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PRACTICA N° 04

Purificación de proteínas de la leche (caseinas)

Introducción.- en bioquímica es muy común purificar proteínas para estudiar su


composición, estructura y de ser posible su función, cada proteína tiene su
función aminoácidos específica, por lo tanto su comportamiento en disoluciones
también es diferente. Lo general las proteínas fibrosas son solubles en agua.

La composición de aminoácidos es responsable del comportamiento de las


proteínas en diferentes condiciones de PH así al acidificar o alcalinizar una
determinada proteína.

La leche es un producto rico en proteínas, tales como la caseína y glóbulos,


además de contener carbohidratos y ácidos grasos. De la leche se puede
separar la casina por precipitación en un punto isoeléctrico es de PH.4°6.

En la leche de vaca, la casina es la proteína más abundante constituyendo el


80 % del total. El 20% lo constituye las sero proteínas (lacto globulinas alfa y
beta, sero albumina e inmunoglobulina)

Materiales:

 01 probeta de 100 ml.

 01 Probeta de 50 ml.

 02 vasos de precipitados de 250 ml.

 01 vaso de precipitados de 100 ml.

 01 pipeta graduada de 5 ml.

 05 tubos centrifuga de 5 ml.

 01 embudo de filtración.

Reactivos:


HCL
 Acido acético gracial
 Etanol
 Acetona
 Éter – etílico

Procedimiento:

Obtención de la caseína

 Colocar 100 ml. De leche descremada en un vaso de precipitado de 250


ml. Junto con el agitador magnético y agitar suavemente sobre la
parrilla.
 Calibrar el potenciómetro las soluciones patrón de PH 4
 Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el
agitador magnético.
 Adicionar lentamente con una pipeta Pasteur, la solución de HCL al 20%
hasta ajustar el PH 46.
 En el punto 180 eléctrico se formara un precipitado voluminoso. En ese
momento se obtiene la agitación y se deja reposar durante 10 minutos a
temperaturas ambiente.
 Preparado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 80 ml. De
agua y agitar sobre una parrilla con un agitador magnético, hasta
obtener un suspensión homogénea, este lavado es para eliminar el HCL.
 Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma
extendida, para que se forme un polvo.
 Luego pese la proteína obtenida, tome una alícuota e identifique con el
reactivo de Biuret. Observe y reporte.

Resultados:

Hemos seguido bien el procedimiento la obtención de caseína lo cual se a


coabolado el precipitado el PH. En buen condición.

Conclusiones:

Esta proteína tiene un valor importante en masas de concentración me alegra


esta práctica y aprendo algo de purificación de proteínas.
CUESTIONARIO:

1. ¿Qué tipo de proteínas son la caseína y la albumina estructural y


funcional?

La caseína es una proteína de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de


la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un
grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que
contiene ácido fosfórico, por lo tanto su molécula contiene un elemento fósforo.
La caseína representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes
en la leche y el 2.7 por ciento en la composición de la leche líquida.

La albúmina es la proteína más abundante en la sangre. Es fabricada por el


hígado pero también la proporcionan ciertos alimentos, especialmente la leche
y los huevos. La albúmina desempeña una gran variedad de funciones que
hacen que sea esencial para el organismo. De hecho, es necesaria, entre otras
cosas, para la buena distribución de los líquidos entre las diferentes
estructuras: los vasos sanguíneos, los tejidos y el espacio entre ellos llamado
espacio intersticial. También transporta algunas hormonas, los ácidos grasos y
la bilirrubina. En la sangre, la tasa de albúmina o albuminemia disminuye en
caso de malnutrición o de síndrome nefrótico, enfermedad renal que es
responsable de la filtración de proteínas por la orina.

2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?

Extracción

La extracción es una técnica de aislamiento de proteína en la que el tejido se


divide en una solución para obtener la proteína a estudiar. El tejido se somete a
procedimientos tales como ciclos de congelación, sonicación,
homogeneización, filtración o permeabilización utilizando disolventes orgánicos.
Después de que las proteínas solubles han sido separadas de las no solubles,
la proteína de interés puede separarse de las membranas celulares y
finalmente se extrae el ADN.

Precipitación y solubilización diferencial


La precipitación y solubilización diferencial es una manera rentable de aislar
proteínas a granel. Este método utiliza la precipitación con sulfato de amonio,
durante el cual se añade al tejido este compuesto de manera creciente con el
fin de recoger las diferentes fracciones de la proteína precipitada.

Ultracentrifugación

Otra técnica de aislamiento de proteína es la ultracentrifugación, que utiliza la


fuerza centrífuga por medio de un dispositivo de ultracentrífuga para separar
partículas de diferentes masas de una mezcla dada. Las partículas presentes
en la mezcla se mueven hacia afuera de acuerdo con su masa, con las
proteínas menos densas girando más lentamente que las más densas. Cuando
se centrifuga el tiempo suficiente, las proteínas se segregan en función de su
densidad, ya que permanecen en suspensión en los lugares en los cuales su
densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga aplicada. Hay dos
tipos de técnicas de ultracentrifugación: centrifugación y centrifugación en
gradiente de sacarosa.

Cromatografía

También se pueden aislar proteínas por medio de un procedimiento de


cromatografía. Una mezcla de proteínas se vierte en una columna rellena de
diferentes materiales con los cuales pueden interactuar las proteínas
presentes. Las proteínas se detectan de acuerdo al material con el que
interactúan así como por su nivel de absorbencia. Existen muchos
procedimientos de cromatografía, como exclusión de tamaño, interacción
hidrófoba, intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad, de unión a metal
y cromatografía líquida de alto rendimiento.

Concentración

Una vez terminado el proceso de aislamiento, la proteína separada se somete


a un proceso de concentración como liofilización, en el que la proteína se seca
y se separa de todas las demás partículas solubles mediante ultrafiltración,
donde la solución de proteína se pasa a través de membranas permeables por
medio de bombas o centrifugación. Una vez concentrada, la solución de
proteína se puede utilizar para el estudio.
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína? Y ¿Por qué las
proteínas precipitan?

Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones
hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga
neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el
cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el
movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es
prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico.

4. ¿Qué efectos tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?

 La precipitación es alta debido a que la constante dieléctrica es inferior a


la del agua.
 Los solventes interaccionan con el interior hidrofobico de las proteínas.
 Modifican la constante dieléctrica del medio e hidratación de las
proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su
desnaturalización y precipitación.
 La polaridad del disolvente en el que se encuentra la proteína disminuye
cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como el
etanol o la acetona.
 La estructura ordenada del agua alrededor de los aminoácidos
hidrofobicos es desplazada por el solvente.
 El principal efecto de los solventes es la reducción del poder de
solvatación del agua que puede ser explicado en términos de una
reducción de la constante dieléctrica del agua
 Las principales causas de agregación de las moléculas proteicas son las
fuerzas electrostáticas y dipolares.
 Los solventes se utilizan a bajas temperaturas (0ºC).
 El pH y la fuerza iónica deben estar claramente definidos
 Los más utilizados son: alcohol isopropilico, butanol, acetona, etanol
5. ¿El precipitado de caseína apareció exactamente a PH 4? 60
requirió acidificar más?

6. ¿Para que tuvo que lavar la caseína con agua?


Se realiza el lavado con agua para obtener en suspensión homogénea,
este lavado es para eliminar el HCL.

7. ¿Los lavados con los solventes orgánicos eran necesarios? ¿Por


qué?

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