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FACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA Y

CIENCIAS DEL MAR


FICHA DE LA PRÁCTICA PARA LABORATORIO

CÓDIGO

MATERIA Patología Acuícola 1 ACUG1013

LABORATORIO Biología

NOMBRE DE LA PRÁCTICA Medios de cultivo

ESTUDIANTE Aguirre Vinza Gladys Emma

FECHA DE LA PRÁCTICA
Jueves 25 de octubre de 2018

RESUMEN:
Realizar estudios microbiológicos en Acuacultura es un aspecto importante a la hora de investigar cepas
bacterianas; de manera similar incrementar la cantidad de fitoplancton para obtener alimento vivo para las
especies es un factor importante en los primeros estadios cuando se necesita proteína que solo un alimento
que tiene nutrientes “frescos” lo pueden proporcionar.
El presente informe tiene como finalidad principal conocer la composición de dos medios de cultivo
principalmente y, todo lo que conlleve a características físico-químicas para conocer su preparación y empleo
correcto. Lo que se efectuó fue un análisis de preparación y de componentes de los medios TCBS y Tripticasa
de soya.
Se presentarán los componentes y la preparación, a fin de ahondar más en datos técnicos que permitan una
correcta aplicación de éstos.

OBJETIVOS
• Objetivo General
Conocer la composición y función de dos medios de cultivo: TCBS y Tripticasa de soya por medio de la
observación de muestras para saber su correcta aplicación.

• Objetivos Específicos

o Establecer las funciones de cada componente de los medios de cultivo por medio de investigación.
o Observar la preparación de los medios de cultivo mencionados y de las prácticas básicas que deben
realizarse para su preparación.
o Indicar las contraindicaciones de los medios de cultivo.

MARCO TEÓRICO:
Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH,
temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los
requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono
e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos
en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. (López Tevez & Torres, 2006).
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FICHA DE LA PRÁCTICA PARA LABORATORIO

El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. En términos
generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio,
Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados
micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores
cantidades (Food and Agriculture Organization of the United Nations, s.f.).
Por esta razón, desarrollarlos en condiciones artificiales o naturales es esencial para asegurar el éxito de una
cosecha porque las larvas reciben la cantidad de nutrientes necesarios para que se desarrollen como se debe
en todas las etapas de desarrollo de estas.
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos.
En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido
las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas para
enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en
contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores
depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de la misma.
Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado,
brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por
factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadas van desde el agua de
Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta fórmulas
específicas para familias como la fórmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et
al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene,
1982, etc. (Food and Agriculture Organization of the United Nations, s.f.)
Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos)
necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de la
fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de
Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas. (Food and Agriculture Organization of the United
Nations, s.f.)
Los medios de cultivos se clasifican en naturales, sintéticos, semisintéticos, líquidos, sólidos, semisólidos,
comunes o universales, enriquecidos, selectivos. Los naturales son aquellos que se preparan con una base
de organismos vegetales o animales; por lo normal la composición química es desconocida. Los sintéticos ya
tienen una composición química definida; se la utiliza para multiplicar especies. Los semisintéticos son
aquellos que contienen en su composición compuestos que permiten el crecimiento de las especies objetivo.
Los líquidos son llamados también caldos. Los sólidos se obtienen cuando a un medio líquido se le añade
agar (gelificante, hidrato de carbono extraído de algas); no contiene nutrientes, ayuda a diferenciar bacterias.
Los semisólidos contienen agar pero en menos proporción que los sólidos, se puede observar la motilidad
de las especies. Los comunes o universales permite crezcan microorganismos poco comunes; es
frecuentemente usado para mantener colonias microbianas. Los enriquecidos tienen un medio de base al
cual se le pueden agregar más nutrientes extras como sangre, suero; se emplea cuando las especies tienen
demandas nutricionales exigentes. Los selectivos son sólidos y permite inhibir (factores: antisépticos son
sustancias antibacterianas que pueden actuar como inhibidores; antibióticos son sustancias antibacterianas
que impiden el crecimiento de microorganismos que no son de interés) el crecimiento de especies químicas
ajenas a las necesidades; la selectividad se consigue manipulando las condiciones físicas (pH, temperatura,
alteraciones osmóticas, oxigeno, co2) o químicas del medio. Permite aislar organismos determinados de
poblaciones mixtas. Los diferenciales permiten identificar organismos específicos. Los de enriquecimiento
son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las especies no deseadas pero que favorece el
crecimiento irrestricto del agente infeccioso. Referencia: (López Tevez & Torres, 2006).
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MATERIALES & EQUIPOS:

Para llevar a cabo la presente práctica se emplearon los medios de cultivo:


 Difco TCBS: agar tiosulfato citrato bilis sacarosa
 BBL Tripticase soy agar: agar de soya tripticasa

DATOS:
 DIFCO TCBS:
Es un medio selectivo de diferenciación para el aislamiento y el cultivo de Vibrio cholerae y otras especies de
Vibrio a partir de muestras clínicas.
Base para el aislamiento de Vibrio cholerae y otros vibriones enteropatogénicos.
Fórmula aproximada por litro:
Extracto de levadura 5,0 g
Para Uso en el laboratorio: Peptona de proteosa n°3 10,0 g
pH final: 8,6±0,2 Citrato de sodio 10,0 g
Higroscópico Tiosulfato de sodio 10,0 g
Bilis de buey 8,0 g
Sacarosa 20,0 g
Cloruro de sodio 10,0 g
Citrato férrico de amonio 1,0 g
Azul de bromotimol 0,04 g
Azul de timol 0,04 g
Agar 15,0 g
Tabla 1Componentes del TCBS agar.

Función de cada componente del TCBS:


- Extracto de levadura y peptona: Proporcionan el Nitrógeno y vitaminas.
- Citrato sódico, tiosulfato sódico, bilis de buey: Agentes selectivos que proporcionan un pH alcalino
para inhibir los organismos gramm positivos y suprimir los organismos coliformes.
- Sacarosa: carbohidrato fermentable.
- Cloruro sódico: Estimula el crecimiento.
- Tiosulfato sódico: Fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como indicador para detectar la
producción de ácido sulfhídrico.
- Azul de bromotimol y timol: Indicadores de pH.
- Agar: carbohidrato extraído de las algas que permite solidificar el medio.

El pH se aumenta para hacer crecer más a los Vibrios cholerae ya que son sensibles a medios ácidos. La alta
cantidad de sodio permite de igual manera el crecimiento de ese Vibrio porque es halotolerante y de otras
especies de Vibrio que son halofílicas.

Método microbiológico
Los vibrios habitan aguas salobre y salada. Producen enfermedades y, de hecho, está demostrado que las
infecciones de lesiones con Vibrio ocurren cuando los pacientes tienen contacto con agua salada o salobre.
Las especies de Vibrios que son patógenas para los seres humanos crecen en este medio de cultivo. Este
medio es altamente selectivo, cumple con todos los requisitos de los vibrios y permiten que compitan con la
flora intestinal. Todos los miembros del género tienen la capacidad de crecer en los medios con mayores
concentraciones de sal y algunas especies son halofílicas.
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Las cepas se visualizan de la siguiente manera:

Tabla 2 Resultados de crecimiento de cepas con TCBS. Fuente: (BD, 2003)

 TRIPTICASA DE SOYA
Es un medio general que permite el crecimiento de organismos exigentes o no. Cuando se le añade NaCl se
puede diferenciar a los organismos que son tolerantes a la sal. Entre los organismos que crecen en este medio
de cultivo se tienen bacterias aerobias comunes, facultativas, anaerobias y hongos. Como este es un medio
general, se le añade USP para esterilizar.

Composición aproximada por litro:


Digerido pancreático de caseina 15,0 g
Para uso de laboratorio: Digerido papico de harina de soya 5,0 g
pH final: 7,3 ± 0,2
Cloruro sódico 5,0 g
Higroscópico Agar 15,0 g

Función de cada componente:


- Cloruro de sodio: Mantiene el balance osmótico.
- Agar: Agente solidificante.
- Combinación de caseína y peptonas de soya: Convierte en nutritivo al medio al adicionarle nitrógeno
orgánico, en especial aminoácidos y péptidos de cadena más larga.

Los digeridos enzimáticos de caseína y harina de soja proporcionan aminoácidos y otras sustancias
nitrogenadas complejas.
La dextrosa es una fuente de energía. El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico. El fosfato potásico
dibásico actúa como tampón para controlar el pH.
La adición de cloruro de sodio al 6,5% a Trypticase Soy Broth permite la diferenciación de enterococos
tolerantes a la sal (resistentes al alto contenido de sal) del grupo S. bovis no tolerante a la sal y otras especies
estreptocócicas. En esta concentración, el cloruro de sodio es un agente selectivo que interfiere con la
permeabilidad de la membrana y los equilibrios osmótico y electrocinético. (BD, BBL Tripticase soy broth,
2015)
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Uso previsto:
Trypticase Soy Broth cumple con las especificaciones de The United States Pharmacopeia (USP).
Trypticase Soy Broth es un medio de uso general utilizado en procedimientos cualitativos para el cultivo
microorganismos exigentes y no exigentes a partir de una variedad de muestras clínicas y no clínicas.
Trypticase Soy Broth with 6.5% Sodium Chloride se utiliza para diferenciar la especie Enterococcus del grupo
de estreptococos Streptococcus bovis.

PROCEDIMIENTO:
Preparación de cada medio de cultivo:

TCBS:
1. Suspenda 89 g de polvo en 1 L de agua purificada. Mezcle bien.
2. Caliente agitando frecuentemente y hierva durante 1 minuto.
3. Enfrielo a temperaturas entre 45 y 50 °C y utilícelo inmediatamente.
4. NO LO AUTOCLAVE
5. Analice muestras para verificar su funcionamiento usando cultivos de control típicos y estables.

TRIPTICASA DE SOYA:
1. Suspenda 40 g del polvo en 1 L de agua purificada. Mezcle bien
2. Caliente agitando frecuentemente y hierva durante 1 minuto para disolver completamente el polvo.
3. Autoclave a 121°C durante 15 minutos. No caliente de forma excesiva.
4. Para la preparación de placas de sangre, agregue 5-10% de sangre desfibrilada estéril al agar estéril
previamente derretido y enfriado a 45-50 °C.
5. Analice muestras del producto final para verificar su rendimiento usando cultivos de control típicos y
estables.

CONCLUSIONES:

Los medios de cultivo tienen multiples aplicaciones, en la Acuicultua, permiten cultivar fitoplancton, esencial
para los primeros estadios de toda especie por ser alimento vivo. En microbiología y patología permiten cultivar
especies variadas de bacterias o microorganismos para estudio.
De la investigación presente se aprendió que manipulando un medio de cultivo se puede verificar de acuerdo
a colores y a la adición de colorantes o carbohidratos, la presencia de un organismo en específico.
Los dos medios de cultivo especificados son muy usados en Acuicultura, por su precio y por su calidad.
Lo que se aprendió de la investigación fue que cada uno tiene añadido de cloruro de sodio para mantener el
balance osmótico de las especies. Otro aspecto aprendido fue los tipos de cultivo que pueden haber
disponibles; el Tripticasa de soya es altamente nutritivo, mientras que el TCBS es selectivo.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

ANEXOS:

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