Slide 2 UVOD

-Kumarini zauzimaju važno mjesto u svijetu prirodnih produkata kao i u organskoj sintezi
-Proučavanje kumarina započelo je prije 200 godina, a prvi put kumarin je izoliran iz biljke
Coumarouna odorata Aube (Dipteryx odorata) 1820. g., po kojoj je i dobio ime (kumarú je naziv
za drvo na jeziku južnoameričkih indijanaca iz Francuske Gvajane)
- Kumarin je hemijski spoj koji se nalazi u mnogim biljakama, naročito u tonka sjemenkama,
lazarkinji i bizonskoj travi , kao i u gospinoj travi, jagodama, marelicama, višnji, cimetu, slatkoj
djetelini
- Kumarin je kristalni bijeli prah poznat po ugodnom mirisu na vaniliju, koji neki autori
karakteriziraju i kao miris na svježe pokošeno sijeno
-Kumarini pripadaju porodici laktona koji imaju benzopironski sistem. Kumarin je poznat kao
2H-hromen-2-on, 2H-1-benzopiran-2-on, 1,2-benzopiron, lakton cis-o-kumarinske kiseline,
kumarinski anhidrid, o-hidroksicimetna kiselina-lakton i 2-okso-1-benzopiran
Kumarini spadaju u klasu fenolskih supstanci nađenih u biljkama i sastoje se od spojenog
benzena i α-pironskog prstena (Slika 1)

Slide 3 UVOD
-Biosinteza kumarina se odvija preko cimetne i p-kumarinske kiseline gdje dolazi do uvođenja
hidroksilne grupe u orto položaj u odnosu na bočni lanac cimetne kiseline. Na kraju dolazi do
spontanog zatvaranja prstena i stvaranja kumarinske strukture
- Kumarini se klasično mogu sintetizirati Perkinovom, Pechmannovom ili Knoevenagelovom
reakcijom.
- Nedavno, za sintezu ovog tipa heterociklusa primijenjene su i Wittigova, Kostanecki-
Robinsonova, te Reformatsky reakcija
-Kumarin i njegovi derivati privukli su mnogo pažnje zahvaljujući širokom spektru
farmakoloških djelovanja. Neki od tih djelovanja su antitumorsko, antikoagulacijsko,
protuupalno, antibakterijsko te anti-HIV djelovanje. U klinici se kumarinski derivati koriste kao
antikoagulansi te u terapiji reumatoidnog artritisa. Važna su tema istraživanja zbog različitih
učinaka na bolesti i manje štetnosti za normalne stanice. Njihovo fiziološko, bakteriostatsko,
antioksidativno, antitumorsko djelovanje kao i sva ostala farmaceutska svojstva svrstavaju
kumarine u novu klasu spojeva terapeutske primjene
Slide 4 UVOD
- Eskuletin je kumarinski derivat, prirodni lakton koji nastaje intramolekulskom ciklizacijom
derivata cimetne kiseline
Ovaj spoj se koristi u nekim kremama za sunčanje, ali postoje dokazi da djeluje kao
fotosenzibilizator za oštećenje DNA.
-Eskulin je kumarinski glikozid eskuletina koji se nalazi u divljem kestenu i korijenu maslačka.
Kao lijek ponekad se koristi kao vazoprotektivno sredstvo. Također se koristi u mikrobiološkim
laboratorijima za pomoć u identifikaciji bakterijskih vrsta
-4-Metilumbeliferon je lijek koji se koristi u terapiji žuči. Koristi se kao antispazmolitički lijek
te kao standard za spektofluorimetrijsko određivanje enzimske aktivnosti

Slide 5 UVOD
-S obzirom na relativno veliki broj mjesta supstitucije na kumarinu, poznato je mnogo derivata
kumarina te je to razlog velikom broju podjela, odnosno klasifikacije kumarina.
-Općenito, kumarini se mogu podijeliti na jednostavne i složene kumarine.
-Detaljnijom klasifikacijom, s obzirom na supstituente na kumarinskoj jezgri koji mogu biti
različiti heterociklusi, dijele se na: jednostavne kumarine, furanokumarine,
dihidrofuranokumarine, piranokumarine (linearni i angularni), fenilkumarine i bikumarine.
Slide 6 UVOD
- Kumarin se koristi kao sredstvo za fiksiranje i pojačavanje u parfemima, dodaje se sapunu i
deterdžentima, pasti za zube, duhanskim proizvodima i nekim alkoholnim pićima
- Kako se često koristi kao mirisno sredstvo sadržaj kumarina u kozmetičkim proizvodima
reguliran je zakonom EU, koji zahtijeva označavanje na proizvodima ukoliko je kumarin
prisutan u količini većoj od 10 ppm u proizvodima koji se zadržavaju na koži i 100 ppm u
proizvodima koji se ispiru s kože.
- Kumarin često nalazimo u duhanskim proizvodima i umjetnim dodacima za vaniliju, iako je u
mnogim zemljama zabranjen kao dodatak hrani od sredine 20-og stoljeća, jer je umjereno
toksičan za jetru i bubrege
- Zasad su neki kumarini, kao varfarin, acenokumarol, armilarizin A, metilumbeliferon i
karbohromen odobreni za kliničku upotrebu
- Novobiocin i hlorobiocin (Slika 14) su antibiotici prirodnog porijekla na bazi kumarina koji se
ubrajaju u hidroksilirane kumarine , a inhibiraju DNA girazu (tip II topoizomeraza) i pokazuju
široki spektar aktivnosti prema Gram pozitivnim bakterijama, uključujući i Staphylococcus vrste
otporne na meticilin
- Glavni izvor kumarina u alkoholnim pićima je Hierochloe odorata, koja se koristi kao aroma u
specifičnim vrstama votke, takozvane Subrowke koja je proizvedena u istočnoj Evropi
-Za hranu i pića uopćeno, maksimalan nivo je 2 mg/kg, sa izuzetkom specijalnih karamela i
alkoholnih pića za koje je maksimum 10 mg/kg. Važno je napomenuti da se kumarin ne smije
dodavati kao takav hrani i pićima. Njegovo prisustvo može biti samo od prirodnih aroma, s tim
da se vodi računa da se ne pređe maksimalano dozvoljeni nivo
Slide 7 CILJ RADA
-Određivanje sadržaja ukupnih kumarina u izabranim uzorcima votke spektrofluorimetrijskom
metodom izraženih kao ekvivalenti eskuletina i 4-metilumbeliferona
-Specifični zadaci su bili:
Sinteza 4-metilumbeliferona;
Ispitivanje fluorescencijskih karakteristika eskuletina, 4-metilumbeliferona kao i
njihove smjese;
Snimanje spektara ekscitacije i emisije i određivanje maksimalnih talasnih dužina;
Konstruisanje kalibracionih krivih eskuletina i 4-metilumbeliferona ;
Određivanje sadržaja ukupnih kumarina u uzorcima votke;
Poređenje rezultata sa literaturnim podacima

Slide 8 EKSPERIMENTALNI DIO

Predmet istrazivanja ovog rada su različiti uzorci komercijalnog alkoholnog pića, vodke.
A to su : Uzorak 1- Votka 1906, Uzorak 2- Vigor , Uzorak 3 – Absolut, Uzorak 4-
Cosmopolitan, Uzorak 5- Beefeater, Uzorak 6- Smirnoff Classic, Uzorak 7- Smirnoff Ice

Slide 9 EKSPERIMENTALNI DIO

 Sinteza 4-metilumbeliferona je provedena Pechmanovom kondenzacijom iz rezorcinola i
etilacetoacetata uz sulfatnu kiselinu kao katalizator.
 Prekristalizacija je provedena iz 96%-otnog etanola
Slide 10 REZULTATI I DISKUSIJA
-Za pronalazak talasnih dužina ekscitacije i emisije snimljen je spektar 4-metilumbeliferona i
eskuletina u području talasnih dužina ekscitacije (200-800 nm) i emisije (200-900 nm) uz otvor
pukotine 2,5 i brzine snimanja 500 nm/min.
-Na Slici 1 prikazan je ekscitacijsko-emisijski spektar 4-metilumbeliferona koncetracije γ = 0,04
µg/mL sa maksimumima intenziteta fluorescencije na talasnim dužinama ekscitacije 331 nm i
emisije 397 nm.

-Na Slici 2 prikazan je ekscitacijsko-emisijski spektar eskuletina koncetracije γ = 1 µg/mL sa

maksimumima intenziteta fluorescencije na talasnim dužinama ekscitacije 346 nm i emisije 446
nm.

Slide 11 REZULTATI I DISKUSIJA

-Na slici 3 je prikazan ekscitacijsko-emisijski spektar smjese 4-metilumbeliferona i eskuletina
(smjesa 1 x10-3 mg/mL eskuletina i 1 x10-6 mg/mL 4-metilumbeliferona).
-Maksimumi talasnih dužina ekscitacije i emisije smjese 4-metilumbeliferona i eskuletina su na
350 i 445 nm. Iz ovog možemo zaključiti da nije moguće određivati ove dvije komponente u
smjesi iako se maksimumi talasnih dužina ekscitacije i emisije 4-metilumbeliferona i eskuletina
razlikuju kada su te komponente snimljene pojedinačno.

Slide 12 REZULTATI I DISKUSIJA

-Kalibracione krive 4-metilumbeliferona i eskuletina pripremljene su snimanjem različitih
koncentracija od 1x10-5-1x10-3 μg/mL na talasnim dužinama ekscitacije i emisije 331-397 nm za
4-metilumbeliferon i 346-446 nm za eskuletin uz otvor pukotine 15 i uz filter 1% T.

Slide 13 REZULTATI I DISKUSIJA

-Kalibracione krive 4-metilumbeliferona i eskuletina (uz sve otvorene filtere) pripremljene su
snimanjem različitih koncentracija od 5x10-4-1x10-1 μg/mL na talasnim dužinama ekscitacije i
emisije 331-397 nm za 4-metilumbeliferon i 346-446 nm za eskuletin uz otvor pukotine 7,5 i 2,5.

Slide 14 REZULTATI I DISKUSIJA

-Uzorci votke, bez razblaživanja, su snimani na talasnim dužinama ekscitacije i emisije 4-
metilumbeliferona i eskuletina 331-397 nm i 346-446 nm.
Za 1%T
-Može se zaključiti da je u svim uzorcima votke sadržaj ukupnih kumarina izražen kao
ekvivalent eskuletina u odnosu na ekvivalente 4-metilumbeliferona viši, s tim da uzorak 7
(Smirnoff Ice) pokazuje najvišu koncentraciju ukupnih kumarina, 1,191 x10-1 μgEESQ/mL i
9,744 x10-2 μgE4MUB/mL.
-Najniži sadržaj ukupnih kumarina izraženih kao ekvivalenti 4-metilumbeliferona pokazao je
uzorak 3 (Absolut) 4,740x10-4 μgE4MUB/mL, a ekvivalenti eskuletina uzorak 2 (Vigor)
koncentracije 1,489 x10-3 μgEESQ/mL. U uzorku 1 (Votka 1906) nisu detektovani kumarini
snimanjem uzorka na talasnim dužinama za 4-metilumbeliferon uz 1%T.
Za otvorene filtere
-Može se zaključiti da je u uzorku 7 (Smirnoff Ice) najveća koncentracija ukupnih kumarina u
poređenju sa ostalima (7,176 x10-2 μgE4MUB/mL i 1,117 x10-1 μgEESQ/mL), baš kao i u
prvobitnom snimanju pri 1% T, što može da se pripiše njegovom sastavu, te prisustvu spojeva
koji mogu interferirati prilikom analize. Najniža koncentracija ukupnih kumarina izraženih preko
ekvivalenata 4-metilumbeliferona i eskuletina je u uzorku 1 (Votka 1906), 4,546 x10-3
μgE4MUB/mL i 4,745 x10-4 μgEESQ/mL.
-Uz uslove instrumenta da su svi filteri otvoreni određen je ukupan sadržaj kumarina i u uzorku 1
što nije bilo moguće uz uslov 1%T.
-Međutim, s obzirom da je dozvoljeni nivo kumarina u alkoholnim pićima 10 mg/kg, svi uzorci
votke sadrže mnogo niži nivo prisutnih kumarina u odnosu na dozvoljeni nivo.
-Na osnovu prikazanih rezultata u Tabeli 18 vidljivo je da svi analizirani uzorci pokazuju viši
sadržaj ukupnih kumarina kada su rezultati izraženi preko ekvivalenata eskuletina u odnosu na
rezultate sadržaja kumarina izraženih preko ekvivalenata 4-metilumbeliferona.
-Sadržaj ukupnih kumarina je najmanji u Uzorku 1 bilo da su rezultati izraženi preko
ekvivalenata 4-metilumbeliferona (4,546 x10-3  0,003 μg/mL) ili eskuletina (4,745 x10-4  0,001
μg/mL) uz uslov da su svi filteri otvoreni. Najveći sadržaj ukupnih kumarina izraženih preko
ekvivalenata 4-metilumbeliferona ili eskuletina uz uslove 1%T ili sve filtere otvorene, pokazuje
Uzorak 7.
Slide 15 ZAKLJUČCI
 Svi analizirani uzorci votke gdje je sadržaj ukupnih kumarina izražen preko ekvivalenata
eskuletina su pokazali više vrijednosti u odnosu na rezultate sadržaja ukupnih kumarina
izraženih preko 4-metilumbeliferona
 Najviši sadržaj ukupnih kumarina je u uzorku 7 (Ice Smirnoff) izražen preko ekvivalenata
i 4-metilumbeliferona i eskuletina uz različite uslove instrumenta
 Najniža koncentracija ukupih kumarina izraženih preko ekvivalenata 4-
metilumbeliferona i eskuletina je u uzorku 1 (Votka 1906) uz uslov da su svi filteri
otvoreni
 U uzorku 1 koji je sniman na talasnim dužinama ekscitacije i emisije za 4-
metilumbeliferon uz 1%T nisu detektovani kumarini

Slide 16 ZAKLJUČCI
 Iz dobijenih rezultata može se zaključiti da se ukupni kumarini mogu određivati preko
talasnih dužina 4-metilumbelifrona i eskuletina uz uslov da su svi filteri otvoreni
 Analizom uzoraka ovom metodom dobiveni rezultati za ukupne kumarine izražene preko
ekvivalenata 4-metilumbelifrona i eskuletina su u skladu sa dozvoljenim nivoom sadržaja
kumarina u alkoholnim pićima koji iznosi 10 mg/kg.