Resumen de Genética Molecular – Laboratorio

Objetivo: el objetivo de este trabajo práctico es modular la actividad neuronal en neuronas

colinérgicas mediante la expresión de un canal iónico llamado TRPA1 activable por un aumento de
temperatura en Drosophila melanogaster.

¿Cómo se logró llevar esto a cabo?  Se utilizaron dos líneas de Drosophila melanogaster
llamadas 298 y 299 donde cada una se encuentra transgenizada con una cierta construcción
siendo estas las siguientes:

La línea 298 se encuentra transgenizada con la construcción esquematizada a continuación

conteniendo un promotor ChaT específico de neuronas colinérgicas que además en endógeno de
Drosophila melanogaster. Este
promotor se encuentra río
arriba de la secuencia
codificante de Gal4 siendo este un factor de transcripción que es exógeno a las moscas, es decir, la
secuencia de aquel no se encuentra presente en el genoma del mismo previamente a la
transgenización.

Ahora, la línea 299 se

encuentra transgenizada con
la construcción
esquematizada a la izquierda conteniendo un promotor UAS el cual es activado específicamente
por el factor de transcripción Gal4. Este promotor se encuentra río arriba de la secuencia
codificante del canal iónico dTRPA1 siendo este inducible por temperatura provocando la
despolarización de las neuronas colinérgicas activándolas.

No obstante, con el objeto de que

efectivamente haya expresión del
canal iónico para luego inducirlo por
aumento de temperatura es necesario
que ambas construcciones se
encuentren en el genoma de un único
individuo. Para lograr esto se realizó
un cruzamiento entre las líneas 298 y
299 de manera que la F1 resultante
posea ambos elementos transgénicos en su genoma en una proporción del 25%.

Cromosomas balanceadores y marcadores fenotípicos: teniendo en cuenta que es necesario

identificar qué individuos de la F1 portan ambos elementos transgénicos hay que utilizar
marcadores fenotípicos que suelen estar asociados a cromosomas balanceadores. Estos
cromosomas se caracterizan por:

- Tener marcadores fenotípicos dominantes que generan características observables en

distintas etapas del ciclo de vida de la mosca,
- Tienen mutaciones letales recesivas por lo que los individuos vivos siempre los poseen en
heterocigosis y,
- Tienen múltiples inversiones de manera que no es posible que se den recombinaciones
con el cromosoma homólogo que no posee las inversiones anteriores y donde además se
suele colocar el elemento transgénico de interés.
 De esta manera, siempre que vea un cierto fenotipo (dado por un cierto marcador
fenotípicamente dominante en un determinado cromosoma balanceador) puedo inferir
que hay presencia del elemento transgénico correspondiente al mismo.
Además, permiten acarrear a los elementos transgénicos en heterocigosis debido a que
estos cromosomas tienen una mutación letal en homocigosis.

Entonces, las líneas mencionadas anteriormente poseen, además de los elementos transgénicos,
los siguientes cromosomas balanceadores:

La línea 298 posee en el par cromosómico sexual X el locus White mutado de manera que poseen
ojos blancos mientras que en otro cromosoma posee
un locus sin interés en su versión salvaje. No
obstante, en el cromosoma 3 hay presencia del
elemento transgénico ChaT – Gal4 en heterocigosis
junto con un cromosoma balanceador TM6 que posee las mutaciones en los genes Humeral
(quetas supernumerarias en las patas delanteras) y Tubby (larva y pupa corta).

Mientras tanto la línea 299 posee en el par cromosómico sexual X el locus White salvaje de
manera que las moscas poseen ojos rojos mientras
que en el par cromosómico 2 posee al elemento
transgénico UAS – dTRPA1 en homocigosis. No
obstante, en el cromosoma 3 hay presencia de un
cromosoma balanceador TM6B que aporta la mutación en el gen Humeral en heterocigosis
mientras que el cromosoma 3 presenta una mutación en el gen Stubble (quetas cortas).

Al llevar a cabo los cruzamientos recíprocos para ambas líneas transgénicas se observa que un 50%
de la F1 (aquellas que están marcadas con un círculo lleno negro) poseerán ambos elementos
genéticos en su genoma.

Estos individuos podrán ser identificados mediante su fenotipo diferencial dado que la mitad
tendrán sólo la mutación en el locus Humeral (quetas supra numerarias en las patas delanteras) y
la mitad restante tendrá sólo la mutación en Stubble (quetas cortas).

No obstante, hay una complicación a la hora de identificar a las moscas con fenotipo mutante para
Humeral debido a que dos tipos de individuos lo tendrán siendo estos aquellos que efectivamente
posean los elementos transgénicos de interés (fenotipo sólo Humeral mutante) y aquellos que no
los posean (fenotipo mutante para Humeral y Tubby). Estos último también son mutantes para
Tubby pero este no es posible ser reconocido durante la adultez por lo que en este estadío del
ciclo de vida de las moscas no sería posible diferenciarlos. Con el objeto de discernir entre ellos
sería necesario analizar las pupas y descartar a todas aquellas que sean mutantes para Tubby. Sin
embargo, esto no fue necesario dado que se observó que todos aquellos individuos que tenían el
fenotipo mutante para Humeral y Tubby murieron. Una posible explicación ante esto es que los
cromosomas balanceadores TM6 y TM6B posean la misma mutación letal recesiva.

¿Cómo son los cruzamientos?  Se cruzaron hembras vírgenes de la línea 298 junto a machos de
la línea 299 y también se llevó a cabo el
cruzamiento recíproco, es decir, hembras
vírgenes 299 juntos a machos de la línea
298. Estos cruzamientos recíprocos
fueron realizados con el propósito de
verificar que se obtenían F1’s idénticas de
manera de poder descartar que haya ocurrencia de algún fenómenos de herencia epigenética o
imprinting dado que en estos casos no se obtienen resultados de cruzamientos iguales.

¿Por qué se utilizan hembras vírgenes?  Las hembras adultas de Drosophila melanogaster
poseen una estructura denominada espermateca en la cual almacenan el esperma de los machos
que las fecundan. De esta manera, al utilizar una hembra no virgen en los cruzamientos corro el
riesgo de que la F1 resultante no sea del macho que me interesa sino de algún otro macho que la
haya fecundado antes.

¿Cómo se obtienen las hembras vírgenes?  Una vez que se haya llevado a cabo el cruzamiento
espero a que las pupas se encuentren a punto de eclosionar para quitar a todos los adultos del
frasco. Luego, espero aproximadamente 4 horas siendo este un tiempo menor al de maduración
sexual de las hembras para sexar a los individuos. De esta manera, identifico a las hembras
vírgenes mediante características distintivas.

Tiempo de maduración a 25°C  6 horas

Tiempo de maduración a 18°C  12 horas

La ventana de fertilidad de las moscas hembras no se mantiene constante en el tiempo así que por
más que se trate de hembras vírgenes, estas no serán tan fértiles al día 1 en comparación al día
10. De esta manera, hay que asegurarse de la edad de las moscas con el objeto de utilizar a
aquellas que tengan un buen grado de fertilidad. En esta práctica se usaron hembras de una
semana de edad.

Cruzamientos  Se colocaron tanto hembras como machos transgénicos en un tubo de ensayo

para luego dejar pasar algunos días de manera que hayan emergido larvas correspondientes a la
F1 pero no los individuos en sí. De esta manera, se quitaron a todos los parentales de manera que
no se mezclaran con la F1 una vez que esta emergiera.

CONTROLES  MOSCAS TRANSGÉNICAS PARENTALES Y MOSCAS WILD TYPE

Repiques  A medida que iban pasando los días el medio de cultivo en el cual vivían las moscas se
iba llenando de desechos de manera que era necesario cambiar a las moscas a otro tubo de
ensayo con medio de cultivo fresco. Esto era llevado a cabo anestesiando a las moscas en primer
lugar. Adicionalmente, los repiques representan una manera de establecer un t=0 al poner
individuos de una misma línea en un tubo donde se reproducirán. Llevo a cabo esto con las líneas
transgénicas y controles para asegurarme que todas las crías emerjan al mismo tiempo
(nacimiento sincronizado) y tengan la misma edad.
Clasificación de la F1  Una vez emergida la F1 (y antes de que tengan posibilidad de reproducirse
dando origen a una F2) hay que seleccionar a aquellos individuos que posean los elementos
genéticos GAL4-UAS en su genoma. Para ello se tienen en cuenta los fenotipos Stubble y Humeral
teniendo en cuenta que no todos aquellos que tengan este último fenotipo tendrán aquellos
elementos.

Color de ojos de la F1  Teniendo en cuenta que el gen White se encuentra en el cromosoma

sexual X, al realizar la cruza en la cual la hembra posee ojos blancos (W-) se supone que la mitad
de los machos debería tener ojos blancos. No obstante, se observa que toda la descendencia tiene
ojos rojos. Esto puede deberse al hecho de que dentro del elemento UAS (el cual fue insertado en
la mosca mediante transposición del elemento P) hay presencia de un gen MiniWhite el cual está
en un cromosoma autosómico. Por lo tanto, independientemente de la presencia de un alelo W-
en el cromosoma sexual X las moscas siempre tendrán ojos rojos debido a que el alelo W+ resulta
dominante. Sin embargo, hay una cierta probabilidad de que algunos machos tengan ojos blancos
pero para que esto ocurra el elemento P debería transponer nuevamente llevando toda la
secuencia UAS (de manera que ahora ya no haya expresión del canal iónico) seguido de
recombinación en aquel locus MiniWhite.

Testeo de fenotipo  Con el objeto de testear el fenotipo de locomoción de las moscas se colocó
a cada tipo de estas en frascos distintos y se los sumergió en un baño térmico de 30°C para luego
medir el tiempo en el cual todas las moscas caían al fondo del frasco. Se observó que la totalidad
de las moscas con fenotipo Stubble y todas las de fenotipo Humeral caían al fondo del frasco. Por
lo tanto, se confirma nuestra hipótesis planteada acerca de que aquellas moscas con fenotipo
Humeral que tenían presencia de ambos cromosomas balanceadores TM6 y TM6B eran en
realidad letales dado que sino estas moscas Humeral no deberían haber caído al fondo del frasco.

Cuestionario

Pregunta 1

Con el objeto de realizar un estudio de la actividad de las neuronas sensoriales utilizaría el

promotor ppk-GAL4 dado que este es un promotor específico de neuronas sensoriales por lo que
será activo en las mismas. Mientras tanto el promotor elav-GAL4 se trata de un promotor ubicuo
al sistema nervioso pero el promotor ChaT7.4-GAL4 es específico de neuronas colinérgicas.

Pregunta 2

Este fenómeno se debe a que los machos van a sobre expresar la proteína de fusión de la kinasa y
GFP debido a la compensación de dosis ya que sólo tienen un cromosoma X mientras que las
hembras tienen dos cromosomas X.

Pregunta 3

Las moscas wild type no presentarán fluorescencia dado que no tienen los elementos genéticos
necesarios. Mientras tanto aquellos individuos que tengan la versión mutante de GAL4 de baja
afinidad por el promotor UAS presentarán una fluorescencia intermedia y, por último las moscas
que tengan la versión de GAL4 wild type presentarán la mayor fluorescencia.
Pregunta 4

Para realizar esto necesitaría transgenizar moscas con dos sistemas GAL4-UAS donde uno de ellas
posea la secuencia de GFP regulada por el promotor UAS mientras que la secuencia de GAL4 debe
estar regulada por un promotor específico de neuronas colinérgicas. Mientras tanto, el sistema
restante debe tener la secuencia del canal iónico regulado por el promotor UAS mientras que la
secuencia de GAL4 tiene que estar regulada por el promotor específico de neuronas colinérgicas.

Con el objeto de visualizar tanto neuronas colinérgicas como neuronas sensoriales debería generar
un genotipo que posea un elemento UAS bajo la secuencia de GFP pero dos elementos GAL4
donde cada uno estará regulado por promotores distintos: uno estará regulado por un promotor
específico de neuronas colinérgicas mientras que el otro estará regulado por un promotor
específico de neuronas sensoriales.

Pregunta 5

Hacer cuadro de Punnet

Pregunta 6

Hacer cuadro de Punnet

Pregunta 7

No es eficiente dado que no tengo en cuenta a aquellas moscas que tienen a ambos elementos
genéticos con fenotipo Humeral debido a que no puedo distinguir fenotípicamente a estas de
aquellas Humeral que no tienen presencia de aquellos elementos. Podría elegir también a todas
aquellas que tengan fenotipo Humeral para luego distinguir a aquellas que tengan los elementos
de aquellas que no los tengan mediante el testeo del fenotipo.

Pregunta 8

El fenotipo Stubble de la F1 contiene a ambos elementos genéticos por lo que me sirve y, además
puedo distinguirlos de los parentales dado que estos tienen fenotipos Humeral y Tubby y, Humeral
y Stubble. El primer fenotipo de los parentales nombrados no puede ser distinguido de uno de los
fenotipos de la F1.

Pregunta 9

En la introducción teórica

Pregunta 10

Disminuir la temperatura