“Dialogo y Reconciliación Nacional”

Facultad de Ciencias Ambientales

Ingeniería Ambiental

INFORME DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

COLUMNA DE WINOGRADSKY

DOCENTE
Paico Montero, Henry Alonso
ALUMNO
Chipana Gabriela
Chávez Virna
Suarez Ana
Luciano Delia
CURSO
Microbiología Ambiental
FECHA DE ENTREGA
16/11/2018
 ÍNDICE
I. ................................................................................................................................................ 2

II. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3

III. OBJETIVO ...................................................................................................................... 4

2.1. Objetivos General ............................................................................................................ 4

IV. MARCO TEORICO .......................................................................................................... 4

V. MATERIALES ..................................................................................................................... 8

VI. PROCEDIMIENTO .......................................................................................................... 9

Aislar bacterias de cada capa ................................................................................................. 9

Tinción Gram de cada capa.................................................................................................... 9

VII. RESULTADOS ................................................................................................................ 9

VIII. CONCLUSIONES ...........................................................................................................15

IX. RECOMENDACIONES ..................................................................................................15

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................15

 I. INTRODUCCIÓN
Conocer la estructura y composición de un determinado microorganismo es de vital importancia
dado que al estar presente en nuestro ecosistema deberemos saber cómo se relaciona con el
hombre o como pueda tener un uso a nivel industrial. Muchos de estos microorganismos han
podido ser utilizados por el ser humanos en diferentes industrias para lograr generar productos
de interés. Estos pueden ser para la fermentación en la industria cervecera, vacunas que pueden
significar el avance en medicina, elaboración de alimentos, industria textil, entre otras (Cifuentes
& Espinosa, 2008).
Aunque existan diferentes medios de cultivo, podemos agruparlos según su estado físico, en
sólidos, líquidos y semisólidos, pero también según su utilización. En práctica para hacer un
aislamiento de un cultivo de hongos es posible utilizar el agar Rosa Bengala o el Sabouraud, esto
es posible ya que estos solo permiten el crecimiento de hongos y esporas debido a que poseen
cloranfenicol, un pH neutro y altas concentraciones de glucosa (INSTRUCCIONES DE USO -
Medios en placa listos para usar, 2013).
Las bacterias pueden clasificarse en Gram positivas o en Gram negativas dependiendo de la
composición de su pared celular. Las Gram negativas poseen una capa delgada de péptido
glucano y una membrana externa, mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de
péptido glucano y carecen de membrana externa. La tinción de Gram es una técnica diferencial
que permite hacer la clasificación descrita anteriormente, para ello, la muestra es puesta en
contacto con cristal violeta, el cual tiene afinidad con el péptido glucano y tiñe la pared de color
morado, después se adiciona lugol para formar un complejo cristal violeta-yodo y así evitar la
salida del cristal violeta. Posteriormente se añade una mezcla alcohol-acetona la cual deshidrata
la pared bacteriana y cierra sus poros. Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal
violeta-yodo debido a que presentan en mayor proporción péptido glucano, mientras que las
bacterias Gram negativas se decoloran al no poseer gran cantidad de esta estructura.
Finalmente, se añade safranina, el cual es un colorante secundario, que tiñe de rosado las
bacterias que se decoloraron previamente (Gram negativas).
Por medio de esta práctica se busca reconocer las diferencias macroscópicas y microscópicas
de las bacterias y hongos. Para lo anterior es necesario conocer las diferentes técnicas de
siembra y aislamiento de estos microorganismos, utilizando cultivos enriquecidos, selectivos y
diferenciales para dicho fin.
 II. OBJETIVO
2.1. Objetivos General
 Diferenciar las Gram Positivas y las Gram Negativas

2.2 Objetivos Específicos

 Aplicar el método para reconocer las Gram Positivas y las Gram negativas

 Identificar la composición de las Gram positivas y las Gram negativas.

III. MARCO TEORICO

Todas las formas de vida en la Tierra dependen de reacciones de oxidación y

reducción que operan mediante transferencia de electrones. En los sistemas vivos, estas

reacciones redox aparecieron originalmente en microorganismos procariotas y forman

en la actualidad un verdadero circuito electrónico dentro de la biosfera (Gacto, 2017).

Realizar el estudio de estos microorganismos es muy complicado, es por ello que para

conocer estas reacciones se utiliza la columna de Winogradsky.

Se simplifica el campo de estudio por medio de la Columna de Winogradsky,

donde en una representación de ecosistema anaeróbico microbiano simple, se pueden

estudiar fácilmente los ciclos biogeoquímicos, las relaciones y diferencias entre

diferentes tipos de microorganismos de distintas comunidades y metabolismos

energéticos; además permite observar cómo los microorganismos altamente específicos

ocupan micro espacios dependiendo de sus necesidades de supervivencia y

reproducción, como sus requisitos de carbono, energía y oxígeno. Esta simulación de

ecosistema, sólo requiere de energía lumínica para su mantenimiento, es autónomo y

completamente auto reciclable (Moreno, 2012).

 La columna de Winogradsky es una técnica utilizada para el estudio de

microorganismos que podemos encontrar en el medio ambiente. Fue desarrollada

inicialmente por el microbiólogo ruso Sergey Winogradsky (1853-1956), constituye un

modelo de ecosistema, similar a los tapetes microbianos que se hallan en aguas dulces

o saladas, donde proliferan microorganismos del medio acuático y de los sedimentos,

principalmente bacterias fotosintéticas (Pérez, 2008). A través de esta columna se

espera explicar la que hay relación entre los microorganismos con su hábitat.

La construcción de la columna de Winogradsky se hace en un recipiente

transparente donde se adicionan muestras de suelo húmedos, que se enriquecen con

materiales orgánicos e inorgánicos, posteriormente el recipiente se expone a la luz

natural (Santos, 2009); Con el tiempo, a medida que la columna empieza a madurar, se

produce una serie de reacciones que crean gradiente químicos en los que se desarrollan

miembros particulares de la comunidad microbiana (Preston, Harley & Klein, 2004).

Pueden construirse Columnas de Winogradsky para cada ciclo biogeoquímico, la

Columna más usada para prácticas de laboratorio es en la que involucra el ciclo del

azufre como elemento principal.

Partes de la columna de Winogradsky

a) Zona Aeróbica: Encontramos organismos aeróbicos que generalmente se

encuentran en los hábitats acuático ricos en materia orgánica. Suelen ser

flagelados o ciliados, lo que les permite movilizarse. También encontramos

microorganismos fototróficos utilizados en el montaje de la columna. Esta zona

es rica en oxígeno y pobre en azufre. Las bacterias obtienen energía oxidando el

 H2S a azufre elemental y sintetizan su propia materia orgánica a partir de CO2.

(Gómez, Ruiz, Silias & Zorrilla; 2016)

b) Zona Microaerfilia: Se caracteriza por presentar una concentración parcial de

oxígeno y de azufre, en ella se desarrollan principalmente los organismos

facultativos y donde podemos encontrar algunas bacterias sulfatos reductores y

bacterias fotoheterótrofos como el Rhodospirillum y rhodospseudomonas que no

se desarrollan bien en concentraciones altas de H2S, en la columna se identifican

por su coloración naranja. (Salazar, Muñoz & Pérez, 2012)

c) Zona Anaeróbica: En la zona inferior (baja concentración de oxígeno) se

desarrollan organismos que desempeñan procesos fermentativos produciendo

alcohol y ácidos grasos como subproductos de su metabolismo. Estos productos

metabólicos son a su vez el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de

sulfato. Como resultado se liberan productos sulfurados que difunden a la zona

superior creando un gradiente de sulfuro de hidrógeno ascendente, donde

bacterias púrpuras y verdes se estratifican según su tolerancia al sulfuro de

hidrogeno. (Alfaro & González, 2016)

Principales reacciones (desde la parte superior a la inferior en la Columna de

Winogradsky)

CO2 + 2 H2O  (CH2O) + H2O + O2 Fotosíntesis

SH2 + 2 O2  H2SO4 Organismos del S

2 SH2 + O2  2 S + 2 H2O Beggiatoa y Thiothrix

CO2 + 2 SH2  2 (CH2O) + 2 S + H2O Anoxigenica

(CH2O)2 + SO4-2 + 8 H+  3(CH2O) + CO2 + S-2 + H2O Quimioorganotrofo y anaeróbico

En las dos últimas capas de la columna, las Cianobacterias producen la fotosíntesis

usando el agua como cedente de electrones con liberación de oxígeno molecular, por

ende se produce una zona oxigénica (Sagardoy, 2004).

 IV. MATERIALES

 Placas de Petri
 Agar Sabouraud
 Agar minimo mineral
 Agar Sulfito
 Agar Azufre
 Agar Hierro
 Agar Cobre
 Agar Celulosa
 Agar Carbonato
 Asas de siembra
 Asas de Digralsky
 Mechero Bunsen
 Laminas portaobjetos
 Cristal Violeta
 Lugol
 Acetona
 Safranina
 Microscopio
 Pipetas de 1 ml
 Columna de Winogradsky
 V. PROCEDIMIENTO
Aislar bacterias de cada capa
1. Tomar con ayuda de una pipeta o de un asa de siembra las bacterias
de cada capa en la columna
2. Sembrar las bacterias en placas de medio mínimo con Sulfatos, sulfitos,
carbonatos, compuestos con cobre, celulosa, hierro. Las bacterias de
cada capa de la columna corresponden a un diferente agar.
3. Incubar a temperatura ambiente por 48 h.

4. Hacer la descripción de cada colonia.

Tinción Gram de cada capa

1. Tomar con ayuda de una pipeta o de un asa de siembra las bacterias de
cada capa en la columna.
2. Lentamente secar la mancha en el portaobjeto con la flama del mechero.
3. Una vez seco, agregar unas gotas de cristal violeta y esperar 1 minuto
4. Lavar con el chorro de agua
5. Secar la lámina y agregar lugol, dejar actuar unos 5 segundos
6. Agregar alcohol acetona y lavar con agua
7. Agregar safranina, esperar de 0.5 a 1 minuto y lavar.
8. Secar la lámina en la flama.
9. Observar al microscopio, primero 10x, luego 40x y finalmente 100x.

VI. RESULTADOS

Agar Sulfato Agar Agar Cobre Agar Hierro

Sabouraud
 Agar Azufre Agar Mínimo
Agar
Mineral
Carbonato

Agar Celulosa

Placas que demuestran crecimiento de las bacterias

AGAR AZUFRE:

Se observó crecimiento de
bacterias esféricas, blancas,
posiblemente de la familia
Chromatiaceae
 AGAR HIERRO

Se observó crecimiento de bacterias

marrones puntiformes, degradadoras
y formadoras de hierro.

AGAR CELULOSA

Se observó crecimiento de
bacterias blancas,
posiblemente de la especie
Clostridium

En las demás placas no se observó crecimiento. Se asume que hay tres posibles
causas:

 El agar no se preparó adecuadamente

 El encargado de estriar las placas, no las realizo de manera adecuada
 Las placas no se incubaron el tiempo suficiente
 TIPO DE
CLASIFICACIÓN NOMBRE AGAR GRAM DIBUJO
MICROORGANISMO

FOTAUTÓTROFOS
(FOTOSÍNTESIS
CIANOBACTERIAS - A. SABOURAUD BACILOS NEGATIVOS
OXIGÉNICA)

DEGRADADORAS DE
QUIMIOHETERÓTROFOS - A. COBRE BACILOS POSITIVOS
COBRE

QUIMIOAUTÓTROFOS PÚRPURA NO DE AZUFRE THIOBACILLUS A. AZUFRE BACILOS POSITIVOS

 BACILO NEGATIVO

PÚRPURA DEL AZUFRE CHROMATIUM A. SULFITO

BACILO NEGATIVO

FOTOAUTÓTROFO
(FOTOSÍNTESIS
ANOXIGÉNICA)

MICROAERÓFILA
HONGO 1

VERDE DEL AZUFRE CHLORIDIUM A. SULFITO

HONGO 2
 DEGRADADORA DE
- A. CARBONATO BACILO POSITIVO
CARBONATOS

LITÓTROFO

A. MÍNIMO
METANOGÉNICAS METHANOMICROBIUM BACILO NEGATIVO
MINERAL

HETERÓTROFO SULFATOREDUCTORAS DESULFOVIBRIO A. HIERRO BACILO NEGATIVO

QUIMIOHETERÓTROFO

SAPRÓFITA CLOSTRIDIUM A. CELULOSA BACILO POSITIVO

 VII. CONCLUSIONES
 La Columna de Winogradsky nos permitió observar la representación de la
evolución de los diferentes microorganismos que existen.
 Podemos observar que las bacterias se desarrollan en cultivos que poseen los
nutrientes que necesitan y las condiciones acordes a su tipo de metabolismo.

VIII. RECOMENDACIONES
 El aislamiento de las bacterias presentes en la columna debe realizarse tomando
las precauciones necesarias para evitar algún tipo de error que posteriormente
impedirá el crecimiento de las bacterias en los distintos tipos de Agar.
 Al momento de realizar la columna de Winogradsky, colocar cantidades
equilibradas de los nutrientes para que todas las capas se puedan desarrollar
de igual manera.
 Desmantelar la columna con precaución, evitando que se mezcle el contenido
de las capas.
 Se recomienda ir eliminando el contenido de las capas superiores conforme se
vayan tomando las muestras para que sea más fácil el acceso a las capas
inferiores.
 Usar mascarillas de protección, ya que al desmantelar la columna emite gases
con olores intensos.
 Eliminar el contenido de la columna junto con los residuos peligrosos.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alfaro, D &Gonzales, C. (2016). Construcción de una columna de Winogradsky.

Recuperado de https://es.scribd.com/document/319911486/Columna-de-

Winograsky-Reporte

Gacto, F.M. (2017). La columna de Winogradsky. Diario La Verdad. Recuperado de

https://www.um.es/acc/la-columna-de-winogradsky/

Gómez, M; Ruiz, A; Silias, c & Zorrilla, M. (2016). Columna de Winogradsky.

Recuperado de https://es.slideshare.net/cinthiasiliasfarelo/practica-

columnadewinogradsky
Pérez, J. P. (2008). LA COLUMNA DE WINOGRADSKY UN EJEMPLO DE

MICROBIOLOGÍA BÁSICA. Revista Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de

las Ciencias. Recuperado de http://www.redalyc.org/pdf/920/92050311.pdf

Prescott, L. M., Harley, J. P., & Klein, D. A. (2004). Microbiología. Recuperado de

https://ebookcentral.proquest.com

Moreno, R. (15 de Julio de 2012). Revista Reduca. Recuperado el 12 de Mayo de 2013,

de http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/966/997

Sagardoy M. (2004). Biología de estudio, Bahía Blanca Argentia Universidad Nacional

del Sur

Salazar, A; Muñoz, M & Pérez, M (2012). Columna de Winogradsky. Recuperado de

https://www.academia.edu/8201405/COLUMNA_DE_WINOGRADSKY_1

Santos, A. (13 de Julio de 2009). Revista Reduca. Recuperado el 12 de Mayo de 2013,

de http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/802/818