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Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Inorgánica y Analítica


Química Analítica III

Extracción y determinación de hidrocarburos


aromáticos policíclicos por medio de micro extracción
líquido-líquido dispersiva y cromatografía líquida de
alta eficiencia en muestras de agua mediante HPLC-
DAD Y HPLC-FLD

Integrantes:

Santiago, Chile. 2018


Introducción.
Los PAHs son una familia de compuestos orgánicos muy variada y amplia con dos o más anillos
aromáticos fusionados. Se generan principalmente como consecuencia de la combustión incompleta
de materia orgánica por lo que son incorporados continuamente al medio ambiente dañando nuestra
flora y fauna1, además son conocidos por sus propiedades cancerígenas y/o mutagénicas2. Las
propiedades tanto físicas como químicas que poseen los PAHs están gobernadas por su tamaño y la
forma de las moléculas; la solubilidad de estas moléculas es relativamente baja, pero poseen un
carácter altamente lipofílico. A temperatura ambiente se encuentran en estado sólido debido a que
poseen altos puntos de fusión y ebullición.
En los suelos, la acumulación de estos contaminantes orgánicos puede provenir del depósito de PAHs
asociados al material particulado que se encuentra en la atmosfera luego de un largo periodo de
transporte3. La evaporación y migración de los PAHs que contaminan el suelo son posibles fuentes
de contaminación de aguas superficiales como también lo son las descargas urbanas, los efluentes
industriales, por lo tanto, la presencia de PAHs en agua potable puede atribuirse al uso de aguas
superficiales y subterráneas como fuentes de obtención de agua potable.4
La presencia de PAHs tanto en alimentos como en muestras ambientales (suelos y aguas) está
regulado 5 , por ende, en un constante control analítico, lo que ha generado la necesidad de mejorar
las técnicas de extracción. Una de estas técnicas es la microextracción líquido-líquido dispersiva
(DLLME) basada en un sistema ternario de disolventes el cual contiene un disolvente de extracción
el que debe tener mayor densidad que el agua y baja solubidad en esta y un disolvente dispersante,
siendo soluble en el disolvente de extracción y miscible en agua. Se presenta como una técnica que
minimiza los tiempos de preparación de la muestra y simultáneamente mejora los niveles de
sensibilidad, reproducibilidad y selectividad. Además de ser capaz de maximizar la diferencia de
volúmenes entre el disolvente de extracción y la muestra acuosa, con el fin de mejorar el factor de
enriquecimiento de los analitos, y, de esta forma, eliminar o reducir la etapa posterior de
concentración de la fase orgánica permitiendo el estudio a niveles de concentración traza.
En el presente trabajo experimental se evaluará la eficacia del método de microextracción liquido
dispersivo asociado al estudio mediante la técnica de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
acoplada a dos tipos de detectores uno de fluorescencia y arreglo de diodos, para la detección y
cuantificación de tres PAHs distintos: Fluoranteno (Flt), Acenafteno (Ace) y Fenantreno (Phe).

1
S. Moret, G. Purcaro. “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, General Overview”. Elsevier. Diciembre, 2016
2
Lista de agentes cancerígenos realizada por la agencia internacional para la investigación del cáncer (IARC)
[en línea] < https://monographs.iarc.fr/agents-classified-by-the-iarc/> [consulta 12 agosto 2018)
3
Hussein I. Abdel-Shafy a, Mona S.M. Mansou. “A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: Source,
environmental impact, effect on human health and remediation”. Egyptian Journal of Petroleum. 4 de
Noviembre 2014
4
K. Srogi, “Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review”
5
Decreto Sanitario Nº 977, artículo 249. CHILE. Límites fijados de 8 PAHs de alta masa molar y su prohibición
a aceites y grasas comestibles en general. Ministerio de Salud, Santiago, República de Chile 2003
2. Experimental
2.1 Materiales y rectivos.

 Viales para HPLC con insertos de vidrio


 Jeringa Hamilton 150 L
 Material de vidrio volumétrico y de uso general clase A.
 Agua ultra pura Milli-Q
 Metanol grado HPLC, Merck
 Etanol grado HPLC, Merck
 Cloroformo grado cromatografía, Merck.
 Acetonitrilo grado HPLC, Fisher Scientific.
 AccuStandar: Fluoranteno (Flt), Acenafteno (Ace) y Fenantreno (Phe).
 Solución Multiestándar: preparada a partir de los PAH estándares en acetonitrilo
(500ug/mL).
 Los contenedores de las muestras fueron frascos de vidrios color ámbar con tapa de teflón.

Tabla 1. Propiedades físico-químicas de algunos PAH’s6


Abreviación Masa Punto Punto de Densidad Estado Log Solubilidad
Molar de Ebullición a 20°C físico Kow en agua
(g Fusión (°C) (g*mL-1) (mg L-1)
mol-1) (°C)
Acenafteno Ace 154,2 95 96 1,9 Sólido 3,98 1,9
Fluoranteno Flt 202,3 111 375 0,26 Sólido 4,90 0,26
Fenantreno Phe 178,2 100 340 1,2 Sólido 4,45 1,2

2.2 Equipos
Para la preparación de la solución estándar se pesaron los PAH en una Balanza Analítica 40SM-200
AS Precisa.
Se utilizó un equipo de HPLC Waters 600 Controller, equipado con una columna Eclipse XDB-C18
de 5 micras y 4,6mm x 150 m. Con un detector de arreglo de diodo Waters 996 y un detector de
fluorescencia Waters 2475. Se inyectaron estándares en un autosampler Waters 717.
Se utilizó un programa para el detector de arreglo de diodos con un barrido desde 200-300 nm con un
rango de 1 espectro por segundo y una resolución de 1,2 nm , fijandose un límite de presión para la

6
Dabestani, R.; Ivanov I. N., "Invited Review A Compilation of Physical, Spectroscopic and Photophysical
Properties of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons", Photochemistry and Photobiology, 1999, 70 (1): 10-34
bomba (W600) con un máximo de 3000 kPa y un mínimo de 250 kPa. El volumen de inyección fue
siempre de 20 µL.
Para el detector de fluorescencia se usó un “data rate” de 1pts/cc, PMT Gain de 200, con una constante
de tiempo de 1 segundo, en un barrido de 10 min. Se programaron 2 canales para longitudes de onda
de excitación y emisión; Channel A:275-350 nm, Channel B: 270-440 nm.
Se desarrolló inicialmente un método de separación cromatográfica para los 3 PAHs en estudio,
estableciéndose un programa con elusión por gradiente con un flujo de 1,2 mL/min de fase móvil a
35°C para cada inyección.
Tabla 2. Programa de elusión por gradiente.
Tiempo (min) %H20 %CH3CN
2 50 50
7,5 30 70
8 50 50

2.2 Procedimiento:

Curva de calibración

Se realizó una curva de calibración para la determinación del límite de cuantificación (LOC),
límite de detección (LOD) y linealidad de los métodos para HPLC-DAD y HPLC-FLD, para esto
se deben preparar cinco estándares utilizando patrones de los PAHs. Para el método HPLC-DAD
las concentraciones de los hidrocarburos utilizados fueron desde 0,1 hasta 0,5 µg/ml y en HPLC-
FLD desde 0,01 hasta 0,05 µg/ml.
Para realizar las curvas de calibración se preparó una solución de 500 (µg/ml) la cual contenía
Phe; Flt y Ace. Luego se preparó una solución intermedia de 50 (µg/ml) para así poder llevar a
cabo las diluciones utilizando siempre acetonitrilo para las distintas curvas de calibración.

Elección del solvente para la extracción dispersiva líquido-líquido


Para la optimización de la DLLME se emplearon solventes dispersantes utilizando cloroformo
como disolvente extractante.
Propuestas de solventes:
1. Cloroformo + EtOH en relación (1:3) en 5 mL H2O
2. Cloroformo + Acetonitrilo en relación (1:3) en 5 mL H2O
3. Cloroformo + MeOH en relación (1:3) en 5 mL H2O
Determinación de la exactitud y precisión de los procedimientos utilizados
Para el estudio de estos parámetros se siguieron dos procedimientos:
a) Microextracción Liquido-liquido dispersiva (DLLME)
Se preparó un triplicado de tubos cónicos de centrifuga los cuales contenían 5 mL de H2O,
posteriormente se añadieron 40 y 80 µL de una solución de los PAH´s en acetonitrilo de concentración
conocida (0,04 µg/ml de cada uno) para trabajar en dos niveles de concentración. Finalmente se
agregaron 500 µL de una mezcla cloroformo-EtOH en proporción 1:3. Luego de observar la
formación de una emulsión se centrifugaron los tubos por 15 min a 3500 rpm. Posteriormente se
recuperan con una jeringa HAMILTON entre 85 a 100 µL aproxidamente del solvente
correspondiente al extracto. Luego, el volumen que obtenemos se trasladó a un vial y se llevó a
evaporación con N2 (g) y finalmente se agregaron 2 mL con acetonitrilo para reconstituir. Las
determinaciones se realizaron mediante HPLC-DAD utilizando las siguientes longitudes de onda:
Ace 227,4 nm ; Phe 252 nm ; Flt 236 nm y HPLC-FLUO utilizando pares Exc/Em , los cuales
fueron 275/350 nm para Ace , Phe y 270/440 nm para Flt

b) Doble Microextracción Liquido-liquido dispersiva


Se realizó una doble extracción mediante el método DLLME para dos sets de triplicados a diferente
nivel de concentración. Para esto, se llevó a cabo una primera extracción, recuperando entre 60 a 100
L. Los volúmenes recuperados se trasladaron a viales previamente etiquetados. Luego, al solvente
restante del tubo de fondo cónico se añadió rápidamente 500 L de la mezcla cloroformo-EtOH,
recuperando entre 80-150 L del disolvente de extracción. Cada microgota se trasladó al vial
correspondiente de la primera extracción, para luego evaporar con N2 (g) y llevar a cabo una
reconstitución con 2 ml de acetonitrilo.Para una posterior dererminación en HPLC-DAD Y HPLC-
FLUO.
3. Resultados:

Tiempos de retención, pureza, cromatograma y espectros para DAD.

Tabla 3. Tiempos de retención promedio y longitud de onda para la cuantificación en


HPLC-DAD.

PAH Tiempo de retención [min] λ [nm]

Ace 8,36 227,5

Phe 8,82 252

Flt 10,29 236

La pureza e identidad de cada compuesto eludido se evaluó permanentemente mediante la


comparación con los espectros contenidos en una base de datos del software Empower. En donde
la biblioteca contenía los espectros UV de los PAHs en estudio lo que permitió efectuar un
contraste espectral permanente.

**Pantallazo**

Gráfico 1. Cromatograma de mezcla de Gráfico 2. Espectro de absorción de PAH’s


estándares de xxx ug/mL a una longitud analizados en HPLC-DAD
de onda de xxx, realizada en HPLC-DAD.
Curva de calibración. Linealidad, límites de detección y cuantificación.

Los resultados obtenidos experimentalmente muestran que la respuesta del equipo se


comporta de forma lineal en el rango de concentraciones estudiado.

250000

200000
Area (uV*sec)

150000

Ace
100000
Phe
Flt
50000

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Concentración (ug/mL)

Gráfico 3. Curva de calibración para soluciones de 0,1 - 0,5 μg/mL de Ace, Phe, y Flt en
HPLC-DAD.

Tabla 4. Valores de pendiente, intercepto y r2 para curvas de calibración HPLC-DAD 0,1-


0,5μg/mL
Analito. Pendiente Intercepto Valores de
correlación (r2)
Ace 433168 5595,8 0,995
Phe 293520 4053,4 0,995

Flt 253985 3237,1 0,994


25000

20000
Area (uV*sec)

15000
Ace
10000 Phe
Flt

5000

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Concentración (ug/mL)

Gráfico 4. Curva de calibración para soluciones de 0,01 - 0,05 μg/mL de Acenantreno (Ace),
Fenantreno(Phe), Floranteno (Flt), en HPLC-DAD.

Tabla 5. Valores de pendiente, intercepto y r2 para curvas de calibración HPLC-DAD 0,01-


0,05μg/mL
Analito. Pendiente Intercepto Valores de
correlación (r2)
Ace 460340 146 0,998
Phe 307430 355,1 0,997

Flt 274970 -30,5 0,971


Gráfico 5. Curva de calibración para soluciones de 0,01 - 0,05 μg/mL de Acenantreno (Ace),
Fenantreno (Phe), Floranteno (Flt), en HPLC-FLD.

Tabla 6. Valores de pendiente, intercepto y r2 para curvas de calibración HPLC-FLD 0,01-


0,05μg/mL
PHA. Pendiente Intercepto Valores de
correlación (r2)
Ace 57144260 51367 0,998

Phe 38938430 80334 0,995

Flt 48405510 69969 0,994

Adicionalmente, los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOC) para HPLC-DAD y


HPLC-FLD son mostrados a continuación en la tabla 7 y 8 respectivamente.
Tabla 7. Datos de LOD y LOC para HPLC-DAD.
DAD Ace Phe Flt
0,0326 0,0335 0,0371
LOD [ng/mL]
0,1085 0,1115 0,1237
LOC [ng/mL]
λ [nm] 227,4 252 236

Tabla 8. Datos de LOD y LOC para HPLC-FLD


FLD Ace Phe Flt
0,002 0,006 0,005
LOD [ng/mL]
0,007 0,002 0,001
LOC [ng/mL]
275/350 275/350 270/440
λ [nm]
Microextracción liquido-liquido dispersiva.

Tabla 9. Valores de concentración de cada PAH y coeficiente de variación en la extracción


de los tres PAH’s. para volúmenes de 40uL y 80uL
Ace Phe Flt Ace Phe Flt
40uL 0,029 0,049 0,044 80uL 0,121 0,141 0,139
40uL 0,033 0,036 0,031 80uL 0,066 0,082 0,082
40uL 0,028 0,050 0,044 80uL 0,073 0,081 0,077
Media 0,030 0,045 0,040 Media 0,087 0,102 0,099
Error Error
típico 0,0014 0,0044 0,0045 típico 0,0173 0,0139 0,0197
CV 4,795 9,799 11,372 CV 20,029 13,733 19,856

Posteriormente, con los datos de concentración se calculan los porcentajes de recuperación usando
la fórmula:
𝜇𝑔 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜𝑠
% 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = ( ) ∙ 100 (1)
𝜇𝑔 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠

Tabla 10. Porcentajes de recuperación en un volumen reconstituido de 2mL y sus


promedios.

MUESTRA Concentración Ace% Phe% Flt%


1 0,04 µg/ml 29,1 48,5 44,3
2 0,04 µg/ml 32,7 36,2 30,7
3 0,04 µg/ml 28,0 50,1 44,1
4 0,08 µg/ml 60,6 70,5 69,3
5 008 µg/ml 33,0 41,2 41,1
6 0,08 µg/ml 36,5 40,7 38,5
Promedio 0,04 µg/ml 29,9 44,9 39,7
Promedio 0,08 µg/ml 43,4 50,8 49,6

Para el cálculo del factor de enriquecimiento se utilizó la fórmula:


𝑪𝒇
𝑭𝑬 = (𝟐)
𝑪𝒊
Donde, Cf corresponde a la concentración extraída en la gota recuperada y Ci la concentración total
a recuperar.

Tabla 11. Valores de Factor de enriquecimiento para cada PAH y el factor de


enriquecimiento para una recuperación al 100%
FE con
Concentración. Tamaño recuperación
Triplicado ug/mL gota uL Ace Phe Flt al 100%
13,48
1 0,04 90 8.09 12,30 55,56
2 0,04 82 9,98 11,03 9,35 60,98
3 0,04 93 7,52 13,46 11,86 53,76
1 0,08 100 15,16 17,63 17,32 50,00
2 0,08 95 8,68 10,84 10,82 52,63
3 0,08 90 10,14 11,30 10,69 55,56

Doble microextracción liquido-liquido dispersiva.

Tabla 12. Valores de concentración de cada analito y coeficiente de variación para la doble
microextracción de los tres PAH’s. para volúmenes de 40uL y 80uL.

Ace Phe Flt Ace Phe Flt


0,0373 0,0455 0,0535 0,1190 0,1597 0,1277
40uL 80uL
0,0400 0,0581 0,0459 0,1101 0,1535 0,1239
40uL 80uL
0,0212 0,0039 0,0002 0,0778 0,1052 0,0829
40uL 80uL
0,0386 0,0518 0,0497 0,102 0,139 0,111
Media Media
Error Error 0,013 0,017 0,014
0,0143 0,006 0,004 típico
típico
12,255 12,230 12,613
CV 4,795 9,799 11,372 CV
Tabla 13. Porcentajes de recuperación de PAH para la doble DLLME en un volumen
reconstituido de 2mL y sus promedios.

MUESTRA Concentración Ace% Phe% Flt%


1 0,04 µg/ml 37,3 45,5 53,5
2 0,04 µg/ml 40,0 58,1 45,9
3 0,04 µg/ml 0,3 5,7 23,1
4 0,08 µg/ml 59,5 79,9 63,9
5 008 µg/ml 55,1 76,7 62,0
6 0,08 µg/ml 38,9 52,6 41,4
Promedio 0,04 µg/ml 38,6 51,8 49,7
Promedio 008 µg/ml 51,2 69,7 55,8

Discusión.
La composición de la fase móvil que se utilizó para la determinación de PAH en régimen
por gradiente se informa en la tabla 2. Este programa de elusión presento una adecuada
separación cromatográfica de los analitos de interés y permitió que fuera posible cuantificar
sin reportar complicaciones.
A partir de los datos de la tabla 1 se puede observar que los valores de Log Kow y de
solubilidad en agua son bastante diferentes para cada PAH estudiado, lo que permite que la
separación sea particularmente fácil a través de métodos cromatográficos y se traduzca en
valores de tiempo de retención distintos (tabla 3).
En la tabla 4 y 5 se observan los parámetros de calidad de la ecuación de regresión lineal
para la calibración en HPLC-DAD Los valores de R2 dan cuenta de un muy buen ajuste
lineal de los datos al modelo de regresión lineal.
Por otro lado, la tabla 6 arroja parámetros lineales obtenidos mediante la calibración por
HPLC-FLD presentando valores de pendiente hasta 100 veces mayores que los obtenidos
por HPLC-DAD dando cuenta de la elevada sensibilidad que posee el detector de
fluorescencia.
En las tablas 7 y 8 se muestran los límites de detección y cuantificación de acuerdo al
procesamiento estadístico de los datos, presentando valores relativamente cercanos en
algunos compuestos. Los valores obtenidos de acuerdo al procedimiento estadístico, en
general, contemplan el error estándar de la regresión que a su vez comprende errores
aleatorios provenientes de la preparación de patrones de calibración. También se puede
notar que los límites de cuantificación y detección para HPLC-FLD son menores que los
valores de HPLC-DAD, debido a que el LOD se define como la cantidad mínima de
sustancia que se puede detectar con fiabilidad por el método analítico estudiado y el LOC
se describe como la concentración más baja de analito en una muestra que puede ser
cuantitativamente determinado7.Debido a esto los limites de cuantificación y detección son
menores en FLD, ya que presenta mayor sensibilidad.
Por otra parte, en la tabla 9 y 10 se observan los valores de concentración y los porcentajes
de recuperación. Las muestras 2 y 4 no comparten valores con los de sus triplicados
respectivos lo que afecta directamente la precisión del método , esto se debe a errores
aleatorios cometidos en el proceso experimental.
De las tres opciones nombradas en el procedimiento se observó que el mejor disolvente de
dispersión es MeOH en una proporción que provee la mejor formación de la nube
dispersante mejorando la eficiencia de la extracción.

7
Richer D,Pablo (2017) Parámetros de calidad analitica
Conclusión.
Al utilizar detectores acoplados de arreglo de diodos y fluoresencia (DAD-FLD) nos
permitio obtener informacion completa de las resultados para poder complementar la
informción obtenida con ambos detectores.
La técnica de microextracción dispersiva liquido liquido ocupa varios solventes que es
basada en un sistema ternario,por lo que este proceso no favorece la utilizacion de la
quimica verde por los distintos solventes a utilizar , a pesar de que los volumenes utilizados
sean en escala de micro litros.

Bibliografía

1.- S. Moret, G. Purcaro. “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, General Overview”.


Elsevier. Diciembre, 2016
2.- Lista de agentes cancerígenos realizada por la agencia internacional para la
investigación del cáncer (IARC) [en línea] < https://monographs.iarc.fr/agents-classified-
by-the-iarc/> [consulta 12 agosto 2018)
3.- Hussein I. Abdel-Shafy a, Mona S.M. Mansou. “A review on polycyclic aromatic
hydrocarbons: Source, environmental impact, effect on human health and remediation”.
Egyptian Journal of Petroleum. 4 de Noviembre 2014
4.- K. Srogi, “Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons:
a review”
5.- Decreto Sanitario Nº 977, artículo 249. CHILE. Límites fijados de 8 PAHs de alta masa
molar y su prohibición a aceites y grasas comestibles en general. Ministerio de Salud,
Santiago, República de Chile 2003
6.- Dabestani, R.; Ivanov I. N., "Invited Review A Compilation of Physical, Spectroscopic
and Photophysical Properties of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons", Photochemistry and
Photobiology, 1999, 70 (1): 10-34
7.Richer D,Pablo (2017),Parametros de calidad analitica Commented [DILO(1]: Nose si esta bien citado es el
power point de analitica 2

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