INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS

PRACTICA: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS
AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA POR
INTERCAMBIO IÓNICO.

ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN

GRUPO: 4IM2 SECCION: 3

PROFESOR: FRANCISCO CARMELO FERNÁNDEZ LÓPEZ

OBJETIVO
 Separar una mezcla de dos aminoácidos empleando una técnica de
intercambio iónico.
 Comprobar la separación mediante una reacción colorida.
 Realizar un perfil de elución.
FUNDAMENTO
El intercambio iónico es una operación de separación basada en la transferencia de
materia fluido-sólido (Nevárez 2009; Pérez et al, 2006). En el proceso de
intercambio iónico ocurre una reacción química en la que los iones móviles
hidratados de un sólido son intercambiados por iones de igual carga de un fluido
(Choi, 2002).
Este proceso consiste en pasar el fluido sobre un intercambiador catiónico y/o
aniónico sólido, reemplazando los cationes y/o aniones por el ion hidrógeno (H+)
y/o el ion hidroxilo (OH) respectivamente (Manahan, 2007).
La eficiencia de este proceso depende de factores como la afinidad de la resina por
un ion en particular, el pH del fluido, la concentración de iones, la temperatura y la
difusión.
Cuando el intercambiador iónico generalmente sólido posee en su estructura cargas
negativas será capaz de retener e intercambiar iones cargados positivamente,
llevándose a cabo la reacción de intercambio catiónico.
RESULTADOS
Volumen 400nm 570nm Volumen de elución 570nm
de elución (mL)
(mL)
3 -0.134 63 0.920
6 -0.126 66 1.113
9 -0.160 69 1.234
12 -0.130 72 1.727
15 0.250 75 1.578
18 0.603 78 1.106
21 0.728 81 1.084
24 0.661 84 0.740
27 0.570 87 0.396
30 0.485 90 0.536
33 0.415 93 0.662
36 0.422 96 0.379
39 0.476 99 0.149
42 0.519 102 0.077
 45 0.550 0.493 105 0.053
48 0.701 0.695 108 0.078
51 0.643 0.640 111 0.087
54 0.610 114 0.048
57 0.650 117 0.016
60 0.604 120 0.013
Tabla 1. Separación de prolina e histidina

Perfil de elucion.
Absorbancia

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 ml
0 20 40 60 80 100 120 140
400nm
570nm

a) ¿Cuál de los dos aminoácidos eluyó primero? Explíque por qué.

Aminoácido Valores de pka Punto

+
pk1 (-COOH) pk2 (-NH3 ) pkR (grupo isoeléctrico
R)
Prolina 1.99 10.96 - 6.48
Histidina 1.82 9.17 6.00 7.59

La prolina fue el primer aminoácido en eluir debido a que la fase móvil que
se utilizó en primera instancia fue el regulador de citratos de pH 5.25. De
manera que la prolina quedo con una carga neta de 0 porque de acuerdo con
el pk del COOH, este pierde su hidrógeno con un pH mínimo de 2. En cambio,
la histidina a pesar de que el COOH también pierde su hidrógeno a este pH,
conserva la carga +1 por su grupo R.
Por lo tanto, la prolina fluye junto con la fase móvil porque no puede
interaccionar con la resina.

b) ¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución, que pasa a altas

y a bajas velocidades?
 Cuidar la velocidad permite que la separación se lleve a cabo de manera
correcta, ya que a una alta velocidad no hay una suficiente interacción entre la
resina y la mezcla por lo tanto la separación será ineficiente o no habrá
separación, si la velocidad es baja existen mayores interacciones entre la mezcla
y la resina, provocando que haya menor elución y el proceso requiera de mayor
tiempo.
c) Empleando las fórmulas de los aminoácidos y del grupo funcional del
intercambiador, haga un esquema de cómo se produjo la separación.
Considere el cambio de pH en el medio.

DISCUSIÓN
Como se menciona en la introducción la eficiencia de este proceso se ve
influenciado por el pH, por esta razon el uso de reguladores a diferentes pH fue
indispensable para esta sesión. Al cambiar el pH de la fase móvil pudimos separar
una mezcla de aminoácidos. Para poder apreciar esta separación, hicimos
reaccionar con ninhidrina cada uno de los tubos donde se recogían las muestras.
De inmediato pudimos apreciar que el primer aminoácido en eluir fue la prolina
porque a diferencia del resto de los aminoácidos, al reaccionar con la ninhidrina
brinda un característico color amarillo por su amina secundaria (imino), seguido de
la histidina que presentó un color morado.
Pudimos comprobar el orden de elución cuando buscamos el valor de sus pka’s en
la bibliografía. De acuerdo con el valor del pka del grupo carboxilo de la prolina, este
se desprotona con un pH mayor a 1.99 de manera que cuando usamos el regulador
de citratos de pH 5.25, la prolina presentaba una carga neta de 0 de manera que
eluyó en primer lugar porque no interactuaba con la resina, mientras que la histidina
permaneció en la columna. Posteriormente al añadir el regulador de citratos de pH
2, es tal la concentración de grupos hidronios que desplazan a la histidina de la
resina provocando que eluya y que de esta manera la resina vuelva a regenerarse.
Como se aprecia el perfil de elución la separación no salió como se esperaba, a
pesar de que consideramos que nuestras diluciones fueron las correctas, obtuvimos
absorbancias mayores a 1 con la histidina. El principal problema fue que no se
considero una correcta dilución para leer en el espectrofotómetro ya que se pensó
que agregar 2 mL mas de agua sería suficiente pero no fue asi. El perfil de elución
también muestra algunas mesetas lo cual puede deberse a que al obtener la
muestra los volúmenes no eran exactamente los mismos, además de que se perdió
parte del volumen al momento de mover los tubos, otra razón puede ser que, como
la ninhidrina esta disuelta en etanol, después de calentar se removió
apresuradamente el tapon de canica en los tubos por lo que la concentración de la
muestra podía variar. En la lectura, las celdas al no encontrarse en las mejores
condiciones porque presentaban ralladuras, provocaron que las absorbancias que
leímos tuvieran errores.
CONCLUSIÓN
 Se puede lograr llevar a cabo una separación de una mezcla de aminoácidos
con ayuda de una resina catiónica débil y fases móviles con distintos pH.
 La reacción con la ninhidrina, así como el perfil de elución nos ayuda a
comprobar si la separación se llevó a cabo de manera correcta.
BIBLIOGRAFÍA
 Lehninger, A. L., Nelson, D. L., y Cox, M. M., 2006. Principios de
Bioquímica. 4a Edición. Ed. Omega. Pp.82-84. ISBN:84-282-0924-3.
 H. Ayres, “Análisis químico cuantitativo”. 1970. Editorial Castillo. 7°
Reimpresión. Madrid, España. pp. 464-468.