Universidad Autónoma De Santo Domingo

(UASD)
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Asignatura
Laboratorio de Hematología

Profesora:
Ynelda Díaz Cáceres
Tema:
Automatización en HEMATOLOGIA

Sustentantes:

Margarita Feliz Montero

Carolin García López
Patricia Soriano Pérez
Altagracia Jiménez

Santo Domingo, Rep. Dom.

05 de septiembre del 2018
 Introducción
En el siguiente trabajo hablaremos sobre la automatización en el área de hematología,
de su historia, y de las evoluciones que ha tenido dicha especialidad en nuestra era,
además nos proponemos conocer acerca de algunos aparatos utilizados hoy día en
hematología.

El hemograma es uno de los exámenes del laboratorio mas solicitado y forma parte del
estudio básico requerido para la orientación diagnostica y la evaluación de los
pacientes.

Esta prueba con el paso del tiempo se ha ido modificando, desde los métodos
tradicionales hasta los más novedosos y de tecnología avanzada.

Con este trabajo nos proponemos dar a conocer un poco acerca de los métodos
utilizados en los laboratorios de nuestro país, así como de los equipos utilizados.
Esperando que este sirva de guía para los estudiantes.
 Automatización

Mecanizar todo o la mayoría de los pasos manuales en proceso o en todo el

procedimiento.

Es una solución que combina varios procesos en un solo sistema eficiente que elimina
el riesgo de error asociado a la operatividad humana. Las tarea intensivas de trabajo:
etiquetado, manejo, preparación, y almacenamiento de las muestras, que se realizan
utilizando numerosos personal, cada uno de los cuales pueden introducir errores u
otros problemas.

Principios básicos de automatización:

 Impedancia electrónica
 Radiofrecuencia
 Dispersión óptica

Fundamentos Tecnológicos y sistemas Analíticos en el Recuento automatizado

de las células sanguíneas

La mayoría de los instrumentos utilizados son totalmente automatizados, es decir las

mediciones se realizan a partir de sangre entera sin necesidad de que el operador la
diluya en forma manual. En efecto, con el fin de garantizar un manejo seguro, la
mayoría de los instrumentos cuenta con dispositivos que atraviesan la tapa del tubo de
colecta de sangre, de modo que el operador no tiene que quitarla. También es común
que los instrumentos mezclen las muestras de sangre antes de que las mismas sean
incluidas en el análisis.

El desarrollo del proceso de automatización en el laboratorio clínico fue discreto

durante los siglos XVIII, XIX y primera mitad del XX. Los primeros reportes sobre el
conteo de células hemáticas datan del año 1794, cuando utilizando un dispositivo de
lentes rudimentarias se realizó la primera descripción precisa de los glóbulos rojos. Más
tarde, en el siglo XIX, se pudieron observar las plaquetas y diferenciar las
subpoblaciones leucocitarias mediante la tinción con anilinas. El primer método para el
recuento electrónico de células sanguíneas fue publicado en 1934; en esta técnica el
conteo se realizaba mediante la detección foteléctrica de la luz dispersada.

Los primeros contadores celulares, aunque constituyeron un avance importante, solo

eran capaces de realizar conteos electrónicos globales de eritrocitos y menos
satisfactoriamente, de leucocitos; no obstante, marcaron la ruta para la innovación y
perfeccionamiento de varias generaciones de estos equipos. El surgimiento y desarrollo
de los programas informáticos, los ordenadores, la robotización, la mecanización y
diversos métodos de detección, entre otras tecnologías, han contribuido al aumento de
las potencialidades de estos equipos.

Los primeros contadores hematológicos fueron semi- automatizados; esto era así
porque la preparación de una dilución adecuada era una operación manual y el
instrumento entonces, aspiraba la dilución ya preparada. Sin embargo, a fines de la
década del 60 se dispuso de instrumentos totalmente automatizados, que aspiraban
muestras de sangre entera y llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir y aislar
las células a ser contadas.

Los primeros contadores fueron descriptos por Coulter7 y Crosland-Taylor8, quienes

adoptaron diferentes enfoques para limitar el
volumen en la zona censora y realizar el
recuento.
En el instrumento descripto por Coulter7, las
células son conducidas a través de un estrecho
orificio, detectándose los cambios de
impedancia.

La impedancia es efectivamente medida en la

zona censora situada entre los electrodos
colocados a ambos lados del orificio. Así, las
células funcionan como aislantes frente a los diluyentes salinos, de modo que la
impedancia aumenta transitoriamente a medida que las células pasan a través de la
zona censora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos eléctricos
que pueden ser contados.

Estos instrumentos han sido llamados contadores de apertura-impedancia.

El instrumento descripto por Crosland-Taylor8 se
basaba en hacer que las células pasen a través
de un delgado haz de luz. La zona censora
estaba restringida parcialmente por la estrechez
del haz de luz y por el pasaje de células en una
corriente de líquido muy delgada. A medida que
las células pasan a través de la zona censora,
interceptan el haz de luz que se dispersa,
pudiendo ser colectada por un sistema óptico
adecuado y medida por un fotómetro.

Los aumentos transitorios en la luz dispersada

crean impulsos desde el fotómetro, que luego pueden ser contados electrónicamente,
por ello estos sistemas son llamados contadores de dispersión de luz.

Los primeros contadores hematológicos fueron semi- automatizados; esto era así
porque la preparación de una dilución adecuada era una operación manual y el
instrumento entonces, aspiraba la dilución ya preparada. Sin embargo, a fines de la
década del 60 se dispuso de instrumentos totalmente automatizados, que aspiraban
muestras de sangre entera y llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir y aislar
las células a ser contadas.

Los primeros contadores fueron descriptos por Coulter7 y Crosland-Taylor8, quienes

adoptaron diferentes enfoques para limitar el
volumen en la zona censora y realizar el
recuento.
En el instrumento descripto por Coulter7, las
células son conducidas a través de un estrecho
orificio, detectándose los cambios de
impedancia.

La impedancia es efectivamente medida en la

zona censora situada entre los electrodos
colocados a ambos lados del orificio. Así, las
células funcionan como aislantes frente a los diluyentes salinos, de modo que la
impedancia aumenta transitoriamente a medida que las células pasan a través de la
zona censora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos eléctricos
que pueden ser contados.

Estos instrumentos han sido llamados contadores de apertura-impedancia.

El instrumento descripto por Crosland-Taylor8 se
basaba en hacer que las células pasen a través
de un delgado haz de luz. La zona censora
estaba restringida parcialmente por la estrechez
del haz de luz y por el pasaje de células en una
corriente de líquido muy delgada. A medida que
las células pasan a través de la zona censora,
interceptan el haz de luz que se dispersa,
pudiendo ser colectada por un sistema óptico
adecuado y medida por un fotómetro.

Los aumentos transitorios en la luz dispersada

crean impulsos desde el fotómetro, que luego
pueden ser contados electrónicamente, por ello estos sistemas son llamados
contadores de dispersión de luz.
En la actualidad, la mayoría de los instrumentos hacen esto en forma automática y
luego hacen las diluciones con exactitud, generalmente por medio de sistemas basados
en jeringas calibradas. El segundo requerimiento es más difícil de lograr en un
instrumento automatizado. La mayoría de los fabricantes han elegido medir los
recuentos por unidad de tiempo en lugar de la unidad de volumen de dilución. Por lo
tanto, tales sistemas tienen que ser calibrados para convertir los recuentos por unidad
de tiempo a recuentos por unidad de volumen. El tercer requerimiento es de dificultad
intermedia. Puede parecer excesivo afirmar que las células deben ser contadas una
vez, pero el problema es que en el recuento pueden subestimarse si van a través de la
zona censora, casi al mismo tiempo, que otra célula. Este problema, que se denomina
coincidencia surge del tiempo muerto en la electrónica del instrumento y por lo general
puede ser corregido con un algoritmo matemático adecuado, construido dentro del
microprocesador del contador hematológico.

Decir que las células deben contarse sólo una vez parece igualmente excesivo, pero el
problema es que en los contadores de apertura-impedancia simple sin flujo laminar, las
células podrían re-circular dentro del orificio.

Esas células re-circulantes pueden hacer una contribución mínima al recuento aún
cuando ellas tienden a producir impulsos más pequeños que las células que pasan a
través del orificio. Sin embargo, los eritrocitos que re-circulan en esta forma causan
señales en el rango de plaquetas y dificultan los recuentos de plaquetas, a menos que
haya sistemas de flujo de barrido ubicados en la parte posterior del orificio que
prevengan la recirculación.

Metodología empleada en las determinaciones de un Estudio

Sanguíneo Básico (HEMOGRAMA)

 Concentración de Hb
Es él método más uniforme en todos los instrumentos y presenta dos opciones de uso
común.

La primera es convertir la hemoglobina en cianometahemoglobina (HiCN) y luego medir

la absorbancia alrededor de 540 nm. En la práctica, sin embargo, el tiempo del ciclo de
los instrumentos disponibles en el mercado es tan corto que puede impedir que la
conversión total se produzca por completo y que los derivados intermedios sean
medidos.

La conversión a HiCN requiere el uso de un reactivo tipo Drabkin, que contiene cianuro
de potasio y ferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente residual del instrumento
puede no cumplir con los estándares ambientales en algunos países. Los métodos
alternativos -libres de cianuro- para la medición de la Hb, que usan la urilsulfato de
sodio (LSS), han sido introducidos en algunos instrumentos. Los resultados parecen
compararse bien con los métodos deHiCN9. Estos métodos no cianamidas, además de
ser más seguros, son también promisorias en cuanto a futuras mejoras en la calibración
y validación de nuevas mediciones de Hb. El método de LSS introducido por Sysmex,
parece ser de iguales características a las del método de referencia y es un avance
significativo para bajar la turbidez y permitir un rápido análisis automatizado.

 Eritrocitos
Por lo general, el recuento de eritrocitos se realiza sobre diluciones de sangre entera
con un umbral adecuado para discriminar entre grandes plaquetas y pequeños
eritrocitos.

Muchos sistemas no tienen un umbral superior para discriminar grandes eritrocitos de

pequeños leucocitos, pero los números relativos de los dos tipos de células indican que
esto no suele ser un problema.

 Indices eritrocitarios
Aunque todos los contadores hematológicos automatizados miden el volumen
corpuscular medio (VCM), hay otros factores importantes que afectan las mediciones,
según sean hechas por los instrumentos de apertura-impedancia o por los de
dispersión de luz. Debido a que ninguna tecnología es perfecta, varios fabricantes han
intentado resolver los problemas, pero lo han hecho, con frecuencia, en diferente
forma.

La dificultad fundamental, que ya ha sido mencionada, es que el impulso producido por

cualquier célula es sólo una aproximación proporcional al volumen de la célula. Los
impulsos aberrantes, que no representan verdaderamente el tamaño de la célula,
pueden ocurrir en cualquier contador, pero con frecuencia estos impulsos tienen una
característica inusual que les permite ser identificados por circuitos electrónicos
adecuados y procesados de modo que no afecten la magnitud del impulso promedio
que se utiliza como medición de VCM. En los contadores de apertura-impedancia sin
flujo laminar, hay una necesidad adicional de tratar los impulsos, ya que en tales
instrumentos las células que pasan cerca del borde del orificio deben ser ignoradas
porque producen impulsos más grandes que las células que pasan en el centro del
orificio. Afortunadamente, esas células tienen un tiempo de pasaje más largo a través
del orificio, debido a que el flujo es más lento en el borde.

Los impulsos que ellas producen son por lo tanto tan largos que deben y pueden ser
procesados. Dos células que atraviesan juntas también producen un pulso
sobredimensionado, pero de igual modo es tan largo, que puede ser procesado.

En relación a los eritrocitos, el aspecto más serio, de corrección más dificultosa, es que
el VCM tiende a ser subestimado cuando la concentración de Hb corpuscular media
(CHCM) real, medida manualmente, es reducida. Los fabricantes han adoptado
diferentes técnicas para obviar el problema. Estas han servido para reducir la magnitud
del efecto aunque en ninguna instancia ha sido eliminado totalmente.
Debido a que los índices eritrocitarios se relacionan entre sí de acuerdo con lo
siguiente:

 VCM
 HCM
 CHCM

Puede observarse que un VCM sub estimado causará una CHCM sobres timada. Por
esto, con los modernos contadores sanguíneos, rara vez se observa que la CHCM
descienda marcadamente en la deficiencia de hierro severa, como sucede cuando las
mediciones de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y la CHCM se calcula
usando la fórmula:

 Hematocrito centrifugado
 Hemoglobina
 CHCM

Con los sistemas de apertura-impedancia hay una explicación simple para la

subestimación del VCM, cuando la CHCM es baja y está relacionado con el hecho de
que la CHCM determina la viscosidad interna del eritrocito y, como consecuencia, a su
forma, cuando pasa a través del orificio del contador. Las fuerzas de corte del fluido en
el orificio son tales que el eritrocito adopta una forma de cigarro, pero cuando la
viscosidad interna se reduce, la forma del eritrocito se vuelve similar a un cigarro más
largo y delgado y crea un impulso más pequeño de lo que debiera (subestimación del
volumen). Esto es conocido como el efecto del factor forma.

A excepción de los equipos de Bayer, todos los demás calculan los índices en función
de la medición del tamaño celular de las células por apertura-impedancia luego de
diluirlas en un medio isotónico. Con el fin de minimizar estos efectos, hay sistemas de
dispersión de luz en los que se trata el eritrocito para que tome la forma esférica y las
células son fijadas antes de su entrada a la zona censora.

 Reticulocitos
Los recuentos de reticulocitos teñidos con varios colorantes pueden realizarse en un
instrumento automatizado, diseñado para ese propósito, tal como el Sysmex R3000, o
en un citómetro de flujo convencional.

Recientemente otros contadores hematológicos han incorporado una opción de

recuento de reticulocitos, en los que éstos deben ser coloreados de modo
independiente y luego son introducidos dentro del contador para su análisis. En el caso
de mediciones hechas con colorantes fluorescentes, de acuerdo con la intensidad de
fluorescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tres sectores que representan
estadios diferentes de maduración.

El estadio más joven, muy fluorescente, es un indicador temprano de recuperación, que

aparece antes de un recuento de reticulocitos total elevado.
Un alto recuento de elementos muy fluorescentes es un indicador de recuperación
medular después de, por ejemplo, un trasplante de médula ósea (TMO) o de la
administración de eritropoyetina exógena.

Actualmente, se pueden hacer los recuentos sin necesidad de coloración manual, ya

que están totalmente automatizados. Sysmex fue el primero en introducir un colorante
fluorescente (Automune-O) detectado por citometría de flujo, en tanto que otros como
BeckmanCoulter usan el nuevo azul de metileno. Este último método es menos preciso
porque es más dificultoso estandarizar la coloración y porque los cuerpos de Howell-
Jolly pueden interferir. Bayer usa la oxazina-750 en el canal de luz láser de helio-neón y
esta determinación se integra con las determinaciones del ancho de la distribución del
volumen eritrocitario (RDW) y el contenido de Hb, con lo cual se obtienen los índices
celulares reticulocitarios.

Estos parámetros de inmadurez reticulocitaria, que actualmente tienen un uso limitado,

pueden ser usados para estimar la reducción de la vida media eritrocitaria y mejorar el
tratamiento de una variedad de anemias, en la recuperación pos quimioterapia y en el
TMO.

 Plaquetas
Estas células pueden contarse sobre la misma dilución de sangre entera usada para el
recuento de eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superior para eliminar pequeños
eritrocitos y un umbral inferior para discriminar del ruido electrónico y los restos
celulares.

Estos umbrales simples son adecuados, siempre y cuando el instrumento tenga flujo
laminar, y vale tanto si se usa apertura-impedancia como dispersión de luz para su
detección. Sin embargo, si no se usa flujo laminar –opcional para los contadores de
apertura-impedancia y obligatorio para contadores de dispersión de luz– hay
demasiado solapamiento entre las señales de ruido o los residuos y la de los eritrocitos
pequeños para que el recuento sea efectivo, entre los umbrales inferior y superior.

Bajo estas circunstancias es necesario ajustar una curva de distribución teórica al

histograma de volumende plaquetas y extrapolar el recuento de plaquetas a partir del
área bajo la distribución teórica.

Recientemente, se han ampliado los diferentes tipos de métodos empleados por los
distintos fabricantes.

Estos nuevos sistemas han sido importantes porque se sabe que el recuento de
plaquetas con un solo parámetro tal como la impedancia, tiene una tendencia a
sobreestimar el recuento verdadero de plaquetas, que es importante en las
trombocitopatías y en el manejo de pacientes trombocito pénicos.
Por otra parte, esto es importante en el caso de tener que hacer recuentos elevados de
plaquetas, en pacientes con trombocitosis y en el control de calidad.
Una limitación actual es la imposibilidad de distinguir plaquetas de fragmentos celulares
y restos celulares. Es importante también la capacidad de reconocer plaquetas de
mayor tamaño, que suelen estar excluidas de los algoritmos de recuentos de plaquetas.
Los fabricantes trataron de resolver esto de diferentes formas Algunos fabricantes
resuelven esto con métodosópticos y por impedancia y si no hay concordanciatiene la
alternativa de usar un método inmunológicoautomatizado con un anticuerpo monoclonal
contrala glicopropteínagpIIIa, que es una gp presente sólo en plaquetas (Abbott). Otros
usan un método de impedanciasin umbral fijo y los resultados correlacionanbien con el
método de referencia, pero conmenor frecuencia de alarmas con relación a otros
contadoresque tienen umbrales fijos (Sysmex).También se desarrolló un sistema de
medidabidimensional en el cual se mide tanto el volumencomo el índice de refracción
de cada una de las células (Bayer). Esto tiene una gran capacidad de
discriminaciónentre plaquetas, eritrocitos y partículas contaminantes.

Esta tecnología altamente novedosa es, a la vez, muy confiable. Además brinda otros
parámetros como el VPM, el ancho de la distribución del volumen plaquetario (PDW), el
plaquetocrito y el componente plaquetario medio (CPM), mediciones éstas cuyo valor
clínico aún está en discusión.

 Recuento total y diferencial de glóbulos blancos

El examen mediante microscopía óptica de un frotis teñido de sangre periférica para
evaluar la morfología de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y la generación del
recuento diferencial de leucocitos aún hoy resulta cruciales para el diagnóstico de
enfermedades hematológicas1. Estos procedimientos, además de la determinación de
recuentos celulares en la sangre, tradicionalmente han sido las funciones principales de
un laboratorio de Hematología. Sin embargo, el recuento diferencial visual se reconoce
como una de las tareas de labor más intensa en el laboratorio. Para lograr buena
ejecución se requiere un personal bien preparado y muy motivado. A pesar de su
honroso papel en el diagnóstico de enfermedades hematológicas, estas mediciones
están plagadas de errores. El papel del examen visual de frotis sanguíneos sigue
siendo importante en el laboratorio clínico, ya que los analizadores hematológicos
automáticos pueden rechazar un alto porcentaje de muestras consideradas como
anormales que deben evaluarse visualmente.

Los glóbulos blancos totales no pueden contarse en diluciones simples de sangre

entera porque el número proporcionalmente elevado de eritrocitos los enmascararían.
Deben agregarse, por lo tanto, reactivos adecuados para lisar los eritrocitos de modo
que los leucocitos remanentes puedan ser discriminados de cualquier resto de
eritrocitos. En los sistemas de dispersión de luz también puede ser necesario añadir
compuestos para filtrar el resto, causante de interferencia óptica. Con los primeros
sistemas, se usaban agentes líticos muy fuertes, que removían la mayoría del
citoplasma del leucocito, de modo que en realidad lo que se evaluaba eran los núcleos.
Más recientemente, sin embargo, se utiliza una lisis más suave para proteger tanto
como sea posible la arquitectura celular, de modo que pueda ser usada como base
para el recuento diferencial de leucocitos.
 Conclusión

Al finalizar este trabajo pudimos conocer un poco más el área de hematología, y de

cómo se trabaja diariamente con las muestras que recibe el laboratorio, además de que
nos percatamos como el hemograma automatizado ha simplificado en muchos
aspectos el trabajo de las bioanálistas, aunque todavía hay ciertos parámetros a
mejorar.

Esperamos que este trabajo haya cumplido con los requerimientos perseguidos en el
principio de la práctica.