Establishment and characterization of a GES-1 human gastric epithelial cell

line stably expressing miR-23a

Tania Aravena; Melany Opazo; Dafne Reyes; Francisca Valenzuela
1. ¿Cuál es el objetivo del paper? 3. ¿Cuáles son las conclusiones del
paper?
El objetivo del paper fue analizar el
mecanismo de acción y función de miR- Los miARN desempeñan un papel
23a involucrado en el cáncer gástrico y en fundamental en distintos procesos
una línea celular del epitelio gástrico patológicos que están relacionados con la
humano (GES-1), mediante técnicas de proliferación celular, la diferenciación de
ingeniería genética y cultivo celular. células madres, la tumorogénesis, el
desarrollo neuronal, la apoptosis y
2. Mencione las técnicas de trabajo
carcinogénesis.
utilizadas y describa las
correspondientes a cultivo celular Mediante los ensayos MTT y Transwell, se
demostró como los genes miR – 23a
Las técnicas utilizadas en el trabajo son
desempeñan un papel como oncogén en
microarray, ensayo MTT, Transwell, RT-
la carcinogénesis gástrica.
PCRsq y recuento de células.
El MTT es un ensayo colorimétrico para
4. ¿Para qué y cómo utilizaron las
evaluar la actividad metabólica celular,
técnicas ensayo MTT y Transwell?
siendo posible determinar el efecto
citotóxico de un agente sobre líneas El ensayo MTT se utilizó para identificar la
celulares tumorales o cultivos primarios sobreexpresión de miR-23a, el cual
de células normales. aumentaba significativamente la
velocidad de proliferación y la viabilidad
Transwell es un ensayo de migración, el
de las células epiteliales gástricas. Esto
cual es una prueba comúnmente utilizada
mediante la reducción metabólica
para estudiar la respuesta migratoria de
determinando la funcionalidad de las
las células endoteliales a los inductores o
mitocondrias de las células utilizadas.
inhibidores angiogénicos.
El ensayo Transwell se empleó para
El recuento celular es una técnica
determinar la capacidad invasiva de las
orientativa que permite conocer el
células GES-1/ miR-23a, GES-1/ EV y GES-
número de células por ml de solución,
1. Esto mediante la tinción cristal violeta y
siendo necesaria para la caracterización
utilizando el microscopio invertido.
de líneas celulares, establecer
condiciones reproducibles de cultivo y la
consistencia de cultivos primarios. Este
conteo se realiza por medio de
hemocitómetro o conteo electrónico.
 5. Define GES-1, GES-1/miR-23a Y
GES-1/EV
GES-1: es una línea celular epitelial
gástrica humana que expresaba de forma
estable miR-23a.
GES-1/ miR- 23a: línea celular de epitelio
gástrico humano transfectado con la
expresión estable de miR-23a.
GES-1/EV: Línea celular de epitelio
gástrico humano con el vector vacío.
6. Explique y fundamente todas las
imágenes
Figura 1: Mediante el análisis de
microarreglos de oligonucleótidos se
establece una gráfica comparativa entre
cuatro pares de tejidos gástricos humanos
normales y tejidos de cáncer gástrico
humano, utilizando como fluoroforos la
cianina 3 y 5. Se observa que existe
diferencia significativa en la
sobreexpresión en los tejidos de cáncer
gástrico del gen miR -23a, ya que este gen
promueve el desarrollo del cáncer
gastrico e influye en la regulación genética
de las células de este cáncer.
Figura 2: Se observa la morfología de las
células aisladas GES-1/EV posterior a la
transfección con el pcDNA3 EV y las
células aisladas GES-1/miR -23ª, después
de la transfección con pcDNA3/miR-23a.
Figura 3:
3A: Electroforesis en gel, posterior a una
PCR, en donde se utilizó como marcador
interno U6, observando la presencia de
bandas (Amplificación) en las tres
muestras (GES-1, GES-1 /EV, GES-1/miR-
23a). Puesto a que se utilizaron cebadores
específicos de miR-23a solo se observó
amplificación en la muestra GES-1/miR-
23a.
3B: Niveles de expresión relativa con los
cebadores específicos de miR -23a en las
células, sobre expresando una diferencia
significativa en la célula GES-1 / miR -23a
frente a las otras células.
Figura 4: Mediante recuento de células y
MMT se determinó la expresión de miR -
23a, la cual afecta la proliferación de
células GES-1 y su viabilidad dentro de 7
días generando curvas de crecimiento. El
recuento celular comprobó que las células
GES-1 / miR- 23aa proliferaban
significativamente más rápido en
comparación con las otras células,
además mediante en ensayo de MMT
estas células demostraron una mayor
viabilidad entre las 48 y 72 horas.
Figura 5: Mediante el ensayo MMT se
evaluó el efecto de miR- 23a sobre la
viabilidad de las células GES-1 a las 24, 48
y 72 horas. Observando mayor viabilidad
en GES-1 / miR- 23a a las 48 y 72 horas
Figura 6: A través de un ensayo de
invasión transwell, se observa tanto en la
figura A y B como la expresión de miR- 23a
promueve la capacidad invasiva de las
células GES-1, demostrando como mejoro
significativamente la capacidad invasiva
de las células GES-1 / miR -23a en
comparación con los controles. Con esto
se confirmó que miR -23a puede
desempeñar un papel como oncogén en la
carcinogénesis gástrica.
Figura 7: El ensayo de formación de
colonias se utilizó para evaluar la
capacidad de formación de colonias de
GES-1. Después de dos semanas se
contaron los clones de células y los
resultados revelaron que la capacidad de
formar colonias de GES-1 / miR- 23a
mejoró significativamente en
comparación con los grupos control. Lo
que se observó tanto en la figura A con la
morfología de estas y en la figura B con el
análisis estadístico representado en
gráficos.