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MANUAL
 
 
DE
PRÁCTICAS
  DE
 
LABORATORIO
 
 
 
 
INGENIERIA EN   BIOTECNOLOGÍA
BIOQUÍMICA
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FICHA TECNICA

FICHA TÉCNICA
BIOQUÍMICA
Fecha: 27-­‐03-­‐2013  
   
Nombre del catedrático: Eduardo Guzmán Olea

Nombre de la práctica: Determinación de la concentración de ácidos nucleicos por

espectrofotometría y análisis de su integridad por electroforesis.
Clave:

Número de práctica: 2 Duración en horas: 3

Justificación: La purificación de ácidos nucleicos es fundamental para la

realización de diversos procesos en biotecnología, para ello es
necesario determinar la concentración e integridad de los
mismos.
Objetivos/Resultados de Determinación de la concentración e integridad de ADNp
aprendizaje: obtenido de un cultivo bacteriano.

Laboratorio donde se desarrollo de la práctica:

LAB02
Actividades a desarrollar:
• Determinar la concentración de ADNp extraído de un cultivo bacteriano.
• Determinar la integridad del ADNp mediante electroforesis en geles de agarosa.

Evidencia a generar en el desarrollo de la práctica:

• Reporte de la práctica incluyendo el análisis de los resultados
• Obtención de muestras biológicas para prácticas futuras.

COMPETENCIAS HABILIDADES
• Determinación la concentración
• Determinar la concentración e del ADNp.
integridad de ADNp. • Determinación de la integridad
del ADNp.

Elaboró: cDr. Eduardo Guzmán Olea Revisó: Flor García Paz / Luis Castillo
Olamendi / Juanita Yazmin Damian Amazo
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INTRODUCCIÓN

Espectrofotometría de ácidos nucleicos

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos
nucleicos (AN) absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de
AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un AN en
particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten
estimar la concentración a partir del valor de A260. Así, una unidad de absorbancia a
260nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de ADN
doble hebra, 40 µg/mL de ARN o 33 µg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra
(oligodesoxinucleótidos). En las preparaciones de AN, son frecuentes las impurezas de
naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz
UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de AN.
Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es
posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente
A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260/A280 sea
menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en
soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.

Una vez obtenida la concentración de los ácidos nucleicos, es necesario determinar su

integridad mediante un análisis electroforético, mismo que permitirá continuar con
diversos ensayos como PCR.

OBJETIVO

Determinar la concentración e integridad del ADNp purificado de un cultivo bacteriano.

MATERIALES REQUERIDOS POR EQUIPO (Cristalería)

CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES
1 caja Puntas de 200 µL (amarillas) Con Rack, estériles

1 caja Puntas de 10 µL (blancas) Con Rack, estériles

1 Contenedor para desechos

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líquidos y sólidos de CRETI´s

EQUIPO REQUERIDOS
NOMBRE ESPECIFICACIONES
Nano Drop
Micropipeta De 20-200 µL
Micropipeta De 2-20 µL
Cámara de electroforesis (completa)
horizontal
Fuente de poder para
electroforesis
Fotodocumentador

OTROS MATERIALES REQUERIDOS

(No suministrados por el Laboratorio)
CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES
1 ml Muestra biológica (DNA) Previamente purificados

REACTIVOS REQUERIDOS
NOMBRE CANTIDAD S I R O

Agua destilada estéril 10 mL

Agarosa 5g X

TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) 500 mL X

Buffer de carga 6x (0.25% xilencianol, 0.25% 1 mL X

azul de bromofenol, 30% glicerol)

Marcador de Peso Molecular X

Bromuro de etidio, 10µg/µL X

S: Riesgo a la Salud I: Riesgo de Incendio R: Riesgo de reactividad O:especificaciones

Manejo y disposición de los reactivos requeridos:

Los residuos utilizados se almacenarán en un frasco y se etiquetarán como CRETI´s

y punzocortantes para su disposición final en los contenedores de la UPEMOR.
Nombre del reactivo Datos importantes de la ficha técnica
  Incendio: combate,
derrame
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Salud
Ambiente

Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán

en el laboratorio.
  Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán
en el laboratorio

  Datos de la ficha de seguridad de cada uno de los reactivos que se utilizarán

en el laboratorio

PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA

1.- Determinación de la concentración de ADN

I. Se colocará 1 μL de muestra en el nanodrop, con la ayuda de una micropipeta adecuada.

II. Hacer un espectro de absorción entre λ=260/280 nm de las muestras de ADNp. Elegir en el
programa ADNp de doble cadena.

III. Una vez conocida la concentración de su muestra, realizará los cálculos necesarios para agregar 1  
μg de muestra para la electroforesis.

2.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa

ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es mutagénico y cuando se manipulen soluciones

que lo contienen deben tomarse las precauciones correspondientes. Usar guantes de
látex.

Preparación del gel:

I.- Se calientan hasta ebullición la agarosa en polvo y el buffer TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). Se
deja enfriar hasta 60ºC, se vierte sobre la placa previa colocación de un “peine” de teflón para generar
los pocillos en el gel. Al enfriarse se observará la polimerización de la agarosa al 0.7%. Pesar 0.7 g y
disolver en 100 mL de buffer TAE.

Preparación de las muestras:

II.- En cada tubo, poner 1 µg de la muestra correspondiente. Agregar 3 µL de "buffer de carga 6x" (0.25%
xilencianol, 0.25% azul de bromofenol, 30% glicerol). Se prepararán las muestras preparadas en la clase
anterior, junto a un marcador de peso molecular.

Migración:

III.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis. Verter buffer TAE en la cámara hasta cubrir el gel.
Cargar las muestras en cada pocillo con una micropipeta en el orden de numeración de los tubos.
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Conectar los electrodos a la fuente de poder. Fijar el voltaje en 100 V. Dejar migrar aproximadamente
60 min. Teñir en un recipiente con bromuro de etidio y enjuagar el gel con agua. Observar el gel sobre
un transiluminador de luz UV con protección adecuada. (ADVERTENCIA: la radiación UV altera el
ADN dañando la molécula. Estos daños genéticos pueden producir cáncer de piel,
también daños en los ojos, especialmente la córnea produciendo cegueras temporales).

PRELABORATORIO:

1. ¿Qué significa “electroforesis”?

2. ¿Qué es la agarosa?
3. ¿De que material están compuestos los electrodos de una cámara de electroforesis?
4. ¿Por qué se desprenden burbujas de los electrodos de la cámara de electroforesis?¿Que función tiene
el buffer que se adiciona a la cámara durante el proceso de electroforesis?
5. ¿Qué propiedad de los ácidos nucleicos se aprovecha en esta práctica para su separación?
6. ¿Hacia que electrodo migran los ácidos nucleicos durante la electroforesis?¿Por qué?
7. ¿Qué tipo de moléculas de ADN avanzan más rápidamente durante la electroforesis, las grandes o las
pequeñas?¿Por qué?
8. ¿Qué es el “efecto sonrisa”?
9. ¿Cuál es la estructura del bromuro de etidio y por qué se utiliza para evidenciar las muestras de ADN en
un gel de agarosa?¿Cuál es su sensibilidad?
10. ¿Qué es un “marcador de pesos moleculares”?
11. ¿Qué relación existe entre concentración de agarosa y capacidad de resolución de un gel?
12. ¿Para que se utiliza un “buffer de carga”?¿Cuáles son sus componentes?
13. ¿En un gel de agarosa al 1% ¿con que tamaño de bandas co-migra el xilencianol?¿Y el azul de
bromofenol?¿que tipo de compuestos son estos dos componentes del buffer de carga?
14. Partiendo de sus componentes, indique como prepararía 500 mL de TAE 50x y cómo lo utilizaría en el
laboratorio.
15. Partiendo de sus componentes, indique como prepararía 10 mL de buffer de carga 10x y cómo lo
utilizaría en el laboratorio.

EVIDENCIAS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE LA

PRÁCTICA
En este espacio se ponen las observaciones, graficas, cálculos matemáticos dibujos,
datos, esquemas, tabla de datos, etc. Que se generaron durante el desarrollo de la
práctica.

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN
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BIBLIOGRAFÍA

1.- Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2001. Molecular
Biology of the Cell. 4th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU

2.- Madriz, K. 2004. Manual de Laboratorio: Biología Molecular. Editorial Instituto

Tecnológico de Costa Rica. Cartago, C.R.

3.- QIAGEN plasmid mini Handbook, Marzo 1997. Sambrook, J & D, Russell. 2001.
Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1. Editorial CSHL. EE.UU.

4.- UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México). 2000. Bioquímica y Biología

Molecular Manuales departamentales. Editorial Mc Graw-Hill. México.