MÉTODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACIÓN DE COLIFORMES Y E.

Coli I:

1. Introducción

Determinar la calidad higiénica sanitaria, y/o el grado de contaminación microbiana de una

muestra en particular, es de suma importancia para la prevencion de enfermedades
transmisibles. Para ello, se utilizan organismos indicadores de la contaminación bacteriana y
de la calidad higiénica a través de dos grupos bacterianos:
Coliformes
Enterococos

Estos indicadores, según Buttiaux y Mossel, deben poseer las siguientes propiedades:
1. Hábitat específico del medio intestinal.
2. Presentes en gran cantidad en las heces, para ser detectados en altas
concentraciones.
3. Resistentes a las condiciones ambientales extra-intestinales.
4. Detectables de forma fácil y completa.

E. coli y los coliformes son bacterias Gram negativas (coliformes), fermentadores de la lactosa
con producción de gas a 35ºC X 48 hrs y a 44.5ºC (coliformes fecales y E. coli).

2. Materiales y Métodos:

 Baño maría  Caldo Triptano

 Incubadora  Caldo MR. UP
 Balanza  Caldo de Citrato
 Pipetas estériles de 10 ml  Agar Peptanado al 0.1%
 Frascos de muestreo estéril  Reactivo de Kovac
 Frascos de diluciones  Reactiv de Voges-Pros Kouer
 Caldo Triptosa Lauril (LST)  Reactivo para Tinción Gram
 Caldo de Bilis Lactosa Verde
Brillante (BGLB)
 Caldo EC
 Agar EMB
 2.1. Prueba Presuntiva para detección de bacterias coliformes totales

1. Añadir 10 ml e muestra de agua a un frasco de dilución con 90 ml de agua

peptona al 0.1%, homogeneizar.
2. Preparar las siguientes diluciones añadiendo 1 ml de la dilución 1:10 a un
tubo con 9 ml de agua peptonada (10-2) y así sucesivamente (10-3, 10-4,
etc.).
3. Transferir 1 ml de cada dilución a un juego de 5 tubos con 10 ml. del Caldo
Triptosa Lauril Sulfato (LST).
4. Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs.

Reportar como resultados positivos la turbidez y presencia de gas en el vial de

fermentación (tubos Durham). En caso de agua potable, leer como positivo la presencia
de turbidez.

2.2. Prueba confirmativa para detección de coliformes totales

1. De los tubos positivos del Caldo Triptosa Lauril Sulfato (LST), transferir un
inóculo a los tubos con 10 ml. de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante (BGLB).
2. Incubar a 35ºC por 24 a 48 hrs y proceder a reportar sus resultados.
3. Calcular el número más probable (NMP) con la tabla.
Figura 1.- El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el
factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo y los otros,
ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas
(en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el número más probable de células estadísticamente (11,0) en la
primera de las tres diluciones, mediante una tabla de números más probables (Tabla 8.6). Este valor,
multiplicado por el factor de dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.

2.3. Determinación de coliformes fecales y confirmación de e. coli

1. Agitar suavemente cada tubo de LST que produce gas CO2, puede usarse también
tubos de BGLB gas positivo) y transferir una asada al tubo de caldo EC e incubar a
44.5 o 45.5ºC por 24 a 48 hrs. y proceder a realizar su lectura con la ayuda de la tabla
del NMP.
2. Sembrar por el método del estriado a partir de cada tubo que produce gas sobre el
agar L-EMB e incubar por 18 a 24 hrs a 35ºC.
3. Transferir colonias sospechosas de cada placa EMB (ver fig.) a caldos de cultivos
para realizar los estudios morfológicos y bioquímicas. Incubar por 18 a 24 hrs a 35ºC.
4. Realizar la tinción de Gram. Examinar todos los cultivos que aparezcan como bacilos
cortos o cocos Gram negativos para las siguientes pruebas bioquímicas.
Producción de Indol:
Inocular un tubo de Caldo Triptona e incubar por 24  2 hrs a 35ºC.
Detectar la presencia de Indol añadiendo 0.2 – 0.3 ml de Reactivo de Kovac.
La aparición de un color rojo en la capa superior, significa que el resultado de prueba
es positivo.
Voges Proskauer (VP):
Producción del ACETIL METIL CARBINOL.
Inocular un tubo de caldo MR – VP e incubar por 48  2 hrs a 35ºC.
Transferir 1 ml a un tubo de 13 x 100 mm.
Añadir 0.6 ml de solución alfa-naftal y 0.2 ml 40% de KOH y agitar.
Añadir unos cuantos cristales de creatina.
Agitar y dejar reposar por 2 hrs.
La prueba es positiva si se desarrolla un color rosado de eosina
Rojo de Metilo (RM):
Incubar el tubo de MR – VP por 48  2 hrs, adicionales a una temperatura de 35ºC
después de la prueba VP.
Añadir 5 gotas de la solución Rojo de Metilo a cada tubo.
El color rojo indica que la prueba es positiva; el amarillo que la reacción es negativa.
Citrato:
Inocular a un tubo de Caldo de Citrato.
Incubar a 96  6 hrs a 35ºC.
El desarrollo de una turbidez distinta significa que la reacción es positiva.
INTERPRETACIÓN

IMViC: ++-- ó -+--  E. Coli

(Biotipo 1) (Biotipo 2)

--++ Enterobacter
aerógenes

3. Resultados:

Microorganismo NMP/100ml NMP/ 100ml (según normatividad)

Coliformes Totales
Coliformes termo tolerantes

4. Discusiones y Conclusión:
5.- Recomendaciones: