tabla 2. Resultados registrados en cada tubo a los 5 y 10 min.
Tubo 5 min 10 min

BS
BE
1
2
3
4
5
1. Describa el método empleado para la visualización de la actividad de la
succinato deshidrogenasa, incluya las reacciones involucradas.
2. Compare los resultados de los tubos 1, 3 y 5 con los de los tubos 2 y 4.
3. Sustente los resultados obtenidos identificando el sustrato, el producto, la
coenzima y los inhibidores utilizados.
4. Describa y sustente los factores que afectan la actividad enzimática.
5. Discrimine que tipo de inhibición que se evidencia en la práctica.
Bibliografía
BISHOP, ML., FODY, EP., SCHOEFF, LE. Química Clínica. Principios, Procedimientos
y Correlaciones. Quinta edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2007.
59 2007
BAYNES,JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Médica. Segunda edición. Elsevier
MCKEE, Trudy. Bioquímica. La base molecular de la vida. McGraw Hill Interamerica-
na. Primera Edición. Madrid, España. 2003.
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/anima-
tion__how_enzymes_work.html
Dijkman W, De Gonzalo Gonzalo, Mattevi A, Fraaije MW. (2013). Flavoprotein oxidases:

Classification and applications 97, 5177-5188. doi:10.1007/s00253-013-4925-7
https://accessmedicina-mhmedical-
com.ezproxy.unbosque.edu.co/book.aspx?bookid=1441
https://www-medicapanamericana-
com.ezproxy.unbosque.edu.co/digital/ebooks/buscador
FORMATO DE RESULTADOS ENZIMAS OXIDATIVAS: SUCCINATO DESHIDROGENASA
Resultados
Enzimas oxidativas: succinato deshidrogenasa
Tabla 1. Resultados registrados para la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa en cada uno de los tubos.
Tubo 5 min 10 min

BS
60 BE
1
2
3
4
5
1. Esquematice con estructuras la reacción catalizada por la enzima succinato deshidro-
genasa e identifique sustrato, enzima, coenzima y producto.
2. Esquematice con estructuras el método utilizado para la identificación de la acti-

vidad de la succinato deshidrogenasa y sustente su función en el ensayo.
3. Describa y sustente cada uno de los factores que afectaron la actividad de la enzima
succinato deshidrogenasa.
Temperatura:
pH:
61
Malonato de sodio:
4. Esquematice con estructuras las reacciones catalizadas por tres diferentes enzimas
oxido – reductoras e identifique sustrato, enzima, coenzima y producto.
5. Esquematice la estructura de las siguientes moléculas: Monóxido de carbono, rote-

nona, ácido N-acetilsalicílico e Ibuprofeno. Identifique sobre que enzimas actúan y
que tipo de inhibidores son.
a. Monóxido de carbono
b. Rotenona
62
c. Ácido N-acetilsalicílico
d. Ibuprofeno
Consulta
1. De las enzimas que se clasifican como oxido – reductasas ¿Cuales tienen impor-
tancia clínica y por qué?
2. Dibuje la reacción catalizada por la succinato deshidrogenasa.
3. ¿Qué tipo de inhibidor es el malonato de sodio?
63
Práctica No. 6
Cinética enzimática de la asparto aminotransferasa
Autores:
Luz Yurany Moreno
Paula Mendoza
Claudia Bueno
Objetivos
» Comprender los principios generales de catálisis enzimática.
» Identificar el efecto de diversos factores como pH, concentración de sustrato, con-
centración de la enzima y temperatura sobre la actividad enzimática.
» Reconocer la importacia de las enzimas a nivel biológico.
Introducción
64 En las células se producen miles de reacciones químicas por segundo y cada una
está controlada por una enzima específica. Las enzimas son claves para entender los
procesos de los organismos vivos: la vida depende de la aceleración enzimática de
las reacciones puesto que pueden acelerar una reacción 100 millones de veces; sin
embargo, no inician la reacción sólo la activan y la aceleran. Las reacciones podrían
tener lugar sin ellas, pero serían extremadamente lentas.
La mayor parte de las reacciones químicas orgánicas necesitan aportes de energía,
energía de activación. Si no existieran las enzimas sería necesario elevar mucho la
temperatura, lo cual no soportaría el organismo. En la materia viva se producen reac-
ciones sin adición de calor por catálisis o aceleración de reacciones mediante cataliza-
dores. Se calcula que un aumento de 10 ºC en la temperatura aumentaría la velocidad
de una reacción 2 ó 3 veces, eso tiene mucha importancia para la vida: las plantas, por
ejemplo, no tienen control interno de la temperatura (poiquilotermos) y por tanto, la
actividad dependería de la temperatura externa y de esta manera cuando hiciera frío,
la actividad sería muy lenta. Las aves y mamíferos tienen reguladores internos (son
homeotermos) y la presencia de una enzima permite que se den reacciones sin elevar
mucho la temperatura.
Las enzimas son, por tanto, biocatalizadores muy potentes y eficaces, químicamente
son proteínas. Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recu-
peran indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfa-
vorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su
consecución. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas
polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio
activo, o lugar donde se adhiere el sustrato y donde se realiza la reacción. Una enzima
y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud.
Algunas enzimas no requieren de grupos adicionales para su actividad catalítica; sin
embargo, la gran mayoría de ellas requiere de un componente químico adicional, entre
ellos algunos iones inorgánicos, conocidos como cofactores, tales como: Fe2+, Mg2+,
Mn2+ o Zn2+; o moléculas orgánicas más complejas denominadas coenzimas, entre
ellas: tiamina, Biotina, NADH, FADH2, etc., generalmente procedente de vitaminas que
se ingieren en la dieta.
Por otra parte, las enzimas han sido clasificadas de acuerdo a la reacción que catalizan
en seis grupos, entre ellas encontramos:
1. Oxidoreductasas: Transferencia de electrones (Ión hidruro o protones)
2. Transferasas: Reacciones de transferencia de grupos funcionales
3. Hidrolasas: Rompimiento de enlaces por la adición de H2O
4. Liasas: Adición de grupos funcionales a dobles enlaces o formación de dobles
enlaces por remoción de grupos funcionales.
5. Isomerasas: Transferencia de grupos funcionales dentro de la misma molécula y
formación de isómeros.
6. Ligasas: Formación de enlaces C- C, C- S, C- O y C- N por reacciones de con-
densación unido al rompimiento del ATP.
Cinética enzimática
65 Una reacción enzimática puede ser descrita de la siguiente manera:
E+S ES EP E +P
En donde E, S y P representan la enzima, el sustrato y el producto, respectivamente;

ES, el complejo enzima – sustrato y EP, el complejo enzima – producto. Una reacción
no catalizada por una enzima requiere de una gran cantidad de energía (o energía de
transición) para que sea llevada a cabo, esta energía en un sistema biológico es descrita
por el término de energía libre de Gibbs, G, el cual define la espontaneidad y dirección
de una reacción. Cuando una reacción es catalizada enzimáticamente, la cantidad de
energía de transición requerida es mucho menor en comparación con una no catali-
zada como se puede evidenciar en la figura 1.
Estado de transición ( ) Estado de transición ( )
∆G
Energia libre G
∆G
Energia libre G
S P ∆G uncat
PS ∆G
cat
S ∆G 10 S
ES EP
Estado P P
basal Estado
basal
Reacción coordinada Reacción coordinada
Figura 1. Representación gráfica de la variación de la energía libre de Gibbs durante el progreso de una reacción
para convertir S en P. a) Sin catalizador enzimático y b) En presencia de un Catalizador enzimático. Tomado de
LEHNINGER David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 194.
Esta disminución en la energía de activación en una reacción catalizada enzimática-

mente se debe a la energía producida por la interacción del sustrato con el sitio activo
de la enzima mediante fuerzas débiles, denominada energía de unión, 6GB, durante
la formación de los complejos ES y EP de tal manera que aumenta la velocidad de
transformación sin afectar el equilibrio de la misma. La interacción del sustrato con el
sitio activo de la enzima debe ser por medio de interacciones débiles, puesto que una
Enzima complementaria al sustrato
Energia libre, G
Magnetos ∆G
uncat ∆G
cat
S ∆GM
P
ES ES
Figura 2. Representación gráfica de la interacción del sustrato con la enzima mediante enlaces fuertes. La energía
libre de Gibbs, G, del complejo enzima sustrato es menor respecto al producto lo que sugiere una mayor estabilidad.
Adicionalmente, la energía de transición se incrementa. Tomado de LEHNINGER David. Principles of Biochemistry.
Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 198. Modificada
interacción fuerte (covalente) no permitiría el progreso de la reacción, puesto que el

complejo ES sería energéticamente más estable que el producto (Ver figura 2).
66
Factores que afectan la actividad enzimática
1. Temperatura: Un incremento en la temperatura aumenta la velocidad de reaccio-

nes no catalizadas y catalizadas enzimáticamente por un incremento en la energía
cinética y la frecuencia de las colisiones de las moléculas reactantes. Sin embargo, la
energía calórica puede también incrementar la energía cinética de la enzima al pun-
to que excede la barrera energética que rompe los enlaces no covalentes que man-
tienen la estructura tridimensional de la enzima. La cadena polipeptídica se empieza
a desplegar o denaturar y rápidamente pierde su actividad catalítica. Las enzimas de
humanos generalmente son estables a temperaturas entre 45 – 55ºC. (Figura 3).
100
80
Actividad, %
60
40
20
0
20 40 60
Temperatura
Figura 3. Representación gráfica del comportamiento de una enzima a diferentes temperaturas. Tomado de http://
protein.bio.msu.su/biokhimiya/contents/v70/full/70030370.html
2. Concentración de Hidrogeniones: La velocidad de casi todas las reacciones ca-

talizadas por enzimas muestran una importante dependencia de la concentración
de hidrogeniones. Muchas enzimas intracelulares tienen un pH óptimo de actividad
que oscila generalmente entre 5 – 9. La relación de actividad y concentración de
hidrogeniones muestra un balance entre desnaturalización de la enzima a altos o
bajos pH y su efecto sobre la carga neta de la enzima, los sustratos o juntos. Para
enzimas cuyo mecanismo involucra catálisis ácido - base, los aminoácidos involucra-
dos deben tener la apropiada protonación para que la reacción suceda. La unión y el
reconocimiento de moléculas del sustrato con grupos disociables, también implica la
formación de puentes salinos con la enzima (Figura 4).
log Vo
6 8 10
pH
Figura 4. Representación gráfica del comportamiento de una enzima a diferentes pHs. Tomado de LEHNINGER
David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 212.
3. Efecto de la concentración de sustrato: Si se mantiene la concentración de la

enzima constante y se varía la concentración de sustrato se obtiene una curva hiper-
67 bólica como se muestra en la figura 5. Al principio un aumento de la concentración
de sustrato produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue
aumentando la concentración de sustrato, la velocidad de reacción comienza a dis-
minuir y a muy altas concentraciones de sustrato se observa que no cambia la velo-

cidad de reacción, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran satura-
dos. La velocidad de reacción que se obtiene a esa alta concentración de sustrato se
define como la velocidad máxima (V) de la reacción enzimática bajo las condiciones
especificadas. La concentración de sustrato (S), a la semivelocidad máxima de reac-
ción (V/2) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o
Km, la cual es una característica para cada enzima (Figura 5). La inversa de Km, o 1/
Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el sustrato. Mientras más
pequeño sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. Si
varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo sustrato, éste será transfor-
mado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
Vmax [S] Vo = Vmax

Vo =
Km
Vo (µM/min)
½ V max
Km
[S] (mM)
Figura 5. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción catalizada por la enzima.
Tomado de LEHNINGER David. Principles of Biochemistry. Ed. Omega. Ed. 4th. 2004, pág. 205.
Importancia biológica y clínica de las enzimas

Basados en la premisa de que cuando un tejido sufre un daño, es infectado o inflamado,
la membrana celular se hace más permeable, es destruido el contenido citoplasmático
y éste puede pasar al espacio extracelular y posteriormente al torrente sanguíneo. En
este sentido, para analizar una enzima específica basta con tomar una muestra de
sangre del paciente, separar el plasma sanguíneo y medir la actividad catalítica o alguna
otra característica de la enzima. Estos análisis han sido ampliamente usados, particular-
mente en el diagnóstico de daño cardiaco, hepático y muscular, y de esta manera seguir
el curso del daño del tejido y del posible tratamiento.
La medición de la actividad de determinadas enzimas se emplea como marcador de
daño de tejidos específicos, entre ellas: la aspartato amino transferasa y alanina amino-
transferasa, un incremento en su actividad sugiere daño a nivel cardiaco y hepático;
la Fosfatasa alcalina, es marcador de la función del tejido óseo e intestinal; la Crea-
tina cinasa, está asociada con el tejido cardiaco y muscular; la Lactato deshidrogenasa,
se relaciona con el tejido cardiaco, hepático, muscular y con los glóbulos rojos; la
α - amilasa, se relaciona con el páncreas; y la fosfatasa ácida, especialmente fosfatasa
resistente a tartrato, refleja funcionamiento de la próstata. Sin embargo, el análisis de la
actividad de estas enzimas no discriminan realmente el tejido que se encuentra afec-
tado y por tal razón se han diseñado estrategias metodológicas que permitan identificar
el daño específico y para esto se deben discriminar las diferentes isoformas de las
proteínas por medio de ensayos electroforéticos.
68
Fundamento del método que se empleará en la práctica
La aspartato aminotransferasa (AST o GOT) cataliza la transferencia del grupo amino

del aspartato al α-cetoglutarato, formando oxalacetato y glutamato (Figura 6). La
concentración catalítica se determina, empleando la reacción acoplada de la malato
deshidrogenasa (MDH), a partir de la velocidad de desaparición del NADH, medido
a 340 nm puesto que esta enzima reconoce el oxalacetato producido de la reacción
anterior y lo convierte en Malato con la consecuente desaparición del NADH+H+.
+ +
AST
glutamato oxalacetato aspartato α - cetoglutarato
ASAT
L -aspartato + α-cetoglutorato oxalacetato + L -glutamato
MDH
oxalacetato + NADH + H+ L - malato + NAD+
En esta técnica se mide la disminución del NADH + H+ como medida indirecta de la actividad de la AST
Figura 6. Reacción catalizada por la enzima aspartato aminotransferasa (AST). Tomado de http://themedicalbio-
chemistrypage.org/amino-acid-metabolism.html
Preparación previa
1. Defina el concepto de Km y Vmax
2. Consulte la función de otras enzimas diferentes a las mencionadas bajo el título
de importancia biológica y clínica de las enzimas.
Reactivos
1. Muestra de suero (enzima AST)
2. Kit para cuantificar AST/GOT Biosystem
Reactivo A: Tris 121 mmol/L, L-aspartato 362 mmol/L, malato deshidrogena-
sa (MDH). > 460 U/L, lactato deshidrogenasa > 660 U/L, hidróxido sódico 255
mmol/L, pH 7,8.
69 Reactivo B: NADH 1,3 mmol/L, 2-oxoglutarato 75 mmol/L, hidróxido sódico 148
mmol/L, sodio azida 9,5 g/L
Materiales
1. Micropipeta de 10 – 100 µl
2. Micropipeta de 100 – 1000 µl
3. Baño de María
Procedimiento
Efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima AST
1. Marque 3 tubos de ensayo de la siguiente manera: 0ºC, 37ºC y 90ºC.
2. Pipeteé en cada tubo 1 ml del reactivo de trabajo y precaliente a la temperatura
de reacción específica durante 10 min.
3. Después de la indicación del docente, saque uno de los tubos y adicione 100 jl
del suero.
4. Mezcle y transfiera el contenido a una celda. Inserte la celda en el espectrofotó-
metro y ponga un cronómetro en marcha.
5. Pasado 1 minuto, registre la absorbancia inicial y efectúe nuevas lecturas cada
minuto durante 3 minutos.
6. Realice el procedimiento anterior con los tubos restantes.
7. Calcule la disminución de la absorbancia por minuto promedio (6A/min).
Efecto del pH sobre la actividad de la enzima AST
1. Marque 3 tubos de ensayo de la siguiente manera: pH 3, pH 7.8 y pH 12
2. Pipeteé en cada tubo 1 ml del reactivo de trabajo a los diferentes pHs y precaliente
a 37ºC durante 10 min.
del suero.
7. Calcule la disminución por minuto promedio (6A/min).
Efecto de la variación en la concentración de enzima sobre la actividad
70 de la enzima AST
1. Marque 6 tubos de ensayo de la siguiente manera: 12.5, 25, 50, 75 y 100 jl.
2. Pipeteé en cada tubo 1 ml del reactivo de trabajo y precaliente a la temperatura
de reacción específica durante 10 min.

del suero con diferentes concentraciones de enzima.
7. Calcule la disminución de la absorbancia por minuto promedio (6A/min).
Cálculos
La actividad de la enzima AST/GOT en la muestra se calcula a partir de la siguiente
fórmula general:
Ecuación 1
Vt x 106
∆A/min x = U/L
x l x VS
El coeficiente de absorción molar (ε) del NADH a 340 nm es 6.300 L/mol cm el paso
de luz (l) es 1 cm, el volumen total de reacción (Vt) es 1,1 ml a 37ºC, el volumen de
muestra (Vs) es 0,1 ml a 37ºC.
Resultados
Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad de la AST
Tabla 1. Absorbancias registradas cada minuto después de la incubación de la enzima presente en el suero con
el sustrato
Temperatura: 0ºC
A1
A2
A3
Temperatura: 37ºC
A1
A2
A3
Temperatura: 90ºC
71
A1
A2
A3
Determine la Abs por cada minuto durante 3 minutos Determine el Δ Abs por cada
minuto, recuerde que la absorbancia que registró cada minuto debe ser menor puesto
que se está evaluando la disminución del NADH+H+
Tabla 2. Delta de las absorbancias registradas cada minuto para cada temperatura
Temperatura: 0ºC
A1-A2
A2-A3
Temperatura: 37ºC
A1-A2
A2-A3
Temperatura: 90ºC
A1-A2
A2-A3
Determine el promedio del ΔAbs por min a cada temperatura, para esto sume los
2 datos anteriores y divida el valor en 2.
Tabla 3. Promedio del deltas de las absorbancias registradas cada minuto para cada temperatura
Temperatura ºC A Abs / min

0
37
90
Utilice la fórmula de la ecuación 1, para calcular la actividad de la enzima,

determine la velocidad enzimática de la AST y grafique los resultados obtenidos.
Tabla 4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de AST
Temperatura ºC U/L
0
37
90
Efecto de la variación del pH sobre la actividad de la AST

el sustrato
pH 3
A1
A2
A3
72 pH 7.8
A1
A2
A3
pH 12
A1
A2
A3
Determine la Abs por cada minuto, recuerde que la absorbancia que registró cada
minuto debe ser menor puesto que se está evaluando la disminución del NADH+H+.
Tabla 2. Delta de las absorbancias registradas cada minuto para cada pH
pH 3
A1 - A2
A2 - A3
pH 7.8
A1 - A2
A2 - A3
pH 12
A1 - A2
A2 - A3
Tabla 3. Promedio del deltas de las absorbancias registradas cada minuto para cada pH
pH A Abs / min
3
7.8
12
Utilice la fórmula de la ecuación 1 para calcular la actividad de la enzima,

determine la velocidad enzimática de la AST y grafique los resultados obtenidos.
Tabla 4. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de AST
pH U/L
3
73 7.8
12
Efecto de la variación en la concentración de enzima de enzima sobre la

actividad de la AST
el sustrato
12,5 µl de enzima
A1
A2
A3
25 µl de enzima
A1
A2
A3
50 µl de enzima
A1
A2
A3
75 µl de enzima
A1
A2
A3
100 µl de enzima
A1
A2
A3
Determine la Abs por cada minuto, recuerde que la absorbancia que registró cada
minuto debe ser menor puesto que se está evaluando la disminución del NADH+H+.
Tabla 2. Delta de las absorbancias registradas cada minuto para cada volumen de enzima
12,5 µl de enzima
A1 - A2
A2 - A3
25 µl de enzima
A1 - A2
A2 - A3
50 µl de enzima
A1 - A2
A2 - A3
75 µl de enzima
A1 - A2
A2 - A3
74 100 µl de enzima
A1 - A2
A2 - A3
Tabla 3. Promedio del deltas de las absorbancias registradas cada minuto para cada volumen de enzima
Volumen de enzima (µl) A Abs / min

12,5
25
50
75
100
Utilice la fórmula de la ecuación 1 para calcular la actividad de la enzima,

determine la velocidad enzimática de la AST y grafique los resultados obtenidos. En
este punto es importante tener en cuenta el volumen total y el volumen de la
enzima debido a que no son los mismos en cada ensayo.
Tabla 4. Efecto de la enzima sobre la actividad enzimática de AST
Volumen de enzima (µl) U/L

12,5
25
50
75
100
1. Consulte el pH y la temperatura óptima en condiciones normales para la enzima
AST y compare con los datos obtenidos en la práctica.
2. Consulte el valor de Km de la AST, para el ácido aspártico y para el α-cetoglutarato.
Sustente cada valor.
3. Consulte los inhibidores naturales de la AST y explique qué tipo de inhibidores son.
4. Sustente el método empleado para la determinación de la actividad de la AST.
Bibliografía
BISHOP, ML., FODY, EP., SCHOEFF, LE. Química Clínica. Principios, Procedimientos
y Correlaciones. Quinta edición. McGraw-Hill Interamericana. México. 2007.
2007
75 BAYNES,JW., DOMINICZAK,MH. Bioquímica Medica. Segunda edición. Elsevier
MCKEE, Trudy. Bioquímica. La base molecular de la vida. McGraw Hill Interamericana.
Primera Edición. Madrid, España. 2003.
ORLACCHIO, A. Some Kinetic and Other Properties of the Isoenzymes of Aspartate
Aminotransferase Isolated from Sheep Liver. Journal of Biochemistry (1979), vol. 177,
pág. 583 - 593
http://www.mhhe.com/biosci/genbio/virtual_labs/BL_11/BL_11.html
http://accessmedicina.mhmedical.com.ezproxy.unbosque.edu.co/content.aspx?bookid=1
441&sectionid=100481432. Accessed julio 26, 2018..
FORMATO DE RESULTADOS CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST)
Resultados
Cinética enzimática de la aspartato aminotransferasa (AST)
1. Efecto de la variación de la temperatura
sobre la actividad de la AST
Gráfica 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la actividad enzimática de la AST (°C vs U/L)
Indique el resultado en la gráfica
76
Tabla 1. Absorbancias registradas después de la incubación de la enzima (presente en el suero) con el sustrato a
diferentes temperaturas
Temperatura: 0 °C
Abs 1
Abs 2
Abs 3
Temperatura: 37 °C
Abs 1
Abs 2
Abs 3
Temperatura: 90 °C
Abs 1
Abs 2
Abs 3
Tabla 2. Diferencia de la Abs registradas (∆ Abs) durante cada minuto para cada temperatura
Temperatura: 0 °C
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
Temperatura: 37 °C
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
Temperatura: 90 °C
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
Tabla 3. Promedio de los deltas obtenidos durante cada minuto para cada temperatura
Temperatura °C Δ Abs / min

0
77 37
90
Tabla 4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la AST
Temperatura °C U/L
0
37
90
2. Efecto de la variación del pH sobre la actividad de la AST

Tabla 5. Absorbancias registradas después de la incubación de la enzima (presente en el suero) con el sustrato en
soluciones buffer con diferentes pH
pH 3,0
Abs 1
Abs 2
Abs 3
pH 7,8
Abs 1
Abs 2
Abs 3
pH 12,0
Abs 1
Abs 2
Abs 3
Tabla 6. Diferencia de la Abs registradas (∆ Abs) registradas durante cada minuto para cada pH
pH 3,0
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
pH 7,8
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
pH 12,0
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
Tabla 7. Promedio de los deltas obtenidos durante cada minuto para cada pH
pH Δ Abs / min
3,0
78 7,8
12,0
Tabla 8. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de la AST
pH U/L
3,0
7,8
12,0
Gráfica 2. Efecto del pH sobre la actividad de la actividad enzimática de la AST (pH vs U/L)
3. Efecto de la variación de la concentración de la enzima
sobre la actividad de la AST
Tabla 9. Absorbancias registradas después de la incubación de los diferentes volúmenes de la enzima (presente
en el suero) con el sustrato
12.5 µl Enzima
Abs 1
Abs 2
Abs 3
25 µl Enzima
Abs 1
Abs 2
Abs 3
50 µl Enzima
Abs 1
79 Abs 2
Abs 3
75 µl Enzima
Abs 1
Abs 2
Abs 3
100 µl Enzima
Abs 1
Abs 2
Abs 3
Tabla 10. Delta de la Abs registradas durante cada minuto para cada concentración de enzima .
12.5 µl Enzima
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
25 µl Enzima
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
50 µl Enzima
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
75 µl Enzima
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
100 µl Enzima
Abs 1- Abs 2
Abs 2-Abs 3
Tabla 11. Promedio de los deltas obtenidos durante cada minuto para cada concentración de enzima
Volumen de enzima (µl) Δ Abs / min

12,5
25
50
75
100
Tabla 12. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática de la AST
Volumen de enzima (µl) U/L

12.5
25
50
80 75
100
Gráfica 3. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad de la actividad de la AST (µl de enzima vs U/L)
4. Discusión de Resultados:
1. Esquematice con estructuras la reacción catalizada por la enzima AST, incluya

sustratos, productos y coenzima.
2. Esquematice con estructuras la reacción acoplada que permitió cuantificar la acti-

vidad de la AST de manera indirecta mediante espectrofotometría y sustente su
función en el ensayo.
81
3. Complete los datos de temperatura y pH óptimos en el cual la enzima obtuvo su

mayor valor de actividad y compare con los datos teóricos.
Variable Experimental Teórica

pH
Temperatura
4. Explique como la variación de la temperatura o del pH afecta significativamente la

actividad de cualquier enzima.
Temperatura:
pH:
5. Consulta
1. ¿Cuál es la importancia clínica de la cuantificación de la actividad de AST, ALT,
creatina cinasa y lactato deshidrogenasa?
2. Consulte la definición de Km y Vmax.
3. Consulte el valor de Km de la AST para el ácido aspártico y para el -cetoglutarato.
Recuerde consultar las unidades.
82

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Facultad de Medicina

RECTOR MANUAL ESCRITO Y DISEÑADO POR

Dra. María Clara Rangel Galvis

DIRECTOR ÁREA BIOCLÍNICA Claudia Liliana Bueno

COORDINACIÓN DE EDICIÓN Sandra Milena Duitama

Normas básicas de laboratorio 6

Normas de comportamiento en el laboratorio

Indicaciones para lograr el cumplimiento de los objetivos

proteínas a partir de técnicas sencillas, como cromatografía en capa fina y pruebas

Luz Yurany Moreno

12. No manipule reactivos ni equipos sin la supervisión del docente encargado.

10-4 10-5 10-7 10-8 10-10 10-13

Figura 1. Espectro electromagnético. Tomado de http://www.revisionworld.com/files/spectrum%20copy.jpg

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide

Ley de Lambert – Beer

ción, que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones

Curva Espectral o Espectro de Absorción

Espectro de absorción del ion [Ti (H2O)6]3+

Curva Espectral para la solución de Hemoglobina

Curva Espectral para la solución de Naranja de Metilo

4. Lea las absorbancias de la solución preparada en las siguientes longitudes de onda:

Reactivos Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

4. Determine el factor de dilución (fd) y la concentración de cada uno de los tubos.

5. Registre la Abs de cada uno de los tubos.

Gráfica 2. Curva espectral de naranja de metilo a una concentración de

3. Preparación curva de calibración naranja de metilo

Determine de la concentración de las diluciones de Naranja de metilo utilizadas para

Fd = Volumen total / Volumen soluto o Concentración final = Concentración Stock/Fd

4. Determinación concentración muestras problema a y b

Determinación de la concentración de las muestras problema A y B.

Abs muestra A: Abs muestra B:

Concentración de la muestra muestra problema A:

Propiedades químicas de los carbohidratos

que no posee centros quirales). La designación D o L es realizada de acuerdo a la orienta-

Por último, los polisacáridos son polímeros de más de 20 unidades de monosacáridos,

Importancia Biológica y Médica de los Carbohidratos

Normal cell Type 1 diabetes cell Type 2 diabetes cell

1. ¿En qué consiste y que permite identificar la prueba de Benedict? Esquematice la

Papel filtro Wathman Nº 2

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

un Paciente Mediante Cromatografía en Papel

Tabla 1. Resultados de la prueba de Benedict

Tabla 2. Rf obtenidos para los patrones y muestras analizados

TUBO Positivo / Negativo Color Reductor

Esquematice con estructuras la reacción entre glucosa y el reactivo de Benedict:

Tabla 2. Rf de los carbohidratos patrón y de las muestras de orina estudiante y paciente:

Cálculos para la determinación del Rf de los patrones y las muestras:

El azúcar presente en la muestra de orina del paciente es __________________________.

30 3. ¿Cuáles son las concentraciones normales de glucosa normales en el torrente

Ácidos Grasos Esteroides Vitaminas Terpenos

Eicosanoides Triacilgliceroles Ceras Esfingolípidos

Plasmalógenos Fosfatidatos Esfingomielinas Cerebrósidos

Fosfatidiletano- Fosfatidilcolina Otros fosfolípidos Otros

Precursor de X Nombre del glicerofosfolípido

Agua O H Ácido fosfatídico

Etanolamina O CH2CH2NH3 Fosfatidiletanolamina

Glicerol O CH2CH CH2OH Fosfatidilglicerol

Los esfingolípidos están formados por un esqueleto de esfingosina, un alcohol rami-

Importancia Biológica y Médica de los Lípidos

Quilomicrones Remanentes de VLDL IDL HDL

cardiovasculares que aumentan la probabilidad de sufrir de un ataque cardiaco.

Utilizar guantes, cualquier contacto de sus manos con la placa se evidenciará en el

Preparación de la muestra de suero

1. Se toman 5 ml de una muestra de sangre, se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min