Measuring Entropy in Molecular Recognition by

Proteins
Joshua Wand and Kim A. Sharp

El reconocimiento molecular por proteínas es fundamental para las bases moleculares de la biología. La
disección del paisaje termodinámico que gobierna las interacciones proteína-ligando ha demostrado ser difícil
porque la determinación de varias contribuciones entrópicas es bastante desafiante. Las mediciones de la
resonancia magnética nuclear, la teoría y las simulaciones sugieren que se puede acceder a la entropía
conformacional a través de un proxy dinámico.
Aquí, repasamos la relación entre las medidas del movimiento rápido de la cadena lateral y la entropía
conformacional subyacente. El proxy dinámico revela que la contribución de la entropía conformacional
puede variar de altamente favorable a altamente desfavorable y demuestra el potencial de esta variable
termodinámica clave para modular las interacciones proteína-ligando.

El llamado medidor dinámico de entropía también refina el papel de la entropía del

solvente y determina directamente la pérdida en la entropía rotacional-traduccional que
ocurre con la formación de complejos de alta afinidad. La capacidad de cuantificar los
roles de la entropía a través de un medidor de entropía basado en propiedades dinámicas
cuantificables promete destacar su papel en la función de la proteína
La investigación experimental de la termodinámica del reconocimiento molecular por
proteínas a menudo comienza desde una perspectiva colorimétrica donde se mide el calor
o la entalpía (Htotal) y la energía libre (Gtotal) y la entropía de unión total (Stotal) se
determina mediante

Los modelos estructurales detallados de resolución atómica proporcionan una gran comprensión de los
orígenes de la entalpía de unión. Mucho menos ciertas son las diversas contribuciones a la entropía total
vinculante. En principio, varios tipos de entropía son potencialmente importantes (ver el lado derecho de la
Ecuación 1). Históricamente, la entropía ha entrado con mayor frecuencia en la discusión en términos de los
cambios en la entropía del agua solvente (Ssolvente) y enmarcada en términos del llamado efecto hidrofóbico
(3, 14, 32, 98).

Ssolvent ha sido, con cierto éxito, relacionado empíricamente con los cambios en el área
superficial accesible (ASA) de la proteína y el ligando después de la complejación (32).
Cambios en la entropía conformacional (Sconf) y la entropía rotacional-traduccional (Sr-t)
de las especies que interactúan ha recibido mucha menos atención, presumiblemente
porque han resistido la medición experimental. Sother se refiere a otros procesos, como la
unión o liberación de protones, que pueden contribuir a la entropía de unión total (50).
El objetivo es medir estas contribuciones a la unión de ligandos por moléculas de proteína. Resulta que un
enfoque indirecto que utiliza un proxy dinámico obtenido por métodos de relajación NMR ha demostrado ser
bastante exitoso ...

La espectroscopía de NMR de la solución ha surgido como un medio poderoso para la medición del
movimiento interno resuelta en el sitio en moléculas de proteínas en un rango impresionante de escalas de
tiempo en proteínas de tamaño y complejidad significativos (88). La espectroscopía de RMN tiene una gran
cantidad de capacidades para caracterizar los fenómenos dependientes del tiempo y puede acceder a los
regímenes de tiempo desde los picosegundos hasta los días (8, 90). Como se ve a continuación, se anticipa
que el movimiento en la escala de tiempo rápida será rico en la conformación subyacente
entropía, y nos enfocamos en las características de la solución de relajación NMR que muestra este régimen
de tiempo. Aquí, en última instancia, estamos más enfocados en aquellos movimientos que expresan grandes
contribuciones a la entropía conformacional de proteínas (es decir, movimientos que muestrean ampliamente
los muchos estados disponibles para el estado nativo plegado de la molécula de proteína).
Desde hace mucho tiempo se ha reconocido a partir de simulaciones tempranas que las oscilaciones
torsionales en modo suave extremadamente rápidas de las cadenas laterales de aminoácidos contienen
entropía significativa y que la entropía vibratoria variará poco a medida que las proteínas se mueven de estado
a estado (41). Los fenómenos de relajación de RMN clásica sondearán la interconversión de estos estados en
la escala de tiempo del picosegundo-nanosegundo.

PRELUDIO A UN PODER DINÁMICO DE CONFORMACIÓN

ENTROPÍA
Como se describió anteriormente, se han superado varias barreras técnicas para obtener medidas precisas e
interpretables de fenómenos de relajación resueltos por el sitio. Las estrategias analíticas para analizar estos
datos ahora se establecen en gran medida con el enfoque libre de modelo L-S, que proporciona el marco
dominante. La siguiente tarea era intentar dar sentido a la importancia física de
cuadrados de parámetros de orden generalizados y, en menor medida, para obtener tiempos de correlación
efectivos.

ENTROPÍA CONFORMACIONAL Para evitar las diversas limitaciones del enfoque del
inventario del oscilador, nos embarcamos en una estrategia que calibraría empíricamente
la relación entre los cambios en el movimiento interno de las cadenas laterales portadoras
de metilo y el cambio correspondiente en la entropía conformacional de la cadena lateral
total. Aquí, la vista cambia. Ahora buscamos usar el grupo metilo como reportero no solo
de su propio trastorno sino también como respuesta al desorden de su entorno.

Los factores de ponderación (a y b) sirven para proyectar los cambios medidos en el movimiento de los
reporteros del grupo metilo a través de toda la proteína y el ligando.
En su formulación original (74), los factores de ponderación eran simplemente el número de residuos de
aminoácidos [el ligando era un péptido; los ligandos no péptidos pueden requerir un análisis más detallado
(ver 13, por ejemplo)], pero posteriormente se ha demostrado que es insuficiente (42, 108), como se describe
a continuación.
Parece que persiste una relación lineal entre los cambios en el parámetro de orden L-S y la entropía para los
parámetros de orden entre 0.1 y 0.9 (34). El factor de escala sd es lo que deseamos. En efecto, las objeciones
que podrían hacerse contra el enfoque del inventario del oscilador se incluyen en este parámetro empírico

La aplicación inicial de este enfoque a los complejos de calmodulina antes mencionados

resultó ser muy convincente (74). Se observó una alta correlación lineal para la Ecuación
5. El uso posterior de esta estrategia en el análisis de varios mutantes de la unión de
proteína activadora de catabolito en una linealidad y precisión aún más impresionantes
del factor de escala sd (106). Sin embargo, la comparación de los estudios de la proteína
activadora de la calmodulina y el catabolito reveló que los dos valores de SD
independientes determinados difirieron en gran medida (108). Por un lado, tal vez
realmente sean diferentes, pero, por otro lado, uno sospecha que la relación entre el
movimiento y la entropía conformacional subyacente es una propiedad universal de las
moléculas de proteínas.
Insights de Computación y Simulación

Para obtener una idea de esta aparente discrepancia, recurrimos a las simulaciones MD. Las simulaciones MD
han mejorado mucho en la última década en su capacidad para recapitular los valores del eje O2 de la orden
experimental, y las simulaciones de múltiples nanosegundos son ahora suficientemente precisas para
proporcionar una guía útil (por ejemplo, 5, 15, 25, 42, 48, 49, 57-59, 87). Utilizando un conjunto de proteínas
con un rango de propiedades dinámicas, examinamos algunas de las suposiciones básicas del enfoque del
medidor de entropía descrito anteriormente (42, 95).

Quizás la premisa más sólida del metro de entropía es la necesidad de un vínculo cuantitativo entre el
promedio móvil del eje de simetría del grupo metilo y la entropía conformacional subyacente. Para examinar
esta cuestión, se calcularon las distribuciones de poblaciones de rotámeros de todos los aminoácidos que
contienen metilo a partir de las trayectorias MD de cada proteína (42).
Se observó una excelente correlación lineal entre la entropía rotámera (Sb) de cada aminoácido que contiene
metilo normalizado por el número de ángulos de torsión de la cadena lateral (Nχ) en ese residuo y los
parámetros de orden de la cadena lateral de metilo correspondientes calculados a partir de las simulaciones
MD
(Figura 2). La normalización local por el número de ángulos de torsión (modos suaves) ha sido recomendada
por simulaciones anteriores (57, 58).
Es importante destacar que resulta que esta linealidad se extiende globalmente cuando el acoplamiento entre
cadenas laterales es débil (95). Además, como era de esperar, las distribuciones de las diferentes proteínas se
superponen una a la otra, lo que sugiere fuertemente que la escala empírica del movimiento a la
correspondiente entropía debe ser universal.
La segunda suposición crítica en la construcción del medidor de entropía es que el movimiento del grupo
metilo está lo suficientemente acoplado a su entorno para informar fielmente sobre el desorden local.
(74) Esta cuestión central se exploró comparando la entropía del rotámero de las distribuciones de
probabilidad para todos los ángulos de torsión de la cadena lateral con el proxy dinámico (es decir, el
movimiento del grupo metilo).

Se encontró una excelente correlación lineal que indica que los movimientos de metilo
(desorden) realmente informan cuantitativamente sobre el desorden de las cadenas
laterales de aminoácidos circundantes (Figura 3). El último factor es la medida en que los
movimientos de las cadenas laterales individuales están acoplados y en qué medida este
acoplamiento reduce la entropía conformacional interna total.

De nuevo, las simulaciones de MD proporcionan la idea de que este acoplamiento se manifiesta

principalmente como un escalado lineal, reduciendo la entropía de la cadena lateral por un factor constante de
aproximadamente el 17% (42).

Calibración experimental del medidor de entropía Recientemente hemos probado

experimentalmente la hipótesis de que el medidor de entropía es universalmente
aplicable, en otras palabras, que la escala (sd) entre los cambios en el movimiento rápido
y los cambios en la entropía conformacional es constante (7). Los 28 complejos proteína-
ligando utilizados para la calibración abarcan un amplio rango de afinidades de unión (Kd:
10-4 a 10-10 M) y tipos de ligandos, incluidos ácidos nucleicos, sustratos enzimáticos y
cofactores, carbohidratos, péptidos y proteínas.
Usualmente, la contribución de la entropía del solvente a la termodinámica de un equilibrio se calcula usando
coeficientes empíricamente determinados que relacionan cambios en polares y apolares accesibles.
área superficial (32). Estos coeficientes se han derivado con varias suposiciones sobre la naturaleza de la
entropía conformacional en el estado plegado. Es importante observar que los cambios significativos en la
capacidad calorífica acompañan a la hidratación de los grupos polares y apolares. Esta variación de
temperatura está bien descrita experimentalmente por las relaciones a1 = dCp1 ln (T / 385 K) (3) y a2 = dCp2
ln (T / 176 K)
(71), donde dCp1 y dCp2 son las capacidades de calor de hidratación por unidad de área de la superficie
apolar y polar, respectivamente. La extensión sin precedentes del conjunto de datos dinámicos utilizados (7)
nos permitió ajustar directamente estos coeficientes de entropía de solventes

Además, la intersección de la ecuación 5 contiene la pérdida en la entropía traslacional

rotacional sobre la formación del complejo Gr-t. Nosotros por lo tanto

La ecuación 6 está escrita para la situación de tener un ligando con modos de torsión suaves y sería
modificado para una molécula rígida. Violaciones de las pocas suposiciones usadas para construir la
calibración

la línea para el medidor de entropía tenderá a provocar una desviación de la linealidad.

Estos incluyen los supuestos de que los grupos metilo son suficientemente numerosos,
están bien distribuidos y están acoplados adecuadamente a aminoácidos que no
contienen metilo, de modo que sus movimientos proporcionan una cobertura completa del
movimiento interno de la proteína. Como se discutió anteriormente, estas suposiciones
son fuertemente apoyadas por la simulación (42).

Es importante apreciar que los efectos del movimiento correlacionado señalados anteriormente en el contexto
de las simulaciones de MD son inherentemente atendidos por la calibración experimental de sd. También es
notable que, en este tratamiento, hemos ignorado la contribución a la entropía vinculante de la columna
vertebral de la proteína.

ENTROPÍA EN RECONOCIMIENTO MOLECULAR POR PROTEÍNAS Utilizando el valor

determinado de sd, podemos establecer que la contribución de la entropía conformacional
al reconocimiento molecular por proteínas es bastante variable entre los complejos. La
entropía conformacional puede desalentar mucho, no tener ningún efecto sobre, o
favorecer fuertemente la asociación y es a menudo un gran determinante de la
termodinámica de la unión (Figura 5). Los orígenes estructurales de este comportamiento
siguen siendo un misterio, pero la variación pura indudablemente motivará muchas
investigaciones futuras. También se hacen accesibles otras contribuciones entrópicas a
las asociaciones proteína-ligando. El medidor de entropía representado por la Ecuación 6
permite que haya otras fuentes desconocidas de entropía. Estos podrían incluir, por
ejemplo, eventos de (de) protonación asociados con el enlace (50).
Claramente, si Sother es significativo y varía entre complejos o si Sr-t varía mucho entre complejos, entonces
la linealidad de la Ecuación 6 se degradará. La correlación lineal observada sugiere fuertemente que ninguno
de estos ocurre. En este caso, la intersección de ordenadas representa la pérdida en la entropía rotacional-
traduccional (Sr-t) tras la formación de complejos de alta afinidad. El cambio en la entropía rotacional-
traduccional que acompaña a la formación de complejos que involucran proteínas ha sido objeto de extensos
debates teóricos (p. Ej., 6, 18, 23, 24, 29, 31, 69, 89, 97, 101, 117) pero, como conformacional entropía, se ha
resistido en gran medida a la definición experimental. A partir de la intersección de ordenadas ajustada en la
figura 4, se encuentra que la aparente Sr-t es ~0.10 ± 0.01 kJ mol-1 K-1, que es algo más alta que la obtenida
recientemente mediante simulaciones MD (29).