Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P.

fluorescens; Morfología, medios de

cultivo, enfermedades y más.
Posted on 28 abril, 2015 by Gil Microbitos

Pseudomonas spp. su morfología colonial es característica de identificación en

algunos medios de cultivo, por ejemplo en medio agar Cetrimida, es un bacilo
curvo o recto, aislado o en pareja o cadenas cortas, Gram negativa ( -) esta
bacteria tiene motilidad positiva graci as a su flagelo (solo cuenta con uno).
Características.
Pseudomonas spp. su morfología colonial es característica de identificación en
algunos medios de cultivo, por ejemplo en medio agar Cetrimida, es un bacilo
curvo o recto, aislado o en pareja o cadenas cortas, Gram negativa ( -) esta
bacteria tiene motilidad positiva gracias a su flagelo (solo cuenta con uno).

Tiene la capacidad de formar biofilm, tiene un ligero aroma a frutas y es una de

las principales bacterias oportunistas causantes de infecciones n osocomiales
nosocomiales, especialmente en heridas, quemaduras y cuando se presentan
cepas mucoides hay una alta mortalidad en casos de fibrosis quística.

Taxonomía bacteriana
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Género: Pseudomonas

Antecedentes.
Schroeter (1872) le dio nombre de Bacterium aeruginosum, posteriormente en el
año de 1894 el botánico alemán Wallter Migula da el nombre de un nuevo género
llamado Pseudomonas , las describió como “células con órganos polares de la
motilidad”.

Si nos referimos a la etimología griega pseudo (falso) y monas (unidad) osea

“unidad falsa”, estas palabras no tienen mucha coherencia, Migula no hablo a
cerca de la etimología del término, sin embargo se cree que tom o como base el
hecho de que las bacterias que ya conocía eran unidades bacterianas (células
individuales sin flagelo), por lo tanto las Pseudomonas son parecidas a las
unidades bacterianas (bacterias sin flagelo), debido a esto podríamos interpretar
el nombre como “unidad falsa” ya que una unidad verdadera no tiene flagelo, algo
confuso pero hasta cierto punto tiene sentido.

Respecto a la etimología de Pseudomonas aeruginosa viene derivado de la

palabra Aerugo (“el óxido de cobre o verdín” de color verde) y la palabra ōsus
(indica abundancia) se llama así por el color azul verdoso de las colonias
bacterianas.

Morfología microscópica.
Son bacilos cortos, en parejas, en cadenas o aislados, Gram ( -), el flagelo polar
monotrico no es visible en una tinción de Gram ya que el flagelo es muy delgado,
para poderlo observar habrá que realizar un proceso de tinción especial llamado
Tinción flagelar de Leifson-Clarck, generalmente el flagelo no se usa como
identificación, sin embargo h ay ocasiones que es necesario cuando las pruebas
bioquímicas no son suficientes para identificar al género bacteriano te apoyas
distinguiendo de las bacterias que no tienen flagelo.

En esta
imagen se observa bacilos de cortos a largos, Gram ( -), sin agrupación aparante.
Credito: Bacterioweb.

El tamaño de Pseudomonas está entre 0.5 μm y 0.8 μm de espesor por 1.5 μm y

3.8 μm de largo. No forma esporas.

Metabolismo bacteriano.
Tiene un metabolismo aerobio estricto-oxidativo, no fermenta carbohidratos, sus
requerimientos nutricionales son sencillos prácticamente crece en agua.
Secreta sustancias coloridas hidrosolubles (1):

*Piocianina; Pigmento azulado.

*Pioverdina (Fluoresceína); tiene un color amarillo-verdoso ante luz UV es
fluorescente.
*Piorrubina; Tiene una coloración roja y se favorece su producción a
temperaturas menores a 37 °C y en un medio de cultivo con compuestos de
hierro
*Piomelanina; Su color es marrón, aumenta su síntesis con temperatura menor a
37 grados Celsius y en ambiente con fuentes de Fe.

->Piocianina:
azulado. ->Pioverdina (Fluoresceína): amarillo -verdoso.
->Piorrubina: roja. ->Piomelanina: marrón.
Credito: scielo En este medio de
cultivo se muestra la fluorescencia de Pseudomonas sp. esta luminosidad se
manifiesta en presecencia de luz uv, debido a la fluoresceina.
Credito: imageshack

Los diferentes pigmentos se pueden apreciar mejor sobre un agar Muller Hinton
alrededor de 48 h de incubación a 28 °C.
Combinando la Piocianina con la Pioverdina se genera una coloración verde -
azulado brillante.

Produce la enzima catalasa, oxidasa, utiliza diversas fuentes de carbono entre

ellas el citrato, es capaz de reproducirse a temperaturas de 42°C (este fenómeno
puede ayudar a la identificación del género), Es capaz de secretar toxinas
extracelulares como exotoxina A y enterotoxinas.

Hábitat en humanos y modo de transmisión.

Hábitat: El género Pseudomonas prácticamente se encuentra distribuido en
todas partes, por ejemplo en agua, suelos, vegetación, gasolina, objetos
inanimados, en humanos, animales, etc.

Trasmisión: Por aire, el agua contaminada es buena fuente, es posible transmitir

la bacteria, por medio de gotitas de saliva, en hospitales (nosocomios) en
especial en aquellos que no cuenten con proceso de sanitización adecuado de
áreas, equipos, médicos, enfermeras y/o personal que este en contacto con el
paciente enfermo. El periodo de incubación oscila entre las 24h y 72h.

Medios de cultivo donde crece Pseudomonas spp.

Sus requerimientos nutricionales no son exigentes, por lo que crece e n casi todos
los medios de cultivos, exceptuando aquellos que sean selectivos para alguna
especie en particular o que contengan antibióticos o sustancias que inhiban el
crecimiento.

Su cultivo bacteriano se da en caldos o agares:

*Medio de cultivo base agar con Soya-Tripcaseína

*Caldo Nutritivo.
*Agar Cetrimida,
*Medio de cultivo base agar con sangre.

Se muestra en la imagen colonias de

Pseudomonas spp. sobre un medio de cultivo de agar sangre, se observa una
coloración gris-plata en la superficie del crecimiento bacteriano.
Credito: Judy adam/flickr

*Agar Mueller Hinton.

*Caldo Casoy.
*Muchos más.

Pseudomonas aeuroginosa.
Es un patógeno que causa infecciones en personas inmunocomprometidas, como
por ejemplo personas con quemaduras en la piel, pacientes que reciben
quimioterapia para el cáncer, pacientes con fibros is quistica, al tipo de
infecciones antes mencionadas se le llama infecciones de un patógeno
oportunista (aprovechar situaciones desfavorables del paciente para enfermar),
también produce muchos casos de infecciones nosocomiales (en hospitales),
como neumonías.

La bacteria es capaz de tener resistencia aun gran numero de antibióticos, P.

aeuroginosa puede formar un biopelícula que facilita la resistencia a diversos
tratamientos, además de que ayuda a evadir las defensas del sistema inmune del
paciente.
Factores de virulencia.
Pseudomonas es un genero bacteriano con un alto potencial de patogenia, las
“armas” que puede usar son muy eficientes para quebrar las defensas del
sistema inmune, sobre todo en personas inmunocomprometidas.
Todos los días se hacen investigaciones sobre los factores de virulencia y se
descubren cosas nuevas, en los siguientes párrafos mencionare los factores más
comunes.

*Biopelicula: Esta formado de polisacáridos en particular por alginato, tiene

múltiples funciones entre ellas pued e retrasar o inhibir la entrada de los
antibióticos en la bacteria, en algunos casos puede producir necrosis en los
neutrofílos. Interfiere en la eficacia de las células fagociticas.
La mayoría de las cepas de Pseudomonas no son del tipo mucoide por ello
producen muy poca biopelicula, sin embargo en pacientes con fibrosis quistica,
se suele sintetizar grandes cantidades de alginato.
Se cree que casi todas las cepas que se encuentran viviendo en el medio
ambiente forman biopelicula.

*Toxinas extracelulares, enzimas hidrolíticas y de lisis : Lipasas, Elastasas A

y B, fosfolipasas, protesas alcalina, exotoxina A, Y, T y S .

*Biosurfactantes: Son sustancias que se comportan como tensoactivos teniendo

una parte de la molécula con tendencia lipofílica y otra con te ndencia hidrofílica,
dicha sustancia tiene un efecto de disminuir la tensión superficial ayudando a
“mojar ” con facilidad las superficies, en el caso de Pseudomonas sp. este
biosurfactante esta constituido por ramnosa y lípidos.

Se tiene la teoría de que utiliza este tensoactivo para solubilizar compuestos

hidrofóbicos como el hexadecagono, también favorece en la motilidad de la
bacteria facilitando el desplazamiento por ambientes acuosos, entre otras.

*Pigmentos:
*Piocianina; Tiene efecto bactericida.
*Pioverdina; Se tiene la teoría de que actúa como un sideróforo (captación de
hierro).
*Piorrubina; Se le adjudica actividad antibacteriana.
*Piomelanina; Se le atribuye función bactericida.

*LPS: Son estructuras que se encuentran sobre la superficie de la membrana

bacteriana y están conformados por lipolisacáridos, tiene diversas funciones para
evadir el sistema inmune entre ellas se encentra la inhibición de la eficiencia del
sistema de la cascada del complementos, que es un conjunto de sustancias que
se activan de manera sucesiva para lisar las membranas bacterianas, lps se
interpone entre el complemento y la membrana bacteriana.

*Motilidad, flagelo y pilis : El movimiento de Pseudomonas se da por dos vías, la

primera es dado en medios líquidos, donde utili za su único flagelo polar, en
ambientes semisólidos o superficies, se mueve a partir de los pilis (fimbrias) del
tipo IV a este yipo de movilidad se le llama “twitching”.
Los pilis tambien juegan un papel importante durante la adherencia de la bacteria
hacia las celulas a infectar.

*Sistema Sensor de Quorum: Este sistema regulatorio genético detecta cuándo

se ha llegado a una masa crítica de bacterias, ademas promueve la síntesis de
distintas proteasas involucradas en la virulencia de esta bacteria como son las
elastasas A y B y la proteasa alcalina, así como la exotoxina S. Este sistema
sensor se expresa siempre que se alcanza una elevada densidad celular
bacteriana.

Infecciones causadas por P. aeuroginosa.

Esta bacteria tiene un gran arsenal de factores de virulencia por lo que su
patogenicidad es alta, este microorganismo causa muchos tipos de infecciones,
sobre todo en pacientes inmunocomprometidos y pacientes en nosocomios
(hospitales), mencionare las inf ecciones más comunes.

*Infección de ojos. Principalmente queratitis (infección en la cornea), la bacteria

se introduce en el ojo por medio de alguna herida, como por ejemplo la causada
por un lente de contacto.

*Infección auditiva. Es una infección que se da en la zona exterior del oído,

generalmente se adquiere después de nadar debido a que residuos de agua
quedan depositados en los pliegues exteriores del oído.

*Pulmonía. Generalmente es una enfermedad nosocomial (adquirida en el

hospital), aumenta el riesgo cuando recibe el paciente respiración artificial por
medio de tubos, este tipo de infección tiene un alta mortalidad.

*Infección del sistema urinario. Al igual que la pulmonía las infecciones del
sistema urinario suelen ser adquiridas en el nosocomio, y se relacionan con
intervenciones quirúrgicas.

*Septicemia (presencia de bacterias en la sangre). Se puede adquirir debido a

una herida gangrenosa o una lesión cutánea que implique nodulos (estructuras
que filtran desechos de la sangre).

*Infección en quemaduras. Estas infecciones son muy comunes debido a que la

piel quemada pierde su función de barrera y la bacteria encuentra una entrada de
fácil acceso hacia el paciente y la producción de biopelicula aumenta la virulencia
de las cepas de Pseudomonas causando infecciones graves que en ocasiones
comprometen tejidos blandos del paciente.

*Infección de Pseudomonas en conjunto con fibrosis quistica . Cuando la

bacteria se posiciona en los pulmones de los pacientes que padecen fibrosis
quistica, es dificil erradicarla debido a que las cepas tienden a formar capas
gruesas de biopelicula lo cual agrava la infección, en caso de que el paciente
tenga en una etapa avanzada el padecimiento de la fibrosis quistica, las
infecciones por Pseudomonas suelen ser de muy al ta mortalidad.

Tratamientos y profilaxis (prevención).

*Resistencia y susceptibilidad a antibióticos.
Solo un medico podrá discernir si una cepa bacteriana es resistente o susceptible
a algún fármaco, apoyándose en estudios clínicos, antibiogramas bacterianos,
estudios genéticos, etc.

**Resistencia: Actualmente existen cepas que son resistentes a fármacos como

Ceftiazina, algunas Cefalosporinas, Ciprofloxacino y Carbenicilina.

**Susceptibilidad. Pseudomonas comúnmente son susceptibles a las siguient es

familias de antibióticos del tipo penicilicos, como algunas cefalosporinas,
fluoroquinolonas, Azlocolina (derivado de un acilo de la ampicilina), Polimixina
(Es un un fármaco sintetizado por la bacteria Paenibacillus polymyxa), entre
otros.

*Prevención. Para tener baja posibilidad de infección por Pseudomonas sp. los
centros de salud y hospitales deben tener una sanitización eficiente de sus áreas
casi todos los nosocomios hacen un rol de desinfectantes para disminuir la
resistencia de las cepas bacteria nas, generalmente en el rol se encuentra el
etanol al 70%, soluciones de hipoclorito, formaldehído, ozono desinfectantes
comerciales multi-compuestos, así como un monitoreo microbiologico periódico
en áreas criticas (principalmente donde se encuentran paci entes
inmunocomprometidos.

Hasta la fecha no se a desarrollada un vacuna, la profilaxis con antibióticos no es

muy recomendada ya que es posible genrar resistencia en las cepas bacterianas,
sin embargo el medico deberá evaluar esta posibilidad.

*Tratamiento. Las heridas se pueden limpiar con desinfectantes como la tintura

de yodo, agua oxigenada, pomadas antibacterianas como neomicina, bacitracina,
mupirocina, etc.
Generalmente el médico después de hacer los estudios pertinentes sugieren
empezar con un tratamiento combinado de aminoglucosidos con penicilicos,
aunque todo dependerá de la susceptibilidad bacteriana.

Pseudomonas putida, P. fluorescens.

P. putida
El hábitat de esta bacteria comúnmente es el suelo y zonas acuosas, no es
común encontrarlo en pacientes en hospitales, sin embargo si hay casos
reportados en particular en USA, Japón, Francia e Italia, Según Molina (6) y su
grupo de investigación menciona n que las infecciones están relacionadas con
introducción de catéteres o agujas. Las cepas suelen ser resistentes a
Betalactamicos.
Las infecciones que causa son muy similares a las que produce P. aeruginosa al
igual que os tratamientos para combatirla y s u prevención

P. fluorescens
Es menos comun que cause infecciones comparandola con P. aeruginosa y P.
putida, sin embargo si llega haber casos clinicos donde P. fluorescens muestra
una gran actividad hemolitica en las infecciones causado principlamnete por
factores de virulencia como las fosfolipasas.

Bibliografía.
(1) Merino, L. A. (2007), “Pseudomonas aeruginosa: una bacteria con
personalidades múltiples”. Rev. argent. microbiol ., Ciudad Autónoma de Buenos
Aires, v. 39, n. 3, sept. Disponible en
<http://www.scielo.org.ar/scielo.phpscript=sci_arttext&pid=S0325 -
75412007000300004&lng=es&nrm=iso>. accedido en 21 abr. 2015.
(2) Gloria Soberon ; Pseudomonas aeruginosa, Microbios, Insti tuto de
Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, consultado el 16 -abr-
15. Disponible en:
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap3/
(3) Alan R. Hauser and Egon A. Ozer, (2011), “Pseudomonas aeruginosa”,
Posters, Cubist Pharmaceuticals, Nature Reviews, Microbiology.
(4) George M. Garrity, (2004), Bergey´s Manual, Of Systemati, Bacteriology,
Second Edition.
(5) Pseudomonas spp, “Pathogen Safety data sheet -Infectious Substances”,
Public Health Agency of Canada, consultado el 27 de A bril del 2015, disponible
en:
<http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/pseudomonas-spp-eng.php>
(6) Molina L, Udaondo Z, Duque E, Fernández M, Molina -Santiago C, et al. (2014)
Antibiotic Resistance Determinants in a Pseudomonas putida Strain Isola ted from
a Hospital. PLoS ONE 9(1): e81604. doi: 10.1371/journal.pone.0081604,
Disponible en:

http://microbitosblog.com/2015/04/28/pseudomonas-aeruginosa-p-putida-p-fluorescens-
morfologia-medios-de-cultivo-enfermedades-y-mas/

Pseudomona putida
Medios de cultivo, técnicas de aislamiento y siembra
Que tal bloggeros, como siempre actualizando este espacio con la finalidad de dar a conocer un poco
más acerca de la tan menciona Pseudomona putida, en esta ocasión les traemos información sobre los
 medios de cultivo a los que la bacteria responde satisfactoriamente al producir las colonias especificas y
con ello se adquiere el aislamiento de la misma al sembrarlas de manera determinada.

Para empezar los medios de cultivo

 Medios de cultivo a utilizar incluyendo la composición y el tipo de medio de acuerdo a la clasificación por NOM, así
como el procedimiento para su preparación
Los medios de cultivo a utilizar durante el proceso de aislamiento de la Pseudomona putida se muestran a
continuación. Se incluye una breve descripción de su preparación y clasificación acorde a la Norma Oficial
Mexicana NOM-065-SSA1-1993, QUE ESTABLECE LAS ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS MEDIOS
DE CULTIVO. GENERALIDADES.

Nombre: Medio OF con glucosa (oxidación fermentación de Hugh y Leifson)

Clasificación: Medio semisólido selectivo de enriquecimiento
Ingredientes Cantidades
Peptona 2g
Extracto de levadura 0,5 g
Cloruro de sodio 20 g
Dextrosa 10 g
Púrpura de bromocresol 0,015 g
Agar 3g
Agua destilada 1 000 ml
Preparación del medio de cultivo: Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar. Ajuste
el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y esterilice en autoclave 20 minutos a 121ºC.

Nombre: Medio basal

Clasificación: Medio sólido selectivo

Ingredientes Cantidades

-Agua destilada 1L
-Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.4 g
-Fosfato de potasio dibásico K2HPO4 1.6 g
-Cloruro de amonio NH4Cl 1.5 g
-Cloruro de magnesio MgCl2 6H2O 0.17 g
sextahidratado
-Sulfato de sodio heptahidra tado NaSO4 7H2O 1.5 g
-Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 2H2O 0.045 g
-Solución mineral* 1.0 ml

Preparación del medio de cultivo: Disolver los componentes en 0.5L de agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121°C y 1atm de presión por 20 minutos

*La solución mineral se agrega después de esterilizar

Nombre: Agar noble (Difco o similar)

Clasificación: Medio sólido selectivo

Preparación del medio de cultivo: Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de
SST 0,1 M, pH 7,4 adicionada de un conservador (10 mg de merthiolate).
Prosigamos con aislamiento ...

Una vez que se tenga la muestra de suelo procedente de los alrededores de plantas petroquímicas o
industrias textiles, se pesaran 10 g de suelo.

El método para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarbonoclastas del suelo es por la técnica de
cuenta por dilución y vaciado en placa utilizando un medio mineral basal, este se debe disolver en agar
noble para obtener un medio de cultivo solido y que así contenga petróleo crudo o un hidrocarburo
específico de interés, como única fuente de carbono y energía. El petróleo ligero que se impregna en un
papel filtro permite que las bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten de los hidrocarburos volátiles, o
la adición de un hidrocarburo en solución asperjando la superficie de la caja ya inoculada.

Existen ciertas limitaciones, que son las siguientes:

El agar noble para preparar el medio de cultivo sólido debe ser un agar puro, libre de cualquier
contaminante; de lo contrario puede haber crecimiento de bacterias por las impurezas que pueda
contener, permitiendo el crecimiento de bacterias no hidrocarbonoclastas. Se recomienda inocular cajas
de medio mineral sin hidrocarburo para tener un control negativo y asegurar la pureza del agar.

El petróleo crudo o hidrocarburo utilizado para este método debe ser ligero (volátil), ya que el acceso de
esta fuente de carbono y energía es a través de los vapores que se generan de ella.

Protocolo de diluciones y técnicas de siembra.

1) En condiciones estériles, adicionar 1 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca
con 99 ml de solución salina isotónica estéril (dilución 10^-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con
agitación vigorosa.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (dilución 10^-3). De ahí se
hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10^-10 o las adecuadas,
asegurándose de
utilizar una punta o pipeta estéril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada
paso.
3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del medio de cultivo
seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por triplicado y con tres diluciones próximas (Ej. 10^-3,
10^-4 y 10^-5) para asegurar la cuenta.
4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente esterilizada
(inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una
distribución homogénea por toda la superficie del medio.
5) Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz.
6) Después de un periodo de incubación, contar el número de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.

Procedimiento
Se debe preparar previamente a todo el procedimiento una solución mineral en el orden que indica la
siguiente tabla

Una vez que se tenga la solución se puede proseguir con el siguiente procedimiento

1) Preparar el medio de cultivo con los componentes del medio basal disolviéndolos en el orden
señalado por su composición en un litro de agua destilada.
2) Ajustar el pH a 7.0, después adicionar 15 g de agar puro (agar noble).
3) Esterilizar a 1.05 atm, 121°C y durante 15 min. Dejar enfriar, cuando el medio se encuentre a 50°C
aproximadamente, añadir la solución mineral estéril previamente preparada (1 ml por L de medio)
4) Vaciar el medio en cajas de Petri en condiciones estériles, esperar a que gelifique.
5) En un disco de papel filtro estéril impregnar el petróleo crudo ligero estéril y colocarlo en la parte
interna de la tapa de la caja de Petri. El hidrocarburo que se volatiliza servirá como fuente de carbono y
energía.
6) Preparar la muestra de suelo y diluciones e inocular cada caja como se indica en la sección de
protocolo de diluciones y tecnicas de siembra.
7) Después de cinco días de incubación, proceder al conteo de colonias. Las colonias que
se deberán contar son las que hayan formado un anillo y un sedimento de color verde azulado.
8) Para el cálculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe considerar la dilución con que
se inoculó la caja, la cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la muestra.

Cálculos

1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).

Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó
la muestra con la que se inocula la caja (10^-2 a 10^-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100))

Y eso es todo por hoy, como siempre nuestras referencias ... esta vez fueron muchas por el hecho de
consultar los requerimientos de los medios con base a las NOM

http://www.espatentes.com/pdf/2085239_a1.pdf
http://www.vgdusa.com/Noble-Agar.htm
http://www.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/practicas.pdf
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/031ssa13.html
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf

http://mocoloridopseudomona.blogspot.com/2011/11/medios-de-cultivo-tecnicas-de.html