UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL SUR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

CURSO: BIOLOGÍA MOLECULAR

PROFESOR: HENRY PAICO

INFORME DE PRÁCTICAS
PRACTICA N°: 06

TITULO:

OBTENCION Y ANALISIS DE FRACCIONES CELULARES

INTEGRANTES:

FERNÁNDEZ ARÉVALO, PAULO CESAR.

SANCHEZ MURILLO, DAYANE.

LOZANO QUINTANA, VICTOR RODRIGO.

HORARIO DE PRÁCTICAS:

DÍA: LUNES.

HORA: 11:10 P.M. a 1:00 P.M.

FECHA DE REALIZACIÓN DEL PRÁCTICA:

LUNES 01 DE OCTUBRE DEL 2018.

FECHA DE ENTREGA DEL INFORME:

LUNES 15 DE OCTUBRE DEL 2018.

LIMA-PERÚ
INTRODUCCIÓN
 Hay muchos métodos para estudiar la composición celular, mas, si se
desea profundizar en la funcionabilidad de cada componente, se deben
realizar procesos más complicados. Una de estas es el Fraccionamiento
Celular.
 El Fraccionamiento Celular tiene como objetivo obtener fracciones puras
de organelos.
 Hay tres etapas: Homogenización, filtrado y centrifugación.
OBJETIVOS

 Identificar las fracciones celulares a partir del hígado del pollo.

 Deducir el rendimiento y pureza de cada fracción.
 Conocer la técnica de fraccionamiento celular para el estudio de las
organelas celulares.
 Usar colorantes que identifiquen organelas específicas celulares.

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MARCO TEÓRICO
FRACCIONAMIENTO CELULAR

 El fraccionamiento celular utiliza una o más propiedades de cada

compartimento, tales como la densidad de flotación, densidad de carga
superficial, forma y tamaño, y se basa principalmente en la
centrifugación diferencial en medios de alta viscosidad a 4°C.
 Los medios utilizados para la centrifugación diferencial son
principalmente sacarosa, manitol, glicerol, Ficoll 400 (un polímero de
sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep) 1.
 Al final, la pureza y el rendimiento del fraccionamiento deben ser
evaluados mediante la detección de distintos marcadores en cada
fracción recolectada durante todo el procedimiento 1.
 Se presentan los métodos utilizados más comúnmente para el
aislamiento de organelas 1.
 La separación de los compartimientos celulares es un paso importante
para estudiar una estructura intracelular, proteína u organela específica,
o para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras
macromoleculares 1.
 Ejemplos:

AISLAMIENTO DE CITOPLASMA, AISLAMIENTO DE MITOCONDRIA

NÚCLEOPLASMA Y CROMATINA POR CENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL
 Fracciones citoplásmicas,
nucleoplásmicas y  Los precipitados de células,
cromatínicas pueden ser crecidas como monocapa o
preparadas fácilmente a partir en suspensión, son
de un precipitado de células homogeneizados en un búfer.
cultivadas.  Existen protocolos que utilizan
 Las células son separaciones con gradientes
de densidad los cuales
resuspendidas en un búfer y
proveen fracciones
los núcleos son precipitados mitocondriales más puras,
mediante una centrifugación a pero utilizan más tiempo y son
baja velocidad mientras que el evitadas.
sobrenadante se mantiene  A pesar de la "contaminación"
como la fracción citoplásmica. por lisosomas y peroxisomas
 La fracción insoluble en las fracciones obtenidas
cromatínica es precipitada por centrifugación diferencial,
mediante una centrifugación a son el método de elección.

3
 baja velocidad mientras que el
sobrenadante es la fracción
nucleoplásmica 1.
 La pureza deseada determina
cuál es el método más
adecuado; si la localización
exacta de una proteína se
encuentra en estudio o son
necesarias muestras en su
forma más pura 1.

Todo proceso de Fraccionamiento Celular tiene tres etapas:

HOMOGENIZADO 3

 Ruptura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular),

de tal modo que se liberen sus componentes organelas sin que estos
sufran mayores daños y que se encuentren en condiciones adecuadas
para su purificación 2.
 La ruptura es el método mecánico, donde se hace uso de instrumentos
como el mortero, pinzas, homogeneizadores y ultrasonido que permiten
la disgregación y lisis celular 2.
 En un cultivo celular, no es necesario separar las células y se pasa
directamente a la lisis celular 2.

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  El uso de detergentes, enzimas y el shock osmótico. También cumplen
con la función de romper y lisar la membrana celular 2.
FILTRADO
 Separación de componentes no deseados presentes en la suspensión
celular mediante un medio poroso, que retiene sólidos y permite el
pasaje del líquido 2.
 Dependiendo de la naturaleza del contaminante, puede ser tan simple
como verter el homogeneizado a través de una gasa y recoger el filtrado
en el otro lado 2.
CENTRIFUGADO 3
 La centrifugación de
gradiente de densidad o
también el de
centrifugación diferencial,
es cuando los diferentes
componentes celulares se
encuentran suspendidos
en un líquido, tienden a
sedimentar hacia el fondo
por el efecto de la
gravedad 2.

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PROCEDIMIENTOS

1. Retirar el hígado de pollo de su envase, asegurarse de retirar lo

innecesario para la práctica. Colocar el hígado en el mortero tener en
cuenta el uso correcto del mortero para obtener una pasta uniforme,
moler bien y de extraer los ligamentos conjuntamente con la grasa.
Asimismo adicionar 20 ml de la solución Tris 10 mM pH 7,5. Después
verter la pasta en una gasa para que se filtre en un beaker limpio.
2. Con el resto líquido que se extrajo, separa 250 μl del extracto a 2 tubos
eppendorf y agregue 500 μl de la solución de buffer Tris 10 mM pH 7,5.
Rotulándose con la palabra núcleo y mitocondria. Centrifugue a 3000
rpm durante 3 minutos. Se obtendrá el pellet que ha quedado *fracción
nuclear* y resuspender.
3. El sobrenadante del proceso anterior se coloca
en 2 ependorf nuevos que están marcados con
la palabra mitocondrias, paso
anteriormente realizado. Después
se centrifuga a 10000 rpm durante
8 minutos.
El pellet que ha quedado es la
fracción mitocondrial, se debe de
eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μl
de buffer Tris.
4. Se observa la fracción nuclear, colocando 10 μl del resuspendido del
tubo marcado como núcleo, en una lámina porta objeto y se le adiciona
una gota de Azul de metileno, respectivamente se cubre con una lámina
cubreobjeto. Finalmente se realiza las observaciones en el microscopio
de campo claro y se desarrolla los esquemas respectivos.
5. En el microscopio se observa las mitocondrias,
donde se toma el tubo marcado como mitocondrias y en un
ependorf de 0,5 ml adicione 5 μl del resuspendido y 5 μl del
colorante mytotracker dejándo incubar por 10 min a 37°C.
En otro ependorf de 0,5 μl realice la misma operación y
adicione 5 μl del colorante verde de Janus.

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MATERIALES

MATERIALES DEL LABORATORIO

 1 Mortero.
 1 Gasa.
 16 tubos ependorf de 1,5ml.
 2 beaker de 100ml.
 100ml de Verde de Janus.
 1 cubeta con hielo.
 1 beaker de 50ml.
 100ml de Buffer Tris 10Mm Ph
7,5
 1,5ml de colorante DAPI
 1,5ml de Mytotracker.
 1 caja de láminas y laminillas.
 Microscopio de campo claro y
de fluorescencia.

MATERIALES DEL ESTUDIANTE

 10gr de hígado de pollo.

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RESULTADOS

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS
 Teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante la práctica de
laboratorio sobre obtención y
análisis de fracciones
celulares, es necesario realizar
un análisis especifico acerca
de los aspectos más
importantes sobre el método
usado como es el
fraccionamiento celular que
permite determinar la
presencia de organelos
específicos y componentes
celulares para su estudio; es
decir obtener fracciones puras o determinado componente celular. Ya
que dicho fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica
y fisiología de orgánulos fuera del ambiente complejo de la célula
intacta.
 La separación de los compartimientos celulares es un paso importante
para estudiar una estructura intracelular, proteína u organulo específica,
o para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras
macromoleculares.
 Para lo cual se utilizó el hígado de pollo, en este caso el hígado presenta
muchas estructuras que no
queremos visualizar puesto
que necesitamos centrarnos en
lo que queremos que es
homogenizar, filtrar y purificar
la muestra para obtener lo que
nos interesa.
 Deberá colocarse o juntar
ciertos colorantes con ciertas

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 estructuras, y no pudiendo colocar diferente colorante sino el que
corresponde, tiene que ser carácter básico haciendo que el azul de
metileno lo neutraliza haciendo visible.
 Asimismo, el microscopio ayuda a poder apreciar con mayor exactitud
sus partes.
 El fraccionamiento celular es una técnica bioquímica utilizada para
separar los distintos orgánulos y componentes celulares para su estudio.
La técnica se inicia con la homogeneización. El tejido se tritura en un
homogeneizador de manera que las células se comprimen y se libera su
contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a
diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de
manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos
orgánulos
 Para la obtención de los resultados se tuvo que seguir las tres etapas
del proceso de Fraccionamiento Celular las cuales son: homogenizado,
filtración y centrifugación, cabe resaltar que para este último se utilizó un
nuevo material de laboratorio llamado pipeta eppendorf.
 Otro punto que resaltar fue un dato que el profesor nos brindó, el cual
fue que los tubos de eppendorf al colocarlos en la máquina de
centrifugado deben estar siempre uno frente al otro para mantener el
equilibrio balanceado.

CONCLUSIONES
 En esta práctica de laboratorio que el procedimiento debe hacerse en
temperaturas fría para mantener el BUFFER TRIS y este a su vez nos
ayude a limpiar unas encimas de la célula para que sea más fácil
observarla.
 Aprendimos que el colorante azul de metileno le da un color a la célula,
pero por ser una solución base puede ser absorbida mejor por algunos
organelos para reconocerlas de mejor manera.
 Se logró realizar exitosamente el experimento dándonos así la
apreciación de la fracción celular el cual es el primer paso para
profundizar en la funcionabilidad de cada componente celular.

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 Se determinó fracciones celulares como la fracción nuclear y las
mitocondrias; ambas observadas en dos tipos de microscopios tanto de
campo claro como de fluorescencia, aunque este último lo vimos por
medio de el proyector.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Carbajal A. Fraccionamiento subcelular [Internet]. Labome.es. 2013

[cited 2 May 2018]. Available from:
http://www.labome.es/method/Subcellular-Fractionation.html
2. Del Pino J, Alvis R, Liviac D, Guillen G. Manual de Practica Biología
Celular. Lima: UCSUR; 2018.
3. [Internet]. Portal.uah.es. 2005 [cited 1 May 2018]. Available from:
https://portal.uah.es/portal/page/portal/universidad_mayores/descarga_m
aterial_docente/material_ciencias_naturales/documentos/tema_2_celula.
pdf

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