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Integrantes:
1
S. Moret, G. Purcaro. “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, General Overview”. Elsevier. Diciembre, 2016
2
Lista de agentes cancerígenos realizada por la agencia internacional para la investigación del cáncer (IARC)
[en línea] < https://monographs.iarc.fr/agents-classified-by-the-iarc/> [consulta 12 agosto 2018)
3
Hussein I. Abdel-Shafy a, Mona S.M. Mansou. “A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: Source,
environmental impact, effect on human health and remediation”. Egyptian Journal of Petroleum. 4 de
Noviembre 2014
4
K. Srogi, “Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review”
5
Decreto Sanitario Nº 977, artículo 249. CHILE. Límites fijados de 8 PAHs de alta masa molar y su prohibición
a aceites y grasas comestibles en general. Ministerio de Salud, Santiago, República de Chile 2003
2. Experimental
2.1 Materiales y rectivos.
2.2 Equipos
Para la preparación de la solución estándar se pesaron los PAH en una Balanza Analítica 40SM-200
AS Precisa.
Se utilizó un equipo de HPLC Waters 600 Controller, equipado con una columna Eclipse XDB-C18
de 5 micras y 4,6mm x 150 m. Con un detector de arreglo de diodo Waters 996 y un detector de
fluorescencia Waters 2475. Se inyectaron estándares en un autosampler Waters 717.
Se utilizó un programa para el detector de arreglo de diodos con un barrido desde 200-300 nm con un
rango de 1 espectro por segundo y una resolución de 1,2 nm , fijandose un límite de presión para la
6
Dabestani, R.; Ivanov I. N., "Invited Review A Compilation of Physical, Spectroscopic and Photophysical
Properties of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons", Photochemistry and Photobiology, 1999, 70 (1): 10-34
bomba (W600) con un máximo de 3000 kPa y un mínimo de 250 kPa. El volumen de inyección fue
siempre de 20 µL.
Para el detector de fluorescencia se usó un “data rate” de 1pts/cc, PMT Gain de 200, con una constante
de tiempo de 1 segundo, en un barrido de 10 min. Se programaron 2 canales para longitudes de onda
de excitación y emisión; Channel A:275-350 nm, Channel B: 270-440 nm.
Se desarrolló inicialmente un método de separación cromatográfica para los 3 PAHs en estudio,
estableciéndose un programa con elusión por gradiente con un flujo de 1,2 mL/min de fase móvil a
35°C para cada inyección.
Tabla 2. Programa de elusión por gradiente.
Tiempo (min) %H20 %CH3CN
2 50 50
7,5 30 70
8 50 50
2.2 Procedimiento:
Curva de calibración
Se realizó una curva de calibración para la determinación del límite de cuantificación (LOC),
límite de detección (LOD) y linealidad de los métodos para HPLC-DAD y HPLC-FLD, para esto
se deben preparar cinco estándares utilizando patrones de los PAHs. Para el método HPLC-DAD
las concentraciones de los hidrocarburos utilizados fueron desde 0,1 hasta 0,5 µg/ml y en HPLC-
FLD desde 0,01 hasta 0,05 µg/ml.
Para realizar las curvas de calibración se preparó una solución de 500 (µg/ml) la cual contenía
Phe; Flt y Ace. Luego se preparó una solución intermedia de 50 (µg/ml) para así poder llevar a
cabo las diluciones utilizando siempre acetonitrilo para las distintas curvas de calibración.
**Pantallazo**
250000
200000
Area (uV*sec)
150000
Ace
100000
Phe
Flt
50000
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Concentración (ug/mL)
Gráfico 3. Curva de calibración para soluciones de 0,1 - 0,5 μg/mL de Ace, Phe, y Flt en
HPLC-DAD.
20000
Area (uV*sec)
15000
Ace
10000 Phe
Flt
5000
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Concentración (ug/mL)
Gráfico 4. Curva de calibración para soluciones de 0,01 - 0,05 μg/mL de Acenantreno (Ace),
Fenantreno(Phe), Floranteno (Flt), en HPLC-DAD.
Posteriormente, con los datos de concentración se calculan los porcentajes de recuperación usando
la fórmula:
𝜇𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜𝑠
% 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = ( ) ∙ 100 (1)
𝜇𝑔 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠
Tabla 12. Valores de concentración de cada analito y coeficiente de variación para la doble
microextracción de los tres PAH’s. para volúmenes de 40uL y 80uL.
Discusión.
La composición de la fase móvil que se utilizó para la determinación de PAH en régimen
por gradiente se informa en la tabla 2. Este programa de elusión presento una adecuada
separación cromatográfica de los analitos de interés y permitió que fuera posible cuantificar
sin reportar complicaciones.
A partir de los datos de la tabla 1 se puede observar que los valores de Log Kow y de
solubilidad en agua son bastante diferentes para cada PAH estudiado, lo que permite que la
separación sea particularmente fácil a través de métodos cromatográficos y se traduzca en
valores de tiempo de retención distintos (tabla 3).
En la tabla 4 y 5 se observan los parámetros de calidad de la ecuación de regresión lineal
para la calibración en HPLC-DAD Los valores de R2 dan cuenta de un muy buen ajuste
lineal de los datos al modelo de regresión lineal.
Por otro lado, la tabla 6 arroja parámetros lineales obtenidos mediante la calibración por
HPLC-FLD presentando valores de pendiente hasta 100 veces mayores que los obtenidos
por HPLC-DAD dando cuenta de la elevada sensibilidad que posee el detector de
fluorescencia.
En las tablas 7 y 8 se muestran los límites de detección y cuantificación de acuerdo al
procesamiento estadístico de los datos, presentando valores relativamente cercanos en
algunos compuestos. Los valores obtenidos de acuerdo al procedimiento estadístico, en
general, contemplan el error estándar de la regresión que a su vez comprende errores
aleatorios provenientes de la preparación de patrones de calibración. También se puede
notar que los límites de cuantificación y detección para HPLC-FLD son menores que los
valores de HPLC-DAD, debido a que el LOD se define como la cantidad mínima de
sustancia que se puede detectar con fiabilidad por el método analítico estudiado y el LOC
se describe como la concentración más baja de analito en una muestra que puede ser
cuantitativamente determinado7.Debido a esto los limites de cuantificación y detección son
menores en FLD, ya que presenta mayor sensibilidad.
Por otra parte, en la tabla 9 y 10 se observan los valores de concentración y los porcentajes
de recuperación. Las muestras 2 y 4 no comparten valores con los de sus triplicados
respectivos lo que afecta directamente la precisión del método , esto se debe a errores
aleatorios cometidos en el proceso experimental.
De las tres opciones nombradas en el procedimiento se observó que el mejor disolvente de
dispersión es MeOH en una proporción que provee la mejor formación de la nube
dispersante mejorando la eficiencia de la extracción.
7
Richer D,Pablo (2017) Parámetros de calidad analitica
Conclusión.
Al utilizar detectores acoplados de arreglo de diodos y fluoresencia (DAD-FLD) nos
permitio obtener informacion completa de las resultados para poder complementar la
informción obtenida con ambos detectores.
La técnica de microextracción dispersiva liquido liquido ocupa varios solventes que es
basada en un sistema ternario,por lo que este proceso no favorece la utilizacion de la
quimica verde por los distintos solventes a utilizar , a pesar de que los volumenes utilizados
sean en escala de micro litros.
Bibliografía