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 se aisló ARN de levadura mediante un protocolo que incluyó dos etapas: homogenización y purificación. En la
primera etapa, se disolvió la levadura en agua, calentando hasta 37 ȗC y agregando una solución de lisis, en este caso se
utilizó fenol concentrado. La posterior centrifugación de la solución obtenida, contenía el ARN como sobrenadante, este
sobrenadante se aisló y se le adicionó etanol frio para precipitar y purificar el ARN, lo que constituyó la segunda etapa
del proceso.

En la determinación cualitativa y cuantitativa del ARN aislado, se recurrió a una técnica espectroscópica. Se preparó
una curva de calibración utilizando soluciones de ARN estándar y adicionando orcinol- FeCl 3 en medio caliente, el
resultado fué una solución de color verde fácilmente cuantificable por espectroscopía en el rango visible (a una
longitud de onda de 665 mn), al ARN aislado también se le hizo reaccionar con estos mismo reactivos en iguales
condiciones y se le tomó la absorbancia; con este resultado y la ecuación de la recta obtenida por mínimos cuadrados,
se determinó una concentración de 0.133 % de ARN en 5 g de levadura. Por otro lado, se tomó un espectro ultravioleta
del ARN de levadura aislado, en el cual se observan 2 bandas, a 207.0 y 269.0 nm, propias de los sistemas de dobles
enlaces conjugados presentes en la molécula de las purinas y pirimidinas del acido nucleíco analizado.

  mitocondrias. En las células de organismos superiores


hay tres tipos de ARN: ARN mensajero (mARN), ARN
, ,/' ribosomal (rADN), y ARN de transferencia (tADN),
todos los cuales participan activamente en la síntesis
El ácido ribonucleico (m
 o
m, de RiboNucleic Acid,
de proteínas.
su nombre en inglés) es un ácido nucleico formado por
una cadena de ribonucleótidos. Algunas moléculas de ARN presentan actividad
catalítica, y son conocidas como ribozimas. La mayoría
de los ARN son autocatalíticos, ya que catalizan su
propio procesamiento. Su hallazgo es relativamente
reciente, y antes se consideraba que solo las proteínas
eran las únicas macromoléculas capaces de poseer
actividad catalítica.

El ARN es el vehículo molecular que transporta la


información genética del DNA para la síntesis de
proteínas. Las proteínas son los productos finales de la
expresión del DNA de la celula. La información que
reside en el DNA se emplea para construir mRNA
(transcripción), que a sus ves, retransmite el mensaje a
 m

la maquinaria celular encargada de la síntesis proteica.
De esta manera, el mRNA sirve de intermediario para
La mayoría del ARN se encuentra en el citoplasma
llevar la información del DNA.
como ARN soluble y ARN ribosomal, pero
aproximadamente el 10% se encuentra en el núcleo y 
un poco cantidad se halla también en el las

, )(   Gotero, Jeringa, Vidrio reloj. Plancha calentadora/agitadora,
Spectronic con sus respectivas
Se denomina levadura a cualquiera de los diversos celdas
hongos microscópicos unicelulares que son 
importantes por su capacidad para realizar la
descomposición mediante fermentación de diversos Método:
cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o
1) Extracción-homogenización
hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.
 En un vaso, adicionar 5 g de Levadura de pan
seca y 20 mL de agua destilada, agitar hasta
disolver completamente y calentar a 37°C
durante 15 minutos.

 Adicionar 25 mL de Fenol Concentrado

 Agitar durante 30 minutos y transferir el


contenido del vaso a los tubos de centrifuga,
" someter a centrifugación durante diez minutos

La estructura de las levaduras es muy parecida a la de (2) Purificación por precipitación


las células comunes por que consta de las mismas
 Separar el sobrenadante donde se encuentra el
partes de la célula animal
ARN en un vaso limpio y seco, descartando el
Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su precipitado.
manipulación con las mínimas precauciones
 Adicionar 3 mL de acetato de sodio pH 5
 !
 Precipitar el ARN por adición de dos volúmenes
Utilizando un protocolo sencillo de homogenización y de EtOH absoluto frío por volumen de
purificación, se pretende aislar el ARN de levadura. sobrenadante separado,

Realizar determinaciones cuantitativas de  Agitar suavemente y dejear la mezcla en reposo


concentración de ARN mediante una reacción con en la nevera por 30 minutos para obtener un
Orcinol, cuantificando posteriormente con una técnica mayor rendimiento.
de espectroscopia visible.
 Someter a centrifugación por diez minutos.
Observar las bandas de absorción en el ultravioleta Separar el precipitado (es allí donde se
propias del acido ribonucleico. encuentra el ARN).

"  #$  Disolver el ARN en un volumen de 15 mL de


 solución de NaCl 0.25 M y transferir la solución
 a un tubo de ensayo limpio y seco.
  #
!
Determinación del ARN extraído:
3 Vasos de 100 ml Orcinol, FeCl3
Baño de hielo. Baño María NaCl 0.25 M, Acetato de sodio El ARN obtenido se hacer reaccionar con Orcinol en
200g/L pH 5 medio ácido catalizador, que al calentar forma una
solución verde, para su cuantificación, se prepara una
10 tubos de ensayo con Etanol, Levadura de pan seca, curva de calibración con soluciones patrón de ARN
gradilla. Centrifuga Fenol
estándar bajo las mismas condiciones, los volúmenes
2 Vasos de 250 mL,Probeta Pipeta pasteur
adicionados de muestra y de estándares se muestran
100 ml
en la siguiente tabla: 
Pipetas graduadas de RNA patrón estándar al 0.5%
0,5,1,2,5,10 ml
"Volúmenes en mL adicionados de cada reactivo, 'Datos estadísticos de la curva de calibración
incluyendo las muestras de ARN
5678
2
% &  "  ' () *) R =0.90269
   +
 
m   9./ 1.5465 0.06401
+,(- 0.0 0.5 1 1.5 2.0 1.0 2.0 :   ./ 2.51 0.4674
./ 
 : (
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3,0
0 1./ ȁͲǤ͹͸ͷ െ ͶǤͷͶ͸ͷȁ ݉
m2  ‫ݔ‬ൌ ൌ ͳǤͷΨ ݀݁‫ܴܰܣ‬
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1.0 0.0 ʹǤͷͳ ‫ݒ‬
./
*5y 6 corresponden a la muestras de RNA obtenido de la En los 15 mL de la solución de NaCl con ARN, contiene
levadura aproximadamente 0.1% m/v en ARN.

La absorbancia de las diferentes soluciones se mide a una ͳǤͷ݃ ͳǤͲ݉‫ܮ‬ ݉


‫כ ܴܰܣ‬ ‫ ͲͲͳ כ‬ൌ ͲǤͳΨ ݀݁‫ܴܰܣ‬
longitud de onda de 665 nm. ͳͲͲ݉‫ܮ‬ ͳͷ݉‫ܮ‬ ‫ݒ‬
Para el tubo 6:
 3+#  
 ȁͳǤʹͲ͵ െ ͶǤͷͶ͸ͷȁ ݉
‫ݔ‬ൌ ൌ ͳǤ͵͵Ψ ݀݁‫ܴܰܣ‬
Para realizar los cálculos del porcentaje del ARN ʹǤͷͳ ‫ݒ‬
extraído de la levadura, se tuvo en cuanta que el En los 15 mL de la solución de NaCl con ARN, contiene
extracto final se obtuvo a un volumen de 15 mL. aproximadamente 0.18 % m/v en ARN.

 ͳǤ͵͵͵݃ ʹǤͲ݉‫ܮ‬ ݉
‫כ ܴܰܣ‬ ‫ ͲͲͳ כ‬ൌ ͲǤͳͺΨ ݀݁‫ܴܰܣ‬
ͳͲͲ݉‫ܮ‬ ͳͷ݉‫ܮ‬ ‫ݒ‬
 1  m&
m
 -4!  'm+
1 0,05 1,637 En general, dada su complejidad macromolecular, el
2 0,1 1,829 ARN como el ADN son difíciles de separar de los
3 0,15 1,965
componentes de membrana, proteína residual o
4 0,2 2,010
añadida (tales como las enzimas de restricción) y otras
5 Determinado 0.765
6 Determinado 1.203 moléculas solubles (como polisacáridos). Los métodos
 drásticos alteran sus estructuras y sus características. El
método utilizado fue un método suave elaborado con
el fin de eliminar la impureza de la preparación
teniendo en cuenta las propiedades fisicoquímicas del
acido nucléicos a aislar.

El protocolo de extracción utilizado, se fundamentó en
una etapa de homogenización y una de precipitación o
purificación de la levadura. La utilización de la levadura
como fuente de ARN, se basa en que, no se necesita
tratamientos enzimáticos o mecánicos robustos para
esta extracción, debido a que, las células de la levadura
son muy parecidas a la de los animales, y estas son
células que usualmente pueden ser lisadas con un
tratamiento suave, a diferencia de otros tejidos, de
vegetales especialmente.

;+<Curva de calibración de soluciones patrón de ARN


subsecuentes, debido a que algunas de ellas tienden a
adherirse al acido nucléicos y degradarlo.



En general, el aislamiento del ARN, se puede considerar


como una extracción liquido-liquido (extracción de
acido nucléicos por solubilidad en fases inmiscibles);
este método se basó en la separación de fases por
centrifugación del homogenizado acuoso de células
(levadura disuelta en agua, en caliente) y una solución
de fenol concentrado.

Cuando la levadura disuelta en agua, es expuesta a la


solución concentrada de fenol (solución de lisis), esta
última rompe los enlaces de hidrógeno en las
macromoléculas, causando desnaturalización de las
proteínas y por tanto la lisis celular.
'Pared celular de la levadura
La utilización del fenol concentrado, permitió la
ruptura de la pared celular de manera que las células
puedieran ser lisadas con mayor facilidad, debido a que Las interacciones entre el agua y los grupos fosfato
la levadura posee una parad celular considerablemente ayudan a remover especies mezcladas con el RNA, para
dura. La pared celular de la levadura esta constituida así poder liberarlo. La centrifugación ayuda a separar
por polisacáridos y glicoproteínas en forma de una red los componentes innecesarios del compuesto de
tridimensional que funciona como una estructura interés que es el RNA. Por si sola la centrifugación no
altamente dinámica y adaptable al medio que la rodea. logra precipitar el RNA y es la adición del fenol la que
La pared celular de la levadura es capaz de adaptarse a permite obtener una mayor cantidad de dicho ácido.
cambios fisiológicos y morfológicos o a las condiciones Para evitar la perdida y degradación del RNA, el
ambientales de su entorno. compuesto resultante se llevó al baño de hielo.

Luego de la lisis celular, se encuentran los Desde el punto de vista de la molécula de RNA, las
componentes intracelulares en la solución que fuerzas responsables de las conformaciones de las
contiene ADN, ARN, proteínas, lípidos y carbohidratos, estructuras de los ácidos nucléicos son lo
constituyendo una solución turbia. suficientemente resistentes como para mantener la
integridad estructural, pero a la vez son tan débiles
Al centrifugar la solución turbia producto de la lisis
como para exhibir una flexibilidad conformacional. Los
celular con el fenol, aparecen dos fases: la fase inferior
enlaces covalentes, las fuerzas de Van der Waals, los
de fenol o fase orgánica, que contiene el ADN (el ADN
enlaces de hidrógeno y las interacciones electrostáticas
es precipitado debido a que el fenol utilizado no estaba
se ven afectadas durante todos los tratamientos
tamponificado), proteínas desnaturalizadas, lípidos de
realizados a la muestra de levadura. Se tiene que los
membrana, polisacáridos y otros restos celulares, en la
efectos electrostáticos son los que determinan
fase superior acuosa contiene glúcidos y ARN. La
estructura y la forma de la cadena, a la vez los efectos
proteína desnaturalizada se halla presente en ambas
hidrofílicos estabilizan los apareamientos de las bases
fases y es removida ulteriormente por centrifugación.
de RNA en solución acuosa.
La remoción de proteínas es importante, para evitar
que puedan interferir con los procedimientos
La purificación, incluyó una disolución de la fase acuosa soluciones estándar de ARN. La reacción colorida, fue
en una solución de acetato de sodio pH 5, y una producto de la reacción entre la solución de ARN y una
precipitación con etanol frio durante treinta solución de Orcinol con un acido de Lewis, el FeCl3
minutos,para obtener un mayor rendimiento en la como acido catalizador.
obtención de un ARN mas limpio, todo esto con el
objetivo de eliminar trazas de ribunucleasas (ARNasa) El ácido catalizador FeCl 3, hidroliza las uniones
fosfodiester y N-glicosídicas, liberando ribosa, bases
que son enzimas (nucleasas) que catalizan la hidrólisis
púricas, pirimidínicas y acido fosfórico. La ribosa, que
de ARN en componentes más pequeños; estas enzimas es una pentosa, en medio ácido se deshidrata
pueden ser introducidas a lo largo del proceso, originando furfural que reacciona con el orcinol por
generándose por bacterias u otros factores propios de medio de una condensación, dando un producto verde
la manipulación. Este proceso de purificación también que demuestra la presencia de ARN, cabe resaltar que
permite separar el ARN de materiales contaminantes, para el ADN o para cualquier pentosa, también se
como ADN y proteínas. obtiene un mismo resultado, sin embargo,
interferencias por este tipo se descartan debido al
Esta es una técnica muy empleada para purificar ácidos proceso de extracción y purificación llevado a cabo.
En las siguientes ilustraciones se muestra las
nucléicos de oligonucleótidos, nucleótidos, sales y
reacciones llevadas a cabo:
otras impurezas. Bajo estas condiciones, el polímero de
ARN se agrega y precipita mientras que los Ú

componentes de bajo peso molecular permanecen en


suspensión.

Cada uno de los pasos realizados, se llevaron a cabo en


condiciones de baja temperatura para incrementar la
eficiencia de la purificación del ARN, evitando la
desnaturalización de la muestra.

En general, dada su complejidad macromolecular, el


ARN como el ADN son difíciles de separar de los
componentes de membrana, proteína residual o
añadida (tales como las enzimas de restricción) y otras
moléculas solubles (como polisacáridos). Los métodos
drásticos alteran sus estructuras y sus características. El
 ( 0   <<  9   =
método utilizado fue un método suave elaborado con
   
el fin de eliminar la impureza de la preparación
teniendo en cuanta las propiedades fisicoquímicas del
acido nucleíco. En este método, no se utilizó enzimas
proteolíticas (como la proteinasa K) para eliminar
proteínas asociadas ni tampoco se hizo utilizó químicos
que eliminaran las ribonucleasas, por tanto, es factible
que trazas de estos se quedasen en la solución y
degradaran en ciertas proporciones el ARN que se
pretendía aislar.

Una completa extracción de ácidos nucléicos fue


fundamental para la determinación indirecta que se
realizó utilizando una curva de calibración de
soluciones estándar apoyándose en una versión
modificada de una reacción de Bial.

La determinación del ARN, se realizó por


espectrofotometría visible, por tanto, el análisis

cuantitativo incluyó una curva de calibración de
Ö De la investigación sobre el RNA, se concluye
Úå
Úå
que es el encargado de transmitir las
 instrucciones a cada célula del cuerpo, para así
å 
mantener un correcto funcionamiento en el
å 
organismo
Ö En la separación de compuestos a estudiar es
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å importante tener presente las propiedades de
Úå  Ú
Ú "#$
Ú los solventes y las interacciones de estos con
los compuestos que se vayan a separar
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Ú
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*1  << 

La reacción que se lleva a cabo entre el furfural y el


orcinol, puede verse como una doble alquilación de un
anillo aromático, donde, se produce una sustitución
aromática por un grupo electrófilo en cada anillo
aromático; la polarización del grupo carbonilo
contribuye a la reactividad del furfural en la proporción
aldéhica, el átomo de C polarizado positivamente,
actúa como un electrófilo.

El orcinol, es un compuesto aromático fuertemente


activado por los grupos hidroxilo y el grupo alquílico ʹ
CH3 que contiene, esta activación está dirigida a las
posiciones orto y para con relación a cada grupo, por
tanto en estas posiciones es en donde se realiza la
sustitución electrofílica, la mayor probabilidad de
sustitución es los anillos es la que se refleja en la
ilustración 6.

Las moléculas de ARN reaccionan indirectamente con


orcinol en presencia de cloruro férrico como
catalizador y a su vez las pentosas de nucleótidos de
purina del ARN al ser calentadas se deshidratan y dan
unos compuestos de tipo aldehído conocidos como
furfurales. Los furfurales son compuestos derivados del
furano que reaccionan con el orcinol en presencia de
cantidades catalíticas de cloruro férrico dando
soluciones de color verde, sufriendo deshidratación y
luego deshidrogenación. La reacción esta dada por:

(1 

Ö El RNA es de gran importancia en cuanto al


entorno biológico, pues es el ayudante del
DNA al realizar la labor de transcripción de la
información

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