en Es

Análisis de flujo metabólico para la serina
proteasa alcalina de fermentación por

Bacillus licheniformis en un medio definido: Efectos
de la Velocidad de transferencia de oxígeno
Pinar ç Alik, Gu zide ç Alik, Serpil Takáč, Tuncer H. Ö zdamar
Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología Departamento de Biotecnología Industrial Research

Center, Universidad de Ankara, 06100 Tandogan, Ankara, Turquía; teléfono: +90 312 212 67 20, ext. 1354;
fax:
+ 90 312 223 23 95; e-mail: ozdamar@science.ankara.edu.tr Recibido el 19 de febrero
de 1998; aceptó 17 de noviembre de de 1998
Resumen: Los flujos metabólicos a través de las vías de Bon car- centrales en el palabras clave: serina proteasa alcalina; metabólica flujo análi- sis; Bacillus
bioproceso para burlan pro- serina alcalina (SAP) de Producción por Bacillus licheniformis; condiciones de transferencia de oxígeno; distribuciones de flujo
licheniformis fueron calculados por el modelo estequiométrico basado en flujo metabólico
metabólico basado en la red metabólica propuesto que contiene 102 metabolitos y
133 de reacción flujos utilizando los perfiles de tiempo de citrato, teléfonos seco,
ácidos orgánicos, aminoácidos, y SAP como las restricciones. El modelo se resolvió INTRODUCCIÓN
al minimizar la tasa de acumulación de SAP en la célula. Los efectos de la tasa de
transferencia de oxígeno (OTR) en los flujos metabólicos se investigaron en un El estado de un proceso biotecnológico depende de muchos parámetros y variables;
medio definido en el que se utiliza citrato como única fuente de carbono. Las vías pero sobre todo en el estado de la microorganismo que es, de hecho, la
centrales eran activos para el crecimiento y la síntesis SAP en todos los períodos del microbioreactor dentro del sistema de biorreactor. Debido a las reacciones
bioproceso a baja (LOT), medio (MOT), y condiciones (HOT) de transferencia de
metabólicas están íntimamente acoplados con condiciones biorreactor de operación,
oxígeno altas. La división de flujo en el ciclo TCA en una- Ke- toglutarate hacia el
análisis de flujo metabólico, además de la aplicación exitosa de la ingeniería
grupo de glutamato y en oxalacetato (OA) hacia aminoácidos grupo de ácido
metabólica, es útil en la descripción de las interacciones entre la célula y el
aspártico eran dependiente en la OTR. El flujo de la reacción anaplerótica que
conecta el ciclo TCA ya sea desde malato o OA a la vía de la gluconeogénesis a biorreactor con el fin de afinar el rendimiento biorreactor para aumentar el
través del principal punto de ramificación del piruvato (Pyr) también fue influenciado rendimiento y la selectividad mediante la predicción de los cambios en los flujos y la
por la OTR. Con la disminución de la OTR, los valores de flujo intracelulares tasa controlando el paso (s) en las vías metabólicas que conducen a la serina
después de glicerato 3-fosfato (PG3) en la vía de la gluconeogénesis y la tasa de proteasa alcalina (SAP, EC 3.4.21.14) síntesis. Por lo tanto, conocer la distribución
crecimiento específico disminuyeron. La tasa de ATP generación tal a- aumentó con
de los flujos metabólicos durante el crecimiento, el producto,
el aumento de la OTR. La vía hacia los aminoácidos de la familia del ácido aspártico
que es importante para la esporulación que precede la síntesis SAP eran todos
activos durante todo el bioproceso. Metabólicos resultados del análisis de flujo en
LOT, MOT, y condiciones de calor animan el diseño de una estrategia de
transferencia de oxígeno en el biorreactor; Por otra parte, aspara- gine sintetasa o
aspartato quinasa podría ser los sitios de ingeniería metabólica potenciales debido
al bajo valor del flujo desde el punto aspartato rama hacia paragine AS. © 1999 John
Wiley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng
La metodología del análisis basado estequiométricamente de reacciones

metabólicas para la identificación de puntos de ramificación críticos en la
distribución de flujo total se ha descrito en el artículo conocido por Stephanopoulos y
Vallino (1991), y los fundamentos de la análisis de flujo metabólico fueron revisados
por Nielsen y Villadsen (1994). análisis de flujo metabólico se ha aplicado con éxito
a una serie de procesos de fermentación (Jorgensen et al, 1995;. Papoutsakis y
Meyer, 1991; Stephanopoulos y Vallino, 1991; Vallino y Stephanopoulos, 1993;
Varma y Palsson, 1995). Aunque los informes de la literatura sobre el análisis de
64: 151-167, 1999.
flujo metabólico de dos aminoácidos, L-lisina (Lys) (Hollender 1994; Vallino y
Stephanopoulos, 1990, 1993, 1994a, 1994b) y L-glutamato (Glu) (Pons et al., 1996;
Takac et al., 1998)
Correspondencia a: tunc zdamar ER H. Ö
patrocinadores contrato de subvención: Ciencia y Técnica del Consejo de Investigación de Turquía; SPO
(Turquía)
números de contrato de subvención: TUBITAK: MISAG 61; 95K120290
© 1999 John Wiley & Sons, Inc. CCC 0006-3592 / 99 / 020151-17

y una penicilina V antibiótico (Jorgensen et al., 1995), no hay ningún trabajo publicado modelo se utiliza para llevar a cabo análisis de flujo metabólico mediante la
relacionada que implica proteasa, una enzima, o incluso la producción de proteínas. implementación de un enfoque de optimización basado en la suposición de mínima
Escherichia coli ( Holms, 1986; acumulación de tasa de SAP en B. licheniformis Du-
Varma y Palsson, 1993a, 1993b, 1995; Varma et al., ing lote cultivos en condiciones de baja, media y alta de oxígeno de transferencia, y
1993), Corynebacterium glutamicum ( Vallino y Stephanopoulos, 1990, 1993, el uso de los datos experimentales elaborados para explicar el comportamiento
1994a, 1994b), Corynebacterium metabólico de la célula a lo largo del bioproceso.
melassecola ( Pons et al., 1996), Brevibacterium flavum
(Takac et al., 1998), y Penicillium chrysogenum ( Jorgensen et al., 1995) fueron los
microorganismos estudiados para el análisis de flujo metabólico. Un ejemplo de la
METODOS EXPERIMENTALES
distribución de flujo metabólico sin un objetivo relacionado con un producto para
bacilos se informó por Goel et al. (1993). Los valores de flujo para cultivos continuos
de tipo salvaje Bacillus subtilis a diferentes tasas de crecimiento y las Microorganismo y mantenimiento Cultura
concentraciones de glucosa de alimentación se han discutido y en comparación con
las bacterias Bacillus licheniformis ( DSM 1969) se utilizó como la fuente microbiana
los resultados o
de la enzima SAP en este estudio. Los cultivos madre se mantuvieron en tubos
f 9 h de lote
inclinados de agar que contenían (kg / m 3): soytryptone, 15; peptona, 5; MnSO
culturas con diferentes concentraciones iniciales de glucosa. Goel et al. (1993)
4? 2H 2 O,
informaron de los valores de flujo para los metabolitos de la vía de la glicólisis, el
0,010; agar, 15; y sus valores de pH se ajustaron a 7,0 usando 4 METRO KOH (C
ácido tricarboxílico (TCA) ciclo, y la vía hexosa monofosfato (HMP) obtenido por
alik et al, 1998;. C alik, 1998).
lotes y de glucosa-limitan cultivos continuos de
SEGUNDO.
subtilis mediante la combinación de la información de la estequiometría de 30 Medios de comunicación y Biorreactores

reacciones biosintéticas con los datos experimentales sobre la glucosa y los
subproductos metabólicos, es decir, lactato (Lac), acetato (Ac), acetoína, formiato,La célula que crece en los cultivos inclinados recién preparados se inoculó en el
piruvato (Pyr), y concentraciones de citrato (Cit) , CO medio de precultivo para la preparación de inóculos que contenía (kg / m 3): soytryptone,
15; peptona, 5; MnSO 4? 2H 2 O, 0,010; N / A 2 HPO 4, 0,25; CaCl
2 la evolución y el consumo de oxígeno
-1 / célula
tarifa. Sin embargo, en lugar de los flujos reales (mmol / g 2, 0.100 en
37 ° C durante 12 h, y el pH de las mediumwas ajustado a 7,5 con 4 METRO KOH.

h -1), los flujos totales (mmol / L -1 de la cultura), que proporciona un medio de imagen
de la distribución de flujo en cultivos discontinuos fueron reportados. Goel et al. El medio para la investigación de los efectos de la transferencia de oxígeno en la
(1993) sugirieron que para la gama de tasas de crecimiento examinó, el flujo de distribución del producto para SAP fermentación fue diseñado como (kg / m
3): ácido cítrico, 9.0;
ciclo TCA aumenta casi en proporción a la tasa de crecimiento y fue reprimida
significativamente sólo a muy altas tasas de crecimiento de cultivo discontinuo. Y (NUEVA HAMPSHIRE 4) 2 HPO 4, 4,7; KH 2 correos 4, 2,0 a 37 ° C durante 40 h, y el pH
también interesantes, los valores de flujo FO inicial de las mediumwas ajustó a 7,6 con 10 METRO KOH
r 9 h de (C alik et al, 1998;. C alik, 1998).

3 biorreactores lotes (Chemap,
tiempo de cultivo obtenido con caudal muy bajo de aire (Q La escala de laboratorio de 3,5 dm
o/ V
4 0.078 vvm) y con alta velocidad de flujo de aire (Q CF 3000, Suiza) -que se agitaron con 2 fourblade Rushton turbinas-consistía en
o/ V 4 2.22
vvm) se informó a ser similar. un sistema de volumen 1,0-2,5 10 de trabajo
-3 metro -3, cada uno con temperatura, pH, espuma,
Las interacciones entre las reacciones metabólicas y el mecanismo de regulación
genética, producto, y las formaciones de subproducto en el bioproceso para la velocidad de agitación, y los controles de oxígeno disuelto.
producción SAP dependen de las condiciones de transferencia de oxígeno y permiten

la introducción de perturbaciones bien definidos. En nuestro reciente trabajo (C Alik et
análisis
al.,
1998), se informó de los efectos de la transferencia de oxígeno en SEGUNDO.Las concentraciones de microorganismos sobre la base de peso en seco se midió
licheniformis en un medio definido utilizando un único cítrico carbonsource ácido con un espectrofotómetro UV-VIS (Sorvall RC 28S, DuPont, Wilmington, DE),
con el que la producción de SAP máximo se alcanzó entre otras de carbono utilizando la curva de calibración obtenida a 600 nm.
fuentes-y determina las variaciones de SAP y de subproductos concentraciones, y
la actividad de SAP en relación con la transferencia de oxígeno. Los presentes Las concentraciones de aminoácidos se midieron con un sistema de análisis de
informes de trabajo por primera vez en el análisis de flujo metabólico para una aminoácidos (Waters HPLC, Milford, MA), utilizando el método Tag Pico
producción de proteasa y de la influencia de las condiciones de transferencia de (Bidlinmeyer, 1994). El método se basa en la cromatografía líquida de alta presión
oxígeno en las distribuciones de flujo metabólico intracelulares en B. licheniformisdebajo
fase inversa (HPLC), utilizando la técnica de precolumna derivación con un
condiciones lote biorreactor bien definidos para evaluar los efectos sobre el programa de gradiente desarrollado para aminoácidos.
metabolismo de los bacilos en el proceso de SAP-fermentación. Se desarrolla un
modelo basado en el flujo de masa detallada estequiométrico basado en la red concentraciones de ácido orgánicos se determinaron con un electroforesis
capilar de alto rendimiento a 254 nm (Waters HPCE, Quanta 4000E, Milford, MA).
metabólica propuesto comenzando con el único ácido cítrico carbonsource para la
Las muestras se analizaron en 20 kV y 15 ° C con una fuente de alimentación
síntesis de SAP en bacilos que simula el comportamiento de las rutas metabólicas.
los negativa por inyección a presión hidrostática, usando un electrolito que contiene 5
m METRO potasio ftalato de hidrógeno y 0.5m
METRO
152 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

OFM Anion Bt (Waters, Milford, MA) como el modificador de flujo a pH 4 5.6 [para una- Art º) 4 Connecticut) (1)
cetoglutarato ( una KG), Ac, malato (Mal), fumarato (Fum), succinato (Suc), Lac,
dónde UNA es la matriz estequiométrica de la red metabólica, r (t) es el vector
oxalacetato (OA), y gluconato (Gluc)] y a un pH de
de los flujos de reacción, y Connecticut) es el
4 7.0 [para Pyr, Cit, Lac,
vector acumulación de metabolitos. Los elementos de Connecticut) son
Gluc (C alik et al, 1998;. C alik 1998)].
dividido en dos sub-vectores,
concentraciones de proteasa neutra (NP) SAP y se midieron usando un
electroforesis capilar de alto rendimiento (Waters HPCE, Quanta 4000E, Milford, Connecticut) 4 do 1 ( t) + c 2 ( t) (2)
MA). Las enzimas se analizaron a 12 kV y 15 ° C con una potencia positiva de
dónde do 1 ( t) y do 2 ( t) corresponden a los vectores de acumulación de metabolito
alimentación (C alik et al, 1998;. C alik, 1998).
extracelular e intracelular, respectivamente. las tasas de acumulación de los
metabolitos extracelulares, es decir, aminoácidos, ácidos orgánicos, y la enzima
SAP se derivan de la pendiente tomada entre dos puntos de datos concentración
consecutivos. Como PSS aproximación se utiliza para metabolitos intracelulares, do
Análisis basado en el balance de masas Flux
2( t) 4 0. Por lo tanto, Connecticut) es la tasa neta de salida del vector de velocidad
de acumulación de metabolitos. En este trabajo, la red de reacción de Bacillus
El flujo de carbono a través de las rutas metabólicas primarias de
licheniformis representado por las sumas sistema metabólico hasta un total de 102
B. licheniformis fue estimada a partir de las ecuaciones massbalance metabólicas
metabolitos y 133 flujos de reacción; y la matriz se basa únicamente en la
basadas en una descripción detallada de la estequiometría de todas las
estequiometría. El uso de la programación matemática, la distribución de flujo
biorreacciones relevantes implicadas en el crecimiento y la formación de producto
óptimos se obtienen minimizando la función objetivo Z. La formulación matemática
que incluyen intermedios metabólicos del ciclo TCA y la derivación del glioxilato; la
de la función objetivo Z, es:
anaplerótico, la vía del fosfato de pentosa (PPP), y las reacciones de la vía de la
gluconeogénesis; la SAIC aspártico, glutámico, serina y aminoácidos aromáticos en
la familia, e histidina (His) rutas de biosíntesis; y la síntesis de biomasa incluyendo
ADN, los lípidos, la síntesis de células-componentes (Sonenshein, 1993; Stryer,
1995). El mapa de ruta metabólica de Z 4 S una yo r yo (3)
dónde Z es una combinación lineal de los flujos r yo, y una yo es el

coeficiente de la componente yo en la ecuación estequiométrica
B. licheniformis y las reacciones estequiométricas de la red se muestran en la de la reacción correspondiente. La función objetivo Z estaba
Figura 1 y en el apéndice, respectivamente. La vía general se simplificó al agrupar
se define como la diferencia entre la tasa de síntesis de SAP (R132) y la tasa de
algunas reacciones en otras más simples sin perder precisión de la representación.
secreción de SAP ( r SAVIA); y el metabólica
relación P / O se consideró como dos (Frankena et al., 1985). La combinación distribuciones de flujo se determinaron minimizando Z en el
exacta de aminoácidos de la enzima SAP producido por B. icheniformis se utilizómodelo. Las variables del modelo, que son los flujos de reacción de metabolitos
-1 / DW h -1; y el
(Jacobs, 1995), mientras que la formulación de la composición química de SAP. se expresaron en mmol / g
Los datos completos composición química de flujo hacia la biomasa representa la tasa de crecimiento específico, metro
en h -1 ( Alik C, 1998).
E. coli se utilizó en
el modelo (Neidhardt, 1987).
RESULTADOS
Los siguientes supuestos principales se incorporan también en el modelo: (1) se
supone que todas las células para tener un comportamiento idéntico en todo el
bioproceso; (2) la conversión de NADPH a NADH a través de la reacción de Lote cultivos en baja, media y condiciones de
transferencia de oxígeno de alta
transhidrogenación depende reversible y no la energía; (3) NADH, NADPH, y FADH
son energéticamente equivalente; (4) las reacciones de esporulación en B. En nuestro artículo anterior (C Alik et al., 1998), se investigaron los efectos de la
licheniformis que preceden la síntesis de la proteasa no se consideran; (5) aunque
transferencia de oxígeno en el proceso biotecnológico para la producción de SAP en el
sustrato de absorción y de excreción producto reacciones también pueden conducir
caudal de aire de Q o / V 4 1 vvm y tres
a cambios en la composición de células, que se considera que es constante durante -1, bajo pH inicial
velocidades de agitación de norte 4 150, 500, 750 min
todo el bioproceso. 4 7,6 y T 4 37 ° C Condiciones de mediante el uso de Cit como única fuente de
carbono, que se encontró previamente como la mejor para la producción de SAP entre
otras fuentes de carbono simples tales como glucosa y fructosa (alik C, 1998); y
-1 como
En el análisis basado en el equilibrio del flujo de masa, una aproximación nombrado 150 min
-1 como yo-
pseudo-estacionario (PSS) para los metabolitos intracelulares, y las tasas de transferencia (LOT) condición de bajo oxígeno; 500 min
-1 como
acumulación de los metabolitos extracelulares medidos a lo largo de las transferencia Dium-oxígeno (MOT) condición, y 750 min
fermentaciones en consideración de la característica bioquímica del sistema se transferencia de alta oxígeno (HOT) condición. Los perfiles de las
utilizaron para adquirir la distribución de flujo . Los programGAMS optimización 2,25
concentraciones de la célula, SAP, NP, una- amilasa, orgánico
(Sistema General de algebraica de modelado, GAMS Development Corp., ácidos, aminoácidos, oxígeno disuelto y de pH a lo largo de los cultivos por lotes
Washington, DC) se utilizó para resolver la ecuación de masa-fluxbalance: en LOT, MOT y condiciones de calor se dan en nuestro artículo anterior (C alik et
al., 1998); y las variaciones en la célula, SAP, y el oxígeno disuelto (OD) con-
ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 153

Figura 1. El mapa de ruta metabólica de Bacillus licheniformis.
estaban presentes en el caldo de fermentación. Sin embargo, a condición de

centraciones con las condiciones de tiempo de cultivo y de transferencia de oxígeno
se resumen en la Figura 2. Las concentraciones de los aminoácidos que no se MOT, además de Asn; aspartato (Asp), la treonina (Thr), e isoleucina (Ile) no
presentan en el artículo anterior, debido a sus bajos valores se muestran en las estaban presentes en el caldo de fermentación; mientras que en condiciones de
Figuras 3-5. Nuestros resultados revelaron que la tasa de consumo de sustrato calor, Asn, serina (Ser), y Ile no se detectaron en el caldo de fermentación.
aumentó con el aumento de la tasa de transferencia de oxígeno; y, LOT y
condiciones de calor favorecieron la concentración de células; sin embargo, la
actividad de SAP y la concentración fueron favorecidos en la condición MOT.
Además, Lac, Pyr, y Ac fueron los ácidos orgánicos que se excretan al caldo, y Ac
Los análisis de flujo metabólico
excreción aumentaron con el aumento en la tasa de transferencia de oxígeno. La
concentración total de aminoácidos excretada al caldo de fermentación fue máxima
Efectos de las condiciones de transferencia de oxígeno en las distribuciones de flujo
a condición LOT y mínima a la condición MOT. En condición LOT todos los de carbono intracelulares fueron investigados por el análisis de flujo metabólico en
aminoácidos, pero asparagina (Asn) LOT, MOT, y condiciones de calor. Las tasas de acumulación calculadas de los
metabolitos, es decir, los ácidos orgánicos, los aminoácidos, SAP, y la célula se
utilizaron en

oxígeno molecular durante la generación de ATP por la fosforilación oxidativa y se
regenera entonces en el ciclo de TCA, la tasa del ciclo TCA fue fuertemente
dependiente de las condiciones de transferencia de oxígeno cuando se utilizó Cit
(que entra directamente al metabolismo del carbono del ciclo TCA) como fuente de
carbono. La tasa global de absorción de Cit fue el más bajo en la condición LOT y
el más alto en la condición caliente, y relacionada con la condición-principalmente
la transferencia de oxígeno captación Cit y las tasas de generación de ATP
cambió-esto afectó todas las vías dentro de la célula.
Análisis de flujo metabólico por el LOTE Condición
En condición LOT, tanto la velocidad de célula específica de crecimiento (R131) y tasa de absorción de
Cit (- r cit) disminuido con el tiempo de cultivo

(C alik et al., 1998). Entre las limitaciones del modelo de la medida en
concentraciones de aminoácidos vitro oscilar con respecto al tiempo de cultivo
(Fig 3;.. C alik et al, 1998) debido a sus tasas de absorción y excreción. Además,
los ácidos orgánicos Lac y Ac fueron transportados a la célula en
t 1 4 9 h en
Período I, y se excretan al caldo en t 2 4 17 h
Figura 2. La variación de la biomasa, la proteasa alcalina de serina, y la concentración de oxígeno
en el Período II. En Período III ( t 3 4 26 h) y el Período IV ( t 44
disuelto con el tiempo de permanencia y la condición de transferencia de oxígeno. do do 4 9,0 kg / m -3, T 4 37
° C, Q o / V 4 1 vvm, V 4 2,0 × 10 -3 33 h), Lac y Ac se excreta al caldo, mientras que Pyr fue transportado a la célula.
metro 3. N: ( d, s +) 750 min -1; ( metro, norte, x) 500 min -1; ( j, h, * ) 150 min -1.
distribuciones de flujo metabólico de los cuatro períodos de condición LOT se
el modelo para encontrar las distribuciones de flujo intracelular por medio de la dan en la Tabla I. Como se ve en la Tabla I, el flujo a través de la síntesis de SAP
ecuación. (1). Teniendo en cuenta perfiles de biomasa y la concentración de SAP, (R132) disminuyó con el cul-
el bioproceso se puede dividir en cuatro períodos, como se representa en la Figura

2. Período I (0 <t <10 h) es la primera etapa de la fermentación donde las células
están en la fase de latencia; Período II (10 <t <20 h) es el comienzo de la fase
exponencial; Período III (20 <t <28 h) es la mitad de la fase exponencial donde la
síntesis SAP comienza a aumentar; y el Período IV (28 <t <37 h) es el final de la
fase exponencial, donde la síntesis SAP fue la más alta. En condiciones mucho y
MOT los datos de tiempos de cultivo de
t 1 4 9 horas, t 2 4 17
h, t 3 4 26 h, y t 4 4 33 h se utilizaron para obtener las distribuciones de flujo
metabólico intracelulares en períodos I, II, III, y IV, respectivamente. El extenso
análisis del caldo no reveló ningún piscinas de productos metabólicos que no
están incluidos en el modelo, excepto
una- amilasa que sólo se de-
tegido en Periodos I y II en condición caliente hasta t 4 25 h.
Las distribuciones de flujo metabólico intracelulares podrían, por lo tanto, pueden
calcular mediante el uso de la masa propuesto balancebased modelo
estequiométrico utilizando los tipos de medidas durante el bioproceso de lote, para
todos los períodos en condiciones mucho y MOT y por períodos III y IV en
condiciones calientes. En consecuencia, en la condición HOT el análisis de flujo
metabólico no se aplicó a los períodos I y II porque
una- la síntesis de la amilasa
no se incluyó en el modelo; y t 3 4 28 h y t 4 4 33
h se eligieron en Periodos III y IV, respectivamente, para el análisis.
La tasa de consumo Cit depende de la velocidad del ciclo TCA dependiendo

de la necesidad de ATP donde el oxígeno actúa como la fuerza impulsora. Debido
a NADH y FADH 2 son Figura 3. La variación de las concentraciones de aminoácidos con el tiempo de residencia en la condición
generada en el ciclo de TCA y transferir sus electrones a LOT.

ramificación en F6P través de las reacciones de interconversión. Además, la vía de
la gluconeogénesis ramificado en T3P y F6P para operar el PPP donde la
formación de E4P es importante para la síntesis de los aminoácidos aromáticos en
la familia.
La tasa de generación de ATP disminuyó con el tiempo de cultivo (Tabla IIa). A
lo largo del bioproceso 77-84% y 16-23% de ATP fue producido por las reacciones
de fosforilación oxidativa (R115, R116), y reacción de formación de Suc (R4),
respectivamente. El consumo de ATP para el mantenimiento se expresó en el
modelo mediante la conversión a ADP (R133). A lo largo del bioproceso, ATP se
utilizó como la energía de mantenimiento. En períodos III y IV, 36% y 6% de la
ATP total se producen, respectivamente.
De hecho, la síntesis de los aminoácidos que son necesarios para la síntesis de la

biomasa y los componentes básicos de SAP es importante. Para los aminoácidos
ácido-glutámico de la familia una KG, por
aspártico aminoácidos ácido-familia OA, para los aminoácidos alanina-familia Pyr,

para los aminoácidos serina-familia PG3, para los aminoácidos aromáticos de la
familia PEP y E4P, y para su síntesis R5P son los puntos de ramificación. En el
Período I glutamato (Glu), Lys, leucina (Leu), la fenilalanina (Phe), cisteína (Cys);
en el Período II Glu, prolina (Pro), la arginina (Arg), alanina (Ala), valina (Val), Phe,
Cys; en el Período III Ser, glicina (Gly), y en el Período IV Glu, Ala, Leu, Gly y Cys
se suministraron en parte a través del caldo de fermentación; por lo tanto, se
requiere menos Cit para la síntesis de estos aminoácidos.
Figura 4. La variación de las concentraciones de aminoácidos con el tiempo de residencia en la condición

MOT.
Entre las vías de aminoácidos el flujo dirigido al glutamato de una KG (R67) es
sin duda importante; como una KG es una
ción de tiempo; sin embargo, SAP selectividad ( r SAVIA/ -r cit) aumentado punto de ramificación en el ciclo de Krebs, la magnitud del flujo
hasta Período IV, y luego ligeramente disminuido.
En todos los períodos de la fermentación, el ciclo TCA se completó y la
derivación del glioxilato (R9, R10) fue inactivo (Tabla I). Por otro lado, los flujos en
el ciclo TCA (R1-R8) disminuyeron con el tiempo de cultivo (Periodos I-IV). El
análisis de los flujos de ciclo TCA muestra el funcionamiento exitoso y suave del
ciclo TCA para producir los intermedios clave para el crecimiento y productos
formaciones. La ausencia de los ácidos orgánicos de ciclo TCA, es decir, Suc,
una KG, Fum,

Mal, y OA en el caldo de fermentación verifica este resultado.
En el proceso, con Cit como fuente de carbono, la vía de la gluconeogénesis era
activo con el fin de producir PEP, PG3, T3P, F6P, y G6P para la síntesis de la
producción de aminoácidos y componentes de la biomasa. En la vía de la
gluconeogénesis, F6P parecía ser el punto de ramificación de las dos vías paralelas
para la síntesis R5P (R25, R27, R29) en el PPP. El R5P intermedio clave se
sintetizó para los nucleótidos y componentes de la biomasa, ya sea por ramificación
en F6P en la vía de la gluconeogénesis, o completando la vía de la
gluconeogénesis y la producción de NADPH (R22, R23). El PPP fue activo en todos
los períodos en condiciones LOT. Sin embargo, los valores de flujo hacia R5P
disminuyeron con el tiempo de cultivo debido a la disminución en la tasa de
crecimiento específico. Los resultados revelaron que, en el Período I, R5P se
produce principalmente a través de la vía completa gluconeogénesis. Sin embargo,
en Periodos II, III, y IV los flujos de G6P a ambos Glc (R21) y Gluc6P (R22) estaban
inactivos; por lo tanto, la formación R5P se logró alternativamente por
Figura 5. La variación de las concentraciones de aminoácidos con el tiempo de residencia en la condición

caliente.

Tabla I. distribuciones de flujo metabólico de fermentación de SAP B. licheniformis en LOT, MOT, y condiciones de calor
condición LOT flujos mmol g -1 DW condición MOT flujos mmol g -1 DW condición HOT flujos mmol g -1 DW
h -1 h -1 h -1
R[ período I período II Período III período IV período I período II Período III período IV Período III período IV
1 8.7780 5.3130 2.4790 0.8890 4.0450 4.1200 6.5160 4.2720 7.2260 6.5260
2 8.7880 5.3130 2.4790 0.8890 4.0450 0.0000 6.5160 4.2720 1.9100 6.5260
3 4.9750 3.7760 2.2950 0.9920 4.1230 4.8520 6.3580 4.5600 0.0000 6.4170
4 4.9750 3.7760 2.2950 0.9920 4.1230 4.8520 6.3580 4.5600 0.0000 6.4170
5 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
6 4.9750 3.7760 2.2950 0.9920 4.1230 8.9720 6.3580 4.5600 5.3160 6.4170
7 7.0130 4.7370 2.3970 1.0330 4.3820 13.9430 6.4040 4.6480 5.5420 6.4370
8 4.7040 1.8600 0.5760 0.3570 1.1490 5.0940 3.0090 4.6480 10.8580 6.4370
9 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 4.1200 0.0000 0.0000 5.3160 0.0000
10 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 4.1200 0.0000 0.0000 5.3160 0.0000
11 1.4480 0.2430 0.1290 0,0190 0.2950 0.0000 2.8360 1.4570 2.1760 0,0260
12 0.8600 0.6020 0.4410 0.0910 0.2690 4.3200 3.0050 1.8310 6.4890 5.4430
13 1.1600 1.7870 0.8190 0.3680 2.9330 8.4730 0.2590 0.2720 1.5770 0.4410
14 1.1240 1.5710 0.5590 0.2610 1.8740 8.4480 0,2480 0.2420 1.5560 0.4350
15 0.3030 0.3960 0.3630 0.1550 1.2280 8.3450 0.1620 0,1400 0.1430 0,0720
dieciséis 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
17 0,1390 0.1410 0.1220 0,0520 0.3880 3.3450 0,0770 0.0550 0.0660 0,0340
18 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
19 0,1100 0,0210 0,0160 0,0070 0,0180 0,0120 0.0690 0,0100 0,0530 0,0300
20 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
21 0.0890 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0570 0.0000 0,0460 0.0000
22 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0,0250
23 0.0890 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0570 0.0000 0,0460 0.0000
24 0.0890 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0570 0.0000 0,0460 0.0000
25 0.0890 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0570 0.0000 0,0460 0,0250
26 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
27 0,0180 0,1080 0.0970 0,0410 0.3610 3.3270 0,0020 0,0390 0,0080 0,0010
28 0.0000 0.0000 0,0160 0,0060 0.0840 0.0000 0,0020 0.0000 0,0010 0.0007
29 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 1.6570 0.0000 0,0120 0.0000 0.0000
30 0.0000 0.0000 0,0160 0,0060 0.0840 0.0000 0,0020 0.0000 0,0010 0.0007
31 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 1.6570 0.0000 0,0120 0.0000 0.0000
32 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
33 0,0180 0,1080 0.1130 0,0470 0.4450 1.6700 0,0040 0,0270 0,0090 0,0020
34 0.0000 0.0000 0,0140 0,0050 0.0820 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
35 0,0030 0,0030 0.0000 0.0000 0.0000 1.6590 0.0000 0,0140 0.0000 0.0000
36 0.0000 0,0720 0,0008 0,0020 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0,1200
37 0.1240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0,0430 0.0000
38 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 4.7650
39 3.2490 1.3180 0.2900 0.3320 1.2150 0,0520 0.0660 0.3050 3.3190 0.0000
40 2.3090 2.8780 1.8220 0.6760 3.2330 12.9690 3.3960 0.0000 0.0000 0.0000
41 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 2.7410 7.3230 5.9830
42 0.8200 1,1750 0.1960 0.1060 0.6460 0.0840 0.0860 0,1020 1.4130 0.3630
43 0.7640 1.1190 0.1220 0,0510 0.2850 0,0530 0.0550 0,0610 0.5000 0.1690
44 0.0000 0.0000 0,0770 0.0370 0.3140 0.0000 0.0000 0,0140 0.8920 0.1810
45 0.2390 0.0000 0,0510 0,0180 0,0560 0,0380 0,0360 0,0110 0,0280 0,0110
46 0,0530 0.0810 0,1560 0,0210 0.1650 0.0540 0,0350 0.1900 0,0340 0,0070
47 0,0500 0,0380 0,0700 0,0200 0.0420 0,0280 0,0270 0,0240 0.0000 0.0000
48 0,0030 0.0420 0.0860 0,0010 0.1230 0,0250 0,0080 0.1660 0.0420 0,0190
49 0.1030 0.1050 0.0790 0,0340 0.2740 4.9820 0,0560 0,0500 0,0520 0,0250
50 0,0110 0,0130 0,0090 0,0040 0.1970 4.9310 0,0060 0,0050 0,0190 0,0030
51 3.2560 1.6170 0.4460 0.3370 0.8540 5.0940 0.1730 0.4500 1.3590 0.4270
52 0,0280 0,0280 0,0210 0,0090 0,0230 0,0150 0,0150 0,0130 0,0100 0,0070
53 1.1090 0.5480 0.2620 0.2600 0.5050 0.0620 0.0680 0.3100 1.0940 0.3810
54 0,0030 0,3500 0.1130 0.1920 0.0370 0,0240 0,0240 0.2710 0.1830 0.1870
55 0,0030 0,3500 0.1130 0.1920 0.0370 0,0240 0,0240 0.2710 0.1830 0.1870
56 0,0030 0,3500 0.1130 0.1920 0.0370 0,0240 0,0240 0.2710 0.1830 0.1870
57 0.0000 0.3470 0,1100 0.1910 0,0340 0,0220 0,0220 0.2690 0.1810 0.1870
58 1.1060 0.1970 0.1490 0.0680 0.4680 0,0380 0,0440 0,0390 0.9110 0.1940
59 0.7630 0.1450 0.1320 0,0280 0.0540 0,0360 0,0350 0,0310 0,0230 0,0150
60 0.7110 0,0720 0.1090 0,0110 0,0280 0,0190 0,0180 0,0160 0,0120 0,0080
61 0.3430 0,0520 0,0170 0,0400 0.4150 0,0020 0,0100 0,0080 0.8880 0,1780

Tabla I. Continuado
h -1 h -1 h -1
62 0,0150 0.1050 0.1270 0,0530 0.5270 0,0110 0,0040 0,0130 0,0090 0,0020
63 0,0090 0.0000 0.1030 0,0320 0.5080 0.0000 0.0000 0,0030 0,0060 0,0006
64 0.0000 0.0990 0,0200 0,0180 0,0140 0,0070 0,0004 0,0080 0,0009 0.0000
sesenta y cinco 0,0060 0,0060 0,0050 0,0020 0,0050 0,0040 0,0030 0,0030 0,0020 0,0020
66 0,0060 0,0060 0,0050 0,0020 0,0050 0,0040 0,0030 0,0030 0,0020 0,0020
67 8.9880 0.0000 1.4570 0.6650 2.4620 5.4230 0.5590 1.2930 5.0050 1.1280
68 3.7200 6.6730 0.2410 0.1170 0.4110 5.0740 0.1450 0.1970 0.3330 0.0640
69 0.1220 0.0000 0,0190 0,0110 0,0210 0,0140 0,0140 0.0000 0,0130 0,0020
70 1.9960 0.9710 0,0700 0,0270 0,0360 0,0240 0,0230 0.0680 0.1960 0,0100
71 1.9890 0.9100 0,0650 0,0250 0,0290 0,0200 0,0190 0,0650 0.1930 0,0080
72 1.9890 0.9100 0,0650 0,0250 0,0290 0,0200 0,0190 0,0650 0,0120 0,0080
73 0.0000 0.1830 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
74 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
75 0.0000 0.1190 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0,0002 0.0000 0.0000
76 1.9230 0.9620 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.1550 0.0000
77 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0,0080 0,0120
78 0.0000 4.7150 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
79 0.1070 0,0400 0.0000 0.0000 0.0000 0,0020 0,0080 0.0000 0.0000 0.0860
80 0.2960 0,0500 0.0000 0.0000 0.0000 0,0009 0,0090 0.0000 0.0000 0.0000
81 0.0000 0,0010 0.0000 0.0000 0.1870 4.9240 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
82 0,0330 0,0330 0,0250 0,0110 0,0280 0,0180 0,0180 0,0160 0,0310 0,0080
83 0,0440 0,0460 0,0340 0,0150 0.2240 4.9490 0,0240 0,0210 0,0300 0,0110
84 0,0270 0,0270 0,0210 0,0090 0,0230 0,0150 0,0150 0,0130 0,0100 0,0070
85 0,0270 0,0270 0,0210 0,0090 0,0230 0,0150 0,0150 0,0130 0,0100 0,0070
86 0.0420 0,0430 0,0320 0,0140 0.2220 0,0230 0,0230 0,0200 0,0300 0,0100
87 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
88 0,0020 0,0020 0,0020 0,0008 0,0020 0,0010 0,0010 0,0008 0,0009 0,0006
89 0,0020 0,0020 0,0020 0,0008 0,0020 0,0010 0,0010 0,0008 0,0009 0,0006
90 0,0170 0,0180 0,0130 0,0060 0.2010 4.9340 0,0090 0,0080 0,0210 0,0040
91 2.2100 1.0190 0.2910 0,1600 1.2790 9.9670 0,1150 0.1710 2.0660 0.4100
92 0,0530 0,0530 0,0400 0,0180 0,0440 0,0300 0,0290 0,0250 0,0190 0,0130
93 0,0530 0,0530 0,0400 0,0180 0,0440 0,0300 0,0290 0,0250 0,0190 0,0130
94 0,0500 0,0500 0,0380 0,0170 0.0420 0,0280 0,0270 0,0240 0,0180 0,0120
95 0,0230 0,0230 0,0180 0,0080 0,0200 0,0130 0,0130 0,0110 0,0080 0,0060
96 0,0020 0,0020 0,0020 0,0008 0,0020 0,0010 0,0010 0,0008 0,0009 0,0006
97 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
98 0,0020 0,0020 0,0020 0,0008 0,0020 0,0010 0,0010 0,0008 0,0009 0,0006
99 0,0020 0,0020 0,0020 0,0008 0,0020 0,0010 0,0010 0,0008 0,0009 0,0006
100 0,0160 0,0160 0,0120 0,0050 0,0140 0,0090 0,0090 0,0080 0,0060 0,0040
101 0,0030 0,0030 0,0020 0,0010 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0010 0.0007
102 0,0030 0,0030 0,0020 0,0010 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0010 0.0007
103 0,0320 0,0320 0,0250 0,0110 0,0270 0,0180 0,0180 0,0160 0,0120 0,0080
104 0,0020 0,0020 0,0010 0.0007 0,0020 0,0100 0,0010 0,0009 0.0007 0,0005
105 0,0030 0,0030 0,0030 0,0010 0,0030 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0008
106 2.0420 0.9630 0.1050 0.0420 0.0740 0.0490 0.0480 0.0900 0.0580 0.0210
107 0.0020 0.0020 0.0020 0.0008 0.0020 0.0010 0.0010 0.0008 0.0009 0.0006
108 0.0000 0.0000 0.0000 0.0160 0.1960 0.0000 0.0000 0.0004 0.4310 0.0280
109 0.3430 0.0520 0.0170 0.0400 0.4150 0.0020 0.0100 0.0080 0.8880 0.1780
110 0.0770 0.0770 0.0590 0.0260 0.0650 0.0430 0.0420 0.0370 0.0420 0.0190
111 0.0770 0.0790 0.0590 0.0260 0.2520 4.9680 0.0420 0.0370 0.0420 0.0190
112 0.3420 0.9870 0.0440 0.0000 0.0000 0.0060 0.0020 0.0150 0.0000 0.0000
113 2.0120 0.0000 0.0000 0.2620 0.7200 0.0000 0.0000 0.0000 13.5270 0.0000
114 0.0000 1.7880 1.0680 0.0000 0.0000 7.0170 8.8890 2.2010 0.0000 2.8400
115 9.0200 7.9930 4.3510 1.1980 5.0340 22.9360 21.3030 13.4120 5.7180 21.3800
116 4.9750 3.7760 2.2950 0.9920 4.1230 8.9720 6.3580 4.5600 5.3160 6.4170
117 17.3120 12.0710 7.3180 2.8680 12.5100 22.1680 19.3460 14.2220 16.3930 24.6230
118 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
119 9.8010 6.5470 1.6340 0.7230 2.2530 10.4950 0.6820 1.4910 3.8600 0.9820
120 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
158 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 64, NO. 2, JULY 20, 1999
Tabla I. Continuado
h -1 h -1 h -1
121 0,0460 0,0020 0.0930 0,0770 0.7280 0,0009 0,0002 0,0220 1.7810 0.3590
122 2.2270 1.1070 0.3040 0.1660 1.2930 9.9770 0.1240 0.1790 2.0720 0.4140
123 0.2680 0.2680 0.2040 0.0890 0.2250 0,1500 0.1460 0.1290 0.0960 0.0640
124 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
125 0,0090 0,0090 0,0070 0,0030 0,0070 0,0050 0,0050 0,0040 0,0030 0,0020
126 0,0030 0,0030 0,0020 0,0010 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0010 0.0007
127 0,0030 0,0030 0,0020 0,0010 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0010 0.0007
128 0,0030 0,0030 0,0020 0,0010 0,0020 0,0020 0,0020 0,0010 0,0010 0.0007
129 0,0210 0,0210 0,0160 0,0070 0,0180 0,0120 0,0120 0,0100 0,0080 0,0050
130 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
131 0,1250 0,1250 0,0950 0.0420 0.1050 0,0700 0.0680 0.0600 0,0450 0,0300
132 0,0008 0,0006 0,0005 0,0001 0,0003 0,0006 0,0004 0,0005 0,0001 0,0003
133 0.0000 0.0000 4.8920 0.2650 0.0000 0.9320 50.7750 31.0290 0.0000 56.3260
desviado a la síntesis de glutamato influye en los flujos de ciclo TCA y, en a través de R45 fue máxima en el Período I, además, el flujo de R46 y, en
consecuencia, la generación de energía. Según el modelo, Glu se utiliza para la consecuencia, los flujos hacia Val (R47) y Leu (R48) eran máximo en el Período
biosíntesis de Ser (R42), Ala (R45), Val (R47), Leu (R48), Asp (R51), MDAP III. En el Período IV, el flujo hacia los aminoácidos alanina familia eran los más
bajos.
(R56), Ile (R60), Phe (R63 ), tirosina (Tyr) (R64), Glu (R68), Pro (R69), y la ornitina
(Orn) (R70), mientras que también es producido a partir de una KG (R67) a través El flujo hacia los aminoácidos aromáticos en la familia (R62) fue mayor en los
de las reacciones de catabolismo de Ala (R73), Pro (R75), Arg (R76), Val (R77), Periodos II y III que en períodos I y IV. En el Período I, Tyr fue producido por la
Glu (R78), Su (R81), y por las reacciones de la biosíntesis de Asn (R52), GMP reacción de catabolismo de Phe (R79) y Phe fue suministrada desde el caldo de
(R84), CAP (R106), UDPNAG (R125). Desde el ciclo de Krebs a través fermentación; por lo tanto, el flujo de PEP a Chor (R62) fue menor que los flujos
de los otros períodos.
una KG, 42%, 13% y 8% del flujo se desvió a Glu en Periodos I, II y III, Para los aminoácidos serina-familia, Ser es el segundo punto de ramificación
respectivamente; sin embargo, en el Período IV en el punto de ramificación en la vía después de la PG3 punto de ramificación principal como Gly (R43), Cys
una KG en el ciclo de TCA, el flujo R3 era (R44, y CPEtn (R127) se sintetizan a través de Ser. El flujo de PG3 dirigida a Ser .
11% más alto que R2 debido a la adicional una síntesis KG aumentado hasta Período III y luego disminuyó en períodos I y II, mientras que Gly
flujo fue alta, Cys flujo síntesis era inactiva, sin embargo, en períodos III y IV con el
a través de las reacciones de la biosíntesis de aminoácidos que son las reacciones
de formación de Ser (R41), Ala (R45), Val (R47), Leu (R48), Phe (R63), y Tyr aumento en el flujo formación Cys (R44) Gly flujo formación disminuida, que revela
(R64). la existencia de una regulación entre Cys y Gly reacciones de síntesis. Finalmente,
El ácido aspártico que se produce a través de OA es importante para los su flujo (R50) cambió con el cambio en las tasas de producción de crecimiento
celular y de SAP donde aumentó hasta Período III, y luego disminuyó.
aminoácidos ácido-familia aspártico y también para la Arg (R72), PRAIC (R82), PIB
(R90), y UMP síntesis (R92). Por lo tanto, con la disminución de la tasa de
crecimiento específico del flujo hacia Asp de OA (R51) disminuyó. Además, las
distribuciones de flujo hacia los aminoácidos de la familia de ácido aspártico
mostraron diferentes perfiles con el tiempo de cultivo. El flujo fue dirigida a Ile y
Met en el Período I; a Lys en el Período II; a Lys e Ile en el Período III; y para Lys y
Análisis de flujo metabólico para la condición MOT
Met en el Período IV (Tabla I); y, como el requisito de estos aminoácidos excede la
demanda de la célula, que fueron transportados al caldo de fermentación. DesdeAello largo de la fermentación por lotes a condición MOT, la tasa de crecimiento
punto de ácido aspártico hacia Asn rama, el valor de flujo (R52) era siempre másespecífico de célula (R131) disminuyó con el tiempo de cultivo; sin embargo, la tasa
bajo que los otros aminoácidos de la familia del ácido aspártico en todos los de absorción de Cit (- r cit) aumentado
períodos de la bioproceso; y la disminución después del período II. Sin embargo,hasta Período IV, y luego disminuyó ligeramente (C alik et al.,
los valores de Asn-de flujo fueron superiores a los de las condiciones de MOT y 1998). La medida de las concentraciones de aminoácidos vitro oscilar con respecto
caliente excepto Período IV de la condición MOT, y el flujo normalizado de al tiempo de cultivo (Fig 4;.. C alik et al, 1998) debido a sus tasas de absorción y
asparagina que es la selectividad Asn ( r Asn / -r cit) aumentado con el tiempo de excreción; Además, en Periodos I y III los ácidos orgánicos no eran ni excretada a,
cultivo. Fue máximo en el Período IV. ni transportado desde, el caldo; en el Período II Pyr fue transportado a la célula; y
en el Período IV Ac se excretó al caldo, mientras que Pyr fue transportado a la
célula.
distribuciones de flujo metabólico de los cuatro períodos de condición MOT se

El flujo total de Pyr hacia el ácidos alanina amino familia (R45, R46) fue dan en la Tabla I. Como se ve en la Tabla I, el flujo dirigido a SAP (R132)
máxima en la síntesis Período I. Ala aumentó y fue máxima en

Tabla II. la generación de ATP a lo largo de la fermentación.
ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW

h -1) ATP% h -1) ATP% h -1) ATP% h -1) ATP%
R[ período I período II Período III período IV
(A) condición LOT

4 4.975 16.96 3,776 16.04 2.295 21.40 0,992 22.71
87 0.000 0.00 0.000 0.00 0.000 0.00 0.000 0.00
98 0,002 0.01 0,002 0.01 0,002 0.02 0,001 0.02
115 18.400 62.73 15.986 67.91 8.702 81.16 2,396 54.57
116 4.975 16.96 3,776 16.04 2.295 21.40 0,992 22.71
Total 28.352 100.00 23.540 100.00 13.294 100.00 4.381 100.00
(B) la condición MOT

4 4.123 22.51 4,852 8.13 6,358 11.49 4.560 12.68
87 0.000 0.00 0.000 0.00 0.000 0.00 0.000 0.00
98 0,002 0.01 0,001 0.00 0,001 0.00 0,001 0.01
115 10.068 54.97 45.872 76.84 42.606 77.01 26.824 74.62
116 4.123 22.51 8,972 15.03 6,358 11.49 4.560 12.68
Total 18.316 100.00 59.697 100.00 55.323 100.00 35.945 100.00
(C) condiciones calientes
4 0.000 0.00 6,417 10.63

38 0.000 0.00 4.765 7.89
87 0.000 0.00 0.000 0.00
98 0,001 0.01 0,001 0.00
115 11.436 68.26 42.760 70.84
116 5.316 31.73 6,417 10.63
Total 16.753 100.00 53.943 100.00
Period II; after a slight decrease in Period III a further increase was observed in En el Período I del cultivo, Cys, en el Período II Met, Leu, Phe, Cys, en el
Period IV. Further, SAP selectivity was high in Periods II and IV. Período III Leu, Phe, Cys, y en el Período IV Pro, Ala, Phe fueron todos suministra
en parte a través del caldo de fermentación. En el ciclo de Krebs, aunque parte
In Periods I, III, and IV, the TCA cycle was complete and the glyoxylate shunt del flujo de una KG fue dirigida a Glu, no hubo una disminución en el ciclo de TCA
was inactive; however, in Period II, Cit (R11) and a KG (R2) formation reactions flujos como una KG fue suministrado por las reacciones amino acidformation.
were inactive in the TCA cycle; where the glyoxylate shunt was active. In Además, en Periodos I, II, y IV el exceso una KG que se produce a través de
addition, the fluxes in the TCA cycle increased until Period aminoácidos reacciones ácido-formación fue dirigida al ciclo TCA que provocó un
aumento de los flujos de ciclo TCA. En períodos I y II, Glu estaba produce
IV, and then decreased having the lowest value in Period principalmente a través de una KG (R67) a diferencia del perfil Glu obtenido en la
IV. condición LOT como la reacción de R67 fue más activo en el Período II, lo que
In all periods, the PPP was active; the total flux to R5P was the highest in Period
permite la formación de Gln-con la reacción consecutiva R68-que conduce a su
II, and then decreased. In Period I the fluxes in the PPP were high—related to thesíntesis (R50).
high Phe formation that produced through E4P (R64); and R5P formation was
achieved from F6P through the interconversion reactions. The PPP fluxes were the
highest in Period II due to Glu formation from His (R81). In Period III, R5P was
produced through the complete gluconeogenesis pathway; nevertheless, in Period Para la síntesis de Asp y otros aminoácidos ácido-grupo aspártico, el flujo de la
IV, R5P was produced by the interconversion reactions. reacción que ramificado en OA hacia Asp (R51) cambiado con un perfil diferente al
de condición LOT, pero un perfil casi similar con Glu de grupo ácido glutámico a
condición de MOT. Por otra parte, el flujo de Asp hacia los aminoácidos
ácido-familia aspártico fue alta en Periodos I y IV para proporcionar de carbono
La tasa de generación de ATP aumentó hasta Período II; era casi la misma enpara la síntesis de Met y Lys, respectivamente. A diferencia de los resultados de
el Período III, y el más bajo en el Período IV (Tabla IIb). A lo largo de la condición LOT, los valores de flujo normalizadas hacia Asn (R52) disminuyeron a
fermentación 77-91% y 8-23% de la ATP fue producido por las reacciones de medida que aumentó el tiempo de cultivo; sin embargo, los valores de flujo fueron
fosforilación oxidativa (R115, R116) y por el ciclo TCA (R4), respectivamente. más bajos que el de condición LOT, excepto en el Período IV, probablemente
Además, a partir de Período II, la célula utiliza ATP como la energía de debido al aumento en el flujo R51 producido por el cambio de vía a OA (R8) en el
mantenimiento. En períodos II, III, y IV 1,5, 90,1, y 86,3% de la ATP total punto de ramificación de Mal en el ciclo TCA.
producido se utilizaron como la energía de mantenimiento, respectivamente.

La vía de la gluconeogénesis flujos a partir de los puntos de ramificación de energía manteni-; También, en el Período IV aproximadamente 4 veces más ATP
Pyr, PEP, y PG3 en la vía de la gluconeogénesis los flujos respectivamente haciafue producido en comparación con Período III, y 93% de la ATP total producida
los ácidos de la familia alanina amino (R45, R46), los aminoácidos aromáticos se utilizó para el mantenimiento.
familiar (R62) y los aminoácidos serina-familia (R42), respectivamente, disminuyó En Período III, Phe, Tyr, y Val; en el Período IV Pro, Ala, Val, Phe y se
con el tiempo de cultivo; y todos ellos aumentaron ligeramente en el Período IV. suministraron en parte a través del caldo de fermentación. Un alto flujo del ciclo de
En el Período I, Cys del grupo de serina se suministró tanto desde el caldo de TCA a través de una KG fue desviado a Glu en el Período III; por lo tanto, se
fermentación y por R44 como Cys no era suficiente para la síntesis de Met (R61).observó una disminución de los flujos de ciclo del TCA. Sin embargo, en el Período
Similar a condición LOT, R44 era inactivo en el Período II, y Cys suministra desde
IV, aunque una parte de carbono fue dirigida a la formación de Glu, porque
el caldo se dirige al metabolismo del carbono.
una KG fue suministrado por las reacciones de formación de otros aminoácidos no
se determinó un descenso considerable en los flujos ciclo del TCA.
En el grupo de ácido aspártico, el flujo hacia Asp (R51) fue mayor en el Período
Análisis de flujo metabólico para la condición CALIENTE III que la de Período IV, relacionada con la alta tasa de síntesis de Met en el
Aunque la tasa de crecimiento celular específico (R131) fue menor que la de las Período III. El flujo hacia Asn (R52) fue el más bajo en condiciones de calor. Los
condiciones de MOT y Lot, tasa de absorción de citrato de (- r cit) fueron mayores flujos hacia la alanina amino familia ácidos (R45, R46) disminuyeron con el tiempo
que la de las condiciones de MOT y LOT (C alik et al., 1998). La medida de las de cultivo. El flujo hacia los aminoácidos aromáticos (R62) fue el más bajo en
concentraciones de aminoácidos vitro oscilar con respecto al tiempo de cultivo caliente; y en el Período IV, Tyr no se produce a partir de Chor (R64) como era en
(Fig 5;.. C alik et al, 1998) debido a sus tasas de absorción y excreción; Además,el Período III, pero por la reacción catabolismo a través de Phe (R79). Como se
indicó anteriormente, debido a que la célula prefiere utilizar la rama oxidativa de la
ninguno de los ácidos orgánicos en el Período III se excreta al caldo mientras Pyr,
Lac, y Ac fueron transportados a la célula. En el Período IV Lac y Ac se excretanPPP (R21-R25), en lugar de la vía de reacciones de interconversión, E4P no se
al caldo mientras Pyr fue transportado a la célula. Las implicaciones de los produjo considerablemente, y por lo tanto, los flujos de los aminoácidos aromáticos
resultados relacionados con los subproductos que sólo se sintetizan en la (R62-R66) fueron los más bajos en condiciones de calor. El flujo a amino
condición caliente son, de hecho, digno de mención. En los períodos I y II de la serina-familia ácidos (R42) disminuyó con el tiempo de cultivo. En Período III, el
condición CALIENTE, y NP flujo Cys (R44) fue alta relacionada con alta Met síntesis-Cys fue uno de los
reactivos en la reacción de síntesis de Met (R61).
una- amilasa eran
producido, y luego ( t 4 25 h) desapareció en el caldo
(C alik et al., 1998). Por tanto, sólo en el Período III de la condición CALIENTE, se
encontró que las concentraciones de aminoácidos medidos en el caldo a ser alto,
debido a los aminoácidos producidos por la hidrólisis de NP y
una- amilasa. Por lo tanto, la
DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
medio de fermentación actúa como un medio complejo definido y, en consecuencia, el
modelo es perturbado en el Período III de la condición caliente debido a la alta Debido a formaciones de productos y subproducto en el bioproceso para la producción de
velocidad de transferencia de oxígeno. SAP son dependientes de la velocidad de transferencia de oxígeno (C alik et al., 1998), las
distribuciones de flujo metabólico por períodos III y IV de la condición HOT seperturbaciones bien definidos se consiguen mediante las tres condiciones de transferencia
dan en la Tabla I. Como se ve en la Tabla I, el flujo para la síntesis SAP (R132) yde oxígeno diferentes, es decir, de baja , mediano y tasas de transferencia de oxígeno de
la selectividad SAP aumentado con el tiempo de cultivo. En Período III, tanto el alto, y una penetración en profundidad se proporcionó mediante la aplicación de análisis de
flujo de la síntesis de SAP y la selectividad SAP fueron inferiores a los de las flujo metabólico. En las bases de la red biorreacción propuesto que es válida para la
condiciones de MOT y mucho. Además, en el Período IV, aunque el flujo de producción de SAP en B. licheniformis
SAP-síntesis fue menor que la de la condición MOT, era mayor que la de
condición LOT; sin embargo, la selectividad SAP que es más alta que la de with the carbon source citric acid, the mass flux balance based stoichiometric model
Período III, fue menor que los valores obtenidos en condiciones mucho y MOT. that contains 102 metabolites and 133 reaction fluxes has been set up. Thereafter,
metabolic flux distributions were obtained from the solution of the model, based on
the minimum in vivo SAPaccumulation rate assumption in combination with the
elaborate experimental data that is a reasonable and first approach to the actual
En Período III, el ciclo TCA fue incompleta, en lugar de la derivación del metabolic flux distributions in
glioxilato era activa; sin embargo, en el Período IV sólo el ciclo de TCA fue
completa. En períodos III y IV, el PPP era activo y los resultados calculados indicó B.
que R5P se produce principalmente a través de la vía completa gluconeogénesis.licheniformis. En este contexto, se analizó el efecto de influir de oxígeno en las
En condiciones de calor, la célula prefiere principalmente para utilizar la rama vías metabólicas y los flujos metabólicos en los bacilos de SAP, por otra parte,
oxidativa (R21-R25) del PPP en lugar de la vía de reacciones de interconversión.para la producción de una enzima por primera vez. El cambio en la tasa de
transferencia de oxígeno influyó en los flujos de las vías centrales y, en
consecuencia, la formación de los intermedios clave, incluyendo los aminoácidos,
La tasa de generación de ATP aumentó con el tiempo de cultivo y fue máximay, finalmente, la producción de SAP en todo el bioproceso.
en el Período IV (Tabla IIc). En período
III, de acuerdo con el modelo de ATP no se utilizó como el man-

La única fuente de carbono en el medio definido era ácido cítrico que entra enG6P
el hacia la formación componentes de la biomasa y nucleótidos a través de la
mecanismo de carbono en el ciclo de TCA, la tasa de los cuales depende de la PPP. Con el aumento de la tasa de transferencia de oxígeno, los valores
necesidad de ATP, donde el oxígeno actúa como la fuerza impulsora. Los flujos del
intracelulares de flujo después de PG3 (R15) en la vía de la gluconeogénesis y la
ciclo TCA aumentaron con el aumento de la tasa de transferencia de oxígeno. tasa de crecimiento específico disminuyeron. Este hecho puede observarse
Cuando la célula necesita energía, es decir, en todos los períodos en condición claramente en el Período III de LOT, MOT, y condiciones de calor. Además, el
LOT, en Periodos I, III y IV en la condición MOT, y sólo en el Período IV en efecto negativo de la condición de transferencia de alta de oxígeno en la síntesis de
condiciones calientes, ICIT descarboxila oxidativamente a una KG, y la generación
aminoácidos aromáticos del grupo, que se producen a través de la reacción
de ATP a través del ciclo TCA se produce, después de lo cual la derivación del principal R62 usando PEP de la vía de la gluconeogénesis y E4P del PPP como los
glioxilato (R9, R10) está inactivo. Sin embargo, sólo en el Período II en la condición
reactivos, es importante.
MOT donde comienza la fase exponencial, y en condiciones calientes en el
Período III de la vía desde el punto de ramificación de ICIT dentro del ciclo TCA se La tasa total de ATP generación aumentó con el aumento de la tasa de
divide en Suc (R9) y a través de Glx- Mal (R10) por la derivación del glioxilato transferencia de oxígeno con un desplazamiento del máximo de Período I en LOT a
debido a la piscina ATP de la energía en exceso formado en la célula. Las Período II en MOT. En el Período IV como la tasa de transferencia de oxígeno
implicaciones de los valores de flujo calculados del ciclo de TCA en el Período IVaumentado, la tasa de generación de ATP aumentó y alcanzó un valor máximo en
en LOT, MOT, y condiciones de calor revelan que en periodo de síntesis SAP el condiciones calientes (Tabla IIa-c). El requisito de ATP para el transporte, la
ciclo TCA se completa debido al requisito de ATP para la síntesis SAP y el translocación, y el mantenimiento de los gradientes indicados en el modelo como la
mantenimiento de la célula. Sin embargo, los valores de flujo de CO hidrólisis de ATP (R133), aumentó con la disminución en la tasa de crecimiento y el
aumento de la tasa de transferencia de oxígeno. A menores tasas de crecimiento de
la célula no requiere grandes cantidades de energía para las actividades metabólicas;
Por lo tanto, se puede ampliar el exceso de energía para su mantenimiento. También,
2 evolución a velocidades de transferencia de oxígeno más altas, la célula puede perder fuente
(R117) y por lo tanto, el CO 2 los perfiles de LOT, ITV, y de carbono y producir exceso de energía. Vallino y Stephanopoulos (1993) y Takac et
condiciones de calor indican que como la tasa de transferencia de oxígeno se incrementa, el al. (1998) también informó de altos requerimientos de mantenimiento durante toda la
CO 2 flujo aumentó después Período I y ganó la fermentación durante la lisina y la sobreproducción de glutamato, respectivamente; y
valor máximo en condiciones calientes en el Período IV. Además, la partición afirmaron que la energía para el mantenimiento calcula como la hidrólisis de ATP no
de flujo en el ciclo TCA en una KG (R67) siempre reflejan la verdadera energía de mantenimiento, excepto durante los
hacia los aminoácidos glutamato del grupo y en la OA (R51) hacia los aminoácidos
períodos de crecimiento y síntesis de productos rápidos. Según el enfoque de Vallino
ácido-grupo aspártico dependen de la velocidad de transferencia de oxígeno y y Stephanopoulos (1993), los valores de ATP utilizados para el mantenimiento
creado perturbaciones metabólicas locales que infieren características de la (R133), en condiciones de mucho y MOT en el período i debería ser mayor que el
una KG y OA rama calculado; por otro lado en condiciones de mucho y MOT en períodos III y IV, y en
puntos. LOT, MOT, y condiciones de calor perturbado el metabolismo de B. licheniformiscondiciones
mediante calientes en el Período IV debería ser menor que el calculado. De todos
la alteración de las velocidades de las reacciones en los puntos de ramificación de modos, la magnitud de la ATP mantenimiento calculado en los primeros periodos de
una KG y OA. A medida que la condiciones mucho y MOT indica que el ácido cítrico de células de consumir no
Se observaron de oxígeno aumenta la tasa de transferencia, los máximos tanto delprodujo el exceso de ATP, que muestra la utilización eficiente de la fuente de
flujo de glutamato (R67) y el aspartato de flujo (R51) en el Período I en condición carbono. Sin embargo, en el Período IV de LOT, MOT, y condiciones de calor, ATP
LOT, desplazado a Período II en la condición MOT, y luego a Período III en utiliza para el mantenimiento aumentó con el aumento de la tasa de transferencia de
condiciones calientes. oxígeno; esto revela que la célula consume ácido cítrico hizo producir el exceso de
El flujo de la reacción anaplerótico o bien R40 o R41, que conecta el ciclo TCA,
ATP, que muestra la pérdida de la fuente de carbono.
respectivamente, ya sea de Mal o OA a la vía de la gluconeogénesis a través de
Pyr está influenciada por la velocidad de transferencia de oxígeno. En todos los
períodos en condición LOT y en períodos I, II, y III en la condición MOT, Pyr es
producida por el R40 reacción donde el flujo en MOT fue mayor en cada periodo
que el de condición LOT, cada una con un máximo en el Período II de ambas
condiciones de transferencia de oxígeno. Sin embargo, en el Período IV en MOT y
en períodos III y IV en condiciones de calor, la conexión del ciclo TCA a Pyr se
logró a través de OA a través de la reacción con R41 que valores superiores de A lo largo del bioproceso por lotes para la producción de SAP, las vías hacia el
flujo se obtuvieron compararon con R40. Como la velocidad de transferencia de amino ácidos ácido aspártico-familia (Asp, Asn, Lys, Met, Thr, y Ile) son todos
oxígeno aumentó, el flujo de R12 que conecta Pyr a AcCoA, y además la activos pero influenciado por las condiciones de transferencia de oxígeno aplicados
redirección del carbono con el ciclo de TCA por R11, aumentado y alcanzado loscomo se espera de acuerdo con la bioquímica de el modelo (R52, R53, R55, R58,
valores más altos en condiciones calientes. La vía de la gluconeogénesis es la R59, R60). La familia aspartato juega un papel fundamental no sólo en el
carretera que fluye a partir de la principal punto de ramificación Pyr por la partición
crecimiento y producción de SAP, sino también en la esporulación que precede a la
de flujo en PEP hacia los aminoácidos aromáticos-grupo, en el PG3 hacia los síntesis de la proteasa. Dos productos de la ruta aspartato son requeridos por la
aminoácidos serina-grupo, y luego en la T3P, F6P, y célula en esporulación de los bacilos. Estos dos son, dipicolinato que se produce a
partir de DC (R54), que constituye hasta el 10% del peso seco de la espora, y
MDAP que desempeña un doble papel como un interme-

diata en la biosíntesis de Lys y como un constituyente de la pared celular y los en el metabolismo de las células o debido a la necesidad de generación más ATP.
peptidoglicano de esporas corteza (Paulus, 1993). La secuencia de reacción de
Asp a MDAP (R53-R56) debe permanecer operativo durante la esporulación para Nuevos conocimientos se consiguieron interpretar la coordinación del
permitir la síntesis de estas sustancias. En el modelo, la transferencia del fosfatometabolismo y las interacciones entre la célula y el biorreactor, mediante el cálculo
del ATP a segundo- grupo carboxilo de Asp, que está catalizada por la enzima de las distribuciones de flujo metabólico que son las respuestas fisiológicas de los
aspartoquinasa, y la posterior reducción dependiente de NADPH del resto bacilos de baja, media y alta condiciones de transferencia de oxígeno. El análisis
acilo-fosfato de de la bioproceso dinámica a LOT, MOT, y condiciones de calor revelan que, de
acuerdo con el modelo de los flujos de las vías centrales y, en consecuencia, la
formación de los intermedios clave, incluyendo los aminoácidos y la síntesis SAP
segundo- aspartil fosfato por aspartato semialdehído deshidrogenasa para producir
semialdehído aspartato (AspSa) se agrupan y representó juntos por R53. La dependen del oxígeno molecular fluir en la célula. La concentración máxima SAP y
la actividad se obtuvieron experimentalmente a condición MOT; sin embargo, el
primera reacción catalizada por múltiples isoenzimas aspartoquinasa es el paso de
comprometerse en la utilización de Asp-que es el punto de ramificación para Asnanálisis de flujo metabólico muestra que el flujo de la síntesis de SAP (R132) fue la
(R52) y AspSa (R53) -para Lys, Met, Thr, y Ile, y es el principal objetivo de controlmás alta en Periodos I, II, y III de la condición LOT, y en el Período IV de la
de realimentación en la vía de aspartato. La función primaria de aspartoquinasa Icondición MOT.
que es controlado por MDAP es proporcionar precursores para la biosíntesis de
MDAP durante el crecimiento y la esporulación y para la síntesis de dipicolinato
durante la esporulación, cuando las otras isoenzimas aspartoquinasa no están
presentes en niveles significativos. La actividad y la síntesis de la isozima
aspartoquinasa II están regulados por Lys, y la actividad de la enzima disminuye
rápidamente al final de la fase estacionaria o durante la síntesis de SAP, lo que
sugiere que la aspartoquinasa II funciona principalmente para proporcionar
precursores para la síntesis de Lys como un bloque de construcción para SAP.
Aspartoquinasa III es una isozima aspartoquinasa sensible Thr-más-Lys, e inhibida
Las tasas de transferencia de oxígeno perturbado el metabolismo de
por Thr y Lys de una manera sinérgica que es una inhibición por retroalimentación
B. licheniformis, y las distribuciones de flujo de los aminoácidos que tienen valores
concertada (Paulus, 1993). Estas características de la vía de aspartato la distinguen
de bajo flujo son de hecho importante, ya que algunos de ellos podrían ser el paso
de otras vías de la biosíntesis de aminoácidos, en consecuencia, al menos una
limitante (s) en la síntesis de SAP. Para interpretar los resultados relacionados
parte de la vía debe funcionar incluso cuando todos los constituyentes de
podemos ya sea concluir que la regulación de las vías podría causar un mejor
aminoácidos de las proteínas son fácilmente disponibles a partir de otras fuentes.
acoplamiento de la oferta y la demanda de dichos aminoácidos, es decir, el grupo
Becuase esporulación se inicia en el período de transición que corresponde al
aromático y el grupo amino aspártico-ácido acids- excepto lisina-que para los
Período II y el modelo no tiene en cuenta que la esporulación es MDAP
demás o bien la síntesis de algunos de ellos crea un cuello de botella en la
dependiente, Se espera que los valores de flujo reales a partir de Asp (R53) a
producción de SAP como los aminoácidos regularlo. Como también existe el amino
MDAP (R56) a ser mayores que los valores calculados en el Período II; sin
ácido aromático familiar Phe en el caldo de fermentación y se puede convertir en los
embargo, los valores calculados en el Período IV en LOT, MOT, y HOT deben ser
otros aminoácidos familia aromáticos en la célula, y como el contenido total de
considerados como los verdaderos valores sobre la base de las suposiciones
aminoácidos aromáticos es sólo el 6% de los aminoácidos totales en la molécula
hechas en el análisis de flujo metabólico. SAP (Jacobs, 1995), la síntesis de un aminoácido aromático no puede ser un paso
limitante de la velocidad o un cuello de botella en la síntesis de SAP. En relación
con el grupo de ácido aspártico, los valores de flujo indican que las condiciones de
transferencia de oxígeno LOT, MOT, y HOT influyó en los flujos hacia Asp (R51), y
también para Lys, Ile, Thr, y Met; sin embargo, desde el punto de Asp el flujo hacia
rama Asn-que es 6,6% de SAP-tiene el valor de flujo bajo entre los aminoácidos
ácido-grupo aspártico, probablemente debido a ya sea la sintetasa bajo asparagina
(. EC 6.3.1.4) o alta aspartato quinasa (EC. 2.7.2.1) la actividad. Este conocimiento
La bioquímica de las reacciones del punto de ramificación de Pyr de nuevo al es útil en el diseño de un medio complejo detallada para aumentar el rendimiento de
ciclo TCA (R12) y de OA hacia ácidos grupo aspartato amino (R51) revela que la bioproceso para la producción de SAP. Por otra parte, asparagina sintetasa o
ambas vías requieren oxígeno, y los resultados del análisis de flujo metabólico aspartato quinasa podría ser el sitio potencial de la ingeniería metabólica. Sin
muestran que ambos están influenciados por la velocidad de transferencia de embargo, B. licheniformis, que contiene plásmidos
oxígeno como se mencionó anteriormente. De acuerdo con ello, con el aumento en
la tasa de transferencia de oxígeno, el flujo de la R12 reacción de Pyr al ciclo TCA
aumenta, aunque el flujo hacia la vía aspartato (R51) disminuyó. Además, debido
al desbordamiento entre Pyr y AcCoA en condiciones calientes en el Período IV,
Ac, la formación de que acompaña a la generación de ATP, fue producido a través
de AcCoA con un alto flujo (R38); y el aumento de flujo de acetato de muestra la
respuesta de las células para activar una nueva vía o bien a causa de un posible
cuello de botella

que lleva SubC gen que codifica la serina proteasa alcalina. Un artículo relacionado para Camino gluconeogénesis
comparar los resultados se encuentra en preparación por los autores. 12. Pyr → AcCoA + NADH + CO 2
13. Pyr + 2 ATP → PEP + 2 ADP
14. PEP → PG3
P. ç Alik fue galardonado con una beca de Ciencias de la OTAN (A2) y un Ph.D. Beca por 15. PG3 + ATP + NADH → T3P + ADP + Pi
TUBITAK (BAYG), y sus estudios fueron apoyados por el Consejo Británico en el 16. T3P + ADP + Pi → PG3 + ATP + NADH
Esquema Enlace Académico entre la Universidad de Ankara y UMIST, y por la 17. 2 T3P → F6P + Pi
Universidad de Ankara.
18. F6P + ATP → 2 T3P + ADP
19. F6P → G6P
20. G6P → F6P
NOMENCLATURA 21. G6P → Glc + Pi
UNA matriz estequiométrica de la red metabólica

Vía pentosa fosfato
Connecticut) metabolito vector acumulación 22. G6P → NADPH + Glu6P
do 1 ( t) vectores de acumulación de metabolitos extracelular 23. Glc → Gluc + NADP
do 2 ( t) vectores de acumulación de metabolitos intracelulares
24. Gluc + ATP → Gluc6P + ADP
-1)
norte velocidad de agitación (min
25. Gluc6P → R5P + NADPH + CO 2
Qo velocidad de alimentación de aire volumétrico (m 3 / min -1)
r (t) vector de los flujos de reacción

26. R5P → Xyl5P
-1 / DW h -1) 27. Xyl5P → R5P
r Asn Asn tasa de producción (mmol / g
DW h -1)
28. R5P → Rib5P
-1 /
- r cit velocidad de absorción de citrato (mmol / g
-1 / DW h -1)
r SAVIA SAP tasa de producción (mmol / g
29. Rib5P → R5P
t tiempo de cultivo del biorreactor (h)
3)
30. Xyl5P + Rib5P → S7P + T3P
V volumen de los medios de comunicación de biorreacción (m
Z función objetiva
31. S7P + T3P → Xyl5P + Rib5P
32. Xyl5P + e4p → F6P + T3P
letras griegas 33. F6P + T3P → Xyl5P + e4p
34. T3P + S7P → F6P + e4p
metro tasa de crecimiento celular específico (h
-1)
35. F6P + e4p → T3P + S7P
una yo coeficiente estequiométrico de los flujos
Ramas de la glucólisis
abreviaturas 36. Pyr + NADH → Laca
37. Lac → Pyr + NADH
Caliente de la porción de transferencia de alta 38. AcCoA + ADP + Pi → Ac + ATP
oxígeno transferencia de bajo oxígeno MOT 39. Ac + ATP → AcCoA + ADP + Pi
transferencia a medio de oxígeno NP
proteasa neutra OTR tasa de Las reacciones Anapleoric

transferencia de oxígeno PPP vía del fosfato de
40. Mal → Pyr + CO 2 + NADPH
pentosa PSS pseudo-estado estacionario R #
41. OA → Pyr + CO 2
ácido TCA tricarboxílico proteasa
alcalina número reacción SAP serina
Biosíntesis de Serina-Family Amino Acids
42. PG3 + Glu → Ser + una KG + NADH + Pi
43. Ser + THF → MetTHF + Gly
44. Ser + AcCoA + H 2 S → Cys + Ac
APÉNDICE
Biosíntesis de Alanina-familia del ácido Amino
45. Pyr + Glu → una KG + Ala
Las reacciones metabólicas para Bacillus licheniformis
46. 2 Pyr + NADPH → kval
47. Kval + Glu → una KG + Val
Ciclo TCA
48. Kval + AcCoA + Glu → NADH + CO 2 + una KG + Leu
1. Cit → ICIT
2. ICIT → una KG + NADPH + CO 2 La biosíntesis de histidina
3. una KG → SucCoA + NADH + CO 2 49. R5P + ATP → PRPP + AMP
4. SucCoA + Pi + ADP → Suc + ATP 50. PRPP + ATP + Gln → Su PRAIC + + una KG + 2 PPi
5. Suc + ATP → SucCoA + Pi + ADP + 2 NADH + Pi
6. Suc → Fum + FADH 2
7. Fum → Mal La biosíntesis de ácido aspártico-Family Amino Acids
8. Mal → OA + NADH 51. OA + Glu → Asp + una KG
9. ICIT → GLX + Suc 52. Asp + Gln + ATP → Asn Glu + AMP + PPi +
10. Glx + AcCoA → Mal 53. Asp + ATP + NADPH → AspSa + ADP + Pi
11. AcCoA + OA → cit 54. AspSa + Pyr → corriente continua

55. NADPH + DC → Tet 98. CTP + ADP → CDP + ATP
56. Tet + AcCoA + Glu → Ac + una KG + MDAP 99. UDP + MetTHF + 2 ATP + NADPH → dTTP + DHF
57. MDAP → Lys + CO 2 + 2 ADP + PPi
58. AspSa + NADPH → hSer
59. hSer + ATP → Thr + ADP + Pi Biosíntesis de ácidos grasos y fosfolípidos
60. Thr + Pyr + NADPH + Glu → Ile + una KG + NH3 100. T3P + NADPH → GL3P
+ CO 2 101. 7 AcCoA + 6 ATP + 12 NADPH → C14: 0 + 6 ADP
61. AcCoA + Cys + hSer + H 2 S + MTHF → Pyr + 2 Ac + 6 Pi
+ NH 3 + Met + THF 102. 7 AcCoA + 6 ATP + 11 NADPH → C14: 1 + 6 ADP

+ 6 Pi
Biosíntesis de Aromatic Familia Amino Acids 103. 8,2 AcCoA + 7,2 ATP + 14 NADPH → 7.2 PI + 7,2 ADP + PA
62. 2 PEP + E4P + ATP + NADPH → Chor + ADP
+ 4 Pi 104. UTP + G1P → UDPGlc + PPi
63. Chor + Glu → una KG + Phe + CO 2 105. PEP + NADPH + UGPNAG → UDPNAM + Pi
64. Chor + Glu → Tyr + una KG + NADH + CO 2 106. 2 ATP + CO 2 + gln → Cap + Glu + 2ADP + Pi
65. Chor + NH 3 + PRPP → Pyr + IGP + CO 2 + PPi
66. IGP + Ser → Trp + T3P Biosíntesis y la interconversión de unidades de un carbono
107. DH + NADPH → THF
La biosíntesis de ácido glutámico-Family Amino Acids
108. MetTHF + CO 2 + NUEVA HAMPSHIRE 3 + NADH → Gly + THF
67. una KG + NH3 + NADPH → Glu
109. MetTHF + NADPH → MTHF
68. Glu + ATP + NH3 → Gln + ADP + Pi
110. MetTHF → MeTHF + NADPH
69. Glu + ATP + 2NADPH → Pro + ADP + Pi
111. MeTHF → F10THF
70. 2 Glu + AcCoA + ATP + NADPH → Orn + Ac
112. Gly + THF → MetTHF + NH 3 + NADH + CO 2
+ ADP + Pi + una KG
71. Orn + CaP → Braza + Pi Las reacciones transhidrogenación
72. Citr + Asp + ATP → Arg + Fum + AMP + PPi 113. NADH → NADPH
114. NADPH → NADH
El catabolismo de los aminoácidos
73. una KG + Ala → Pyr + Glu
Sistema de transporte de electrones
74. MetTHF + Gly → Ser + THF
115. NADH + 2 ADP + Pi 2 → 2 ATP
75. Pro → Glu + NADPH
116. FADH2 + ADP + Pi → ATP
76. Arg + una KG → 2 Glu + NH 3 + NADPH + CO 2
77. Val + una KG → Kval + Glu Las reacciones de transporte
78. Gln + una KG + NADPH → 2Glu 117. CO 2 → exp

79. Phe → Tyr + NADPH 118. imp → CO 2
80. Cys → Pyr + NH 3 + H 2 S 119. imp → NUEVA HAMPSHIRE 3
81. Su + THF → Glu + MeTHF 120. NH 3 → exp

121. 2 ATP + 4NADPH → AMP + ADP + H 2 S + PPi + Pi
La biosíntesis de nucleótidos
122. PPi → 2 pi
82. PRPP + 2GLN + Asp + 2 H O + CO 2 + Gly + 4 ATP
2
123. imp → Pi
+ F10THF → 2 Glu + PPi + 4 ADP + Pi + 4 THF
124. Pi → exp
+ PRAIC + Fum
83. PRAIC + F10THF → IMP + THF Otros componentes de la biomasa
84. IMP + Gln + ATP → NADH + GMP + Glu + AMP 125. F6P + Gln + AcCoA + UTP → UDPNAG + Glu + PPi
+ PPi 126. R5P + PEP + CTP → CMPKDO + PPI + 2 Pi
85. GMP + ATP → PIB + ADP 127. Ser + CTP + ATP → CDPEtN + ADP + PPi + CO 2
86. ATP + PIB → ADP + GTP 128. S7P + ATP → ADPHep + PPi
87. GTP + ADP → ATP + PIB 129. G6P → G1P
88. NADPH + ATP → dATP 130. G1P → G6P
89. NADPH + GTP + ATP → ADP + dGTP
90. IMP + GTP + Asp → PIB + Pi + + AMP Fum Síntesis de biomasa
91. AMP + ATP → 2 ADP 131. 0,5352 Ala + 0,28 Arg + 0,22 Asn + 0,22 Asp + 0.09 Cys + 0,09 His + 0,25
92. PRPP + Asp + CaP → UMP + NADH + PPi + Pi Gln + Glu 0,25 + 0,58 + Gly
+ CO 2 0,27 Ile + 0,42 Leu + 0,32 Lys + 0,14 Met + 0,0593 Orn + 0,17 Phe + 0.2
93. UMP + ATP → UDP + ADP Pro + 0,377 Ser + 0.05 Trp +
94. UDP + ATP → ADP + UTP 0.13 Tyr + 0,24 Thr + 0.4 Val + 0,2 GTP + 0,13 UTP
95. UTP + NH3 + ATP → CTP + ADP + Pi + 0,12 CTP + 0,02 dATP + 0,02 dCTP + dGTP 0,02
96. ATP + NADPH + CDP → dCTP + ADP + 0,02 dTTP + 0,129 GL3P + 0,0235 C14: 0 + 0,0235 C14: 1 + 0,259 PA
97. CDP + ATP → CTP + ADP + 0,0433 UDPNAG + 0,0276

UDPNAM + 0,0235 + 0,0235 CMPKDO CDPEtN + GTP guanosina 5 8- trifosfato
H2 S Sulfuro de hidrógeno
0,0157 + 0,02354 UDPGlc ADPHep + 0,154 + G1P
Su L- histidina
41.139 ATP → Biomasa + 41.139 + 41.139 ADP Pi
hSer homoserina
ICIT isocitrato
Serina proteasa alcalina Síntesis IGP Indoleglycerolphosphate
132. (0.145 Ala + 0,0146 Arg + 0,0657 Asn + 0,0328 Asp ile L- isoleucina
+ 0,0255 0,0182 Gln + Glu Gly + 0,127 + 0,0182 Su DIABLILLO Inosinemonophosphate
+ 0,0365 Ile + 0,0584 Leu + 0,0328 Lys + 0,0182 Met una KG una- cetoglutarato
kval Ketovaline
+ 0,0146 0,0365 Phe + Pro + 0,116 + 0,0729 Ser Thr
Laca lactato
+ 0.0036Trp + 0,0474 + 0,113 Tyr Val) 274 + 5,5 Leu L- leucina
ATP → SAP ADP + 5,5 + 5,5 Pi Lys L- lisina
Mal malato
Mantenimiento MDAP meso-diaminopimelate
133. ATP → ADP + Pi Reunió L- metionina

MeTHF norte 5- norte 10- metenil-THF MetTHF norte 5- norte
10- metileno-THF MTHF
norte 5- metil-THF
Las abreviaturas utilizadas en las reacciones metabólicas
NADH Nicotinamida-adeninedinucleotide (reducido)
fosfato de NADPH Nicotinamida-adeninedinucleotide (reducido) NH 3
C.A Acetato
Amoníaco
AcCoA Acetil coenzima A
OA oxalacetato
ADP La adenosina 5 8- difosfato
Orn ornitina
ADPHep ADP RE- glicerol- RE- mannoheptose Ala
ENERGÍA fosfoenolpiruvato
L- alanina
PG3 Glicerato 3-fosfato
AMPERIO La adenosina 5 8- monofosfato
Phe L- fenilalanina
Arg L- arginina
Pi ortofosfato inorgánico
Asn L- asparagina
PPi pirofosfato inorgánico
Áspid L- aspartato
PRAIC 5 8- Fosforribosil-4-carboxamida-5-aminoimidazol
AspSa aspartato semialdehído
Pro L- prolina
ATP La adenosina 5 8- trifosfato
PRPP 5-Phospo- RE- ribosylpyrophosphate
C14: 0 Ácido mirístico
Pyr piruvato
C14: 1 ácido hidroximirístico
R5P Ribulosa 5-fosfato
Gorra Carbamoil-fosfato
Rib5P La ribosa 5-fosfato
CDP citidina 5 8- difosfato
S7P Sedoheptulosa-7-fosfato
CDPEtN CDP-etanolamina Cit
Ser L- serina
Citrato
Suc succinato
braza citrulina
SucCoA succinato coenzima A Xyl5P
Chor corismato
Xilulosa 5-fosfato
CMP citidina 5 8- monofosfato
Tet L, 2,3,4,5, tetrahidrodipicolinato
CMPKDO CMP-3-desoxi- RE- ácido manno-octulosonic
T3P Triosa 3-fosfato
CO 2 Dióxido de carbono
THF tetrahidrofolato
CTP citidina 5 8- trifosfato
Thr L- treonina
Cys L- cisteína
Trp L- triptófano
dATP 2 8- Desoxi-ATP
Tyr L- tirosina
dCTP 2 8- Desoxi-CTP
UDP uridina 5 8- difosfato
dGTP 2 8- Desoxi-GTP
UDPGlc UDP-glucosa UDPNAG UDP- NORTE- Acetil-glucosamina
dTTP 2 8- Desoxi-TTP
UDPNAM UDP NORTE- UMP ácido acetil-murámico
corriente continua L, 2,3 dihidrodipicolinato
DHF 7,8-Dihyrofolate
uridina 5 8- monofosfato
e4p Eritrosa 4-fosfato
UTP uridina 5 8- trifosfato
F10THF N 10- Formil-THF F6P
Val L- valina
La fructosa 6-fosfato
Pensilvania Ácidos grasos
FADH adeninedinucleotide Flavine (reducido)

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Análisis de flujo metabólico para la serina

proteasa alcalina de fermentación por

Pinar ç Alik, Gu zide ç Alik, Serpil Takáč, Tuncer H. Ö zdamar

Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología Departamento de Biotecnología Industrial Research

de 1998; aceptó 17 de noviembre de de 1998

La metodología del análisis basado estequiométricamente de reacciones

© 1999 John Wiley & Sons, Inc. CCC 0006-3592 / 99 / 020151-17

subtilis mediante la combinación de la información de la estequiometría de 30 Medios de comunicación y Biorreactores

37 ° C durante 12 h, y el pH de las mediumwas ajustado a 7,5 con 4 METRO KOH.

r 9 h de (C alik et al, 1998;. C alik, 1998).

producción SAP dependen de las condiciones de transferencia de oxígeno y permiten

152 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

dónde Z es una combinación lineal de los flujos r yo, y una yo es el

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 153

estaban presentes en el caldo de fermentación. Sin embargo, a condición de

154 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

Análisis de flujo metabólico por el LOTE Condición

Cit (- r cit) disminuido con el tiempo de cultivo

el bioproceso se puede dividir en cuatro períodos, como se representa en la Figura

La tasa de consumo Cit depende de la velocidad del ciclo TCA dependiendo

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 155

De hecho, la síntesis de los aminoácidos que son necesarios para la síntesis de la

aspártico aminoácidos ácido-familia OA, para los aminoácidos alanina-familia Pyr,

Figura 4. La variación de las concentraciones de aminoácidos con el tiempo de residencia en la condición

una KG, Fum,

Figura 5. La variación de las concentraciones de aminoácidos con el tiempo de residencia en la condición

156 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 157

distribuciones de flujo metabólico de los cuatro períodos de condición MOT se

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 159

ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW ATP (mmol / g -1 / DW

R[ período I período II Período III período IV

(A) condición LOT

(B) la condición MOT

(C) condiciones calientes

4 0.000 0.00 6,417 10.63

160 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 161

162 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 163

UNA matriz estequiométrica de la red metabólica

r (t) vector de los flujos de reacción

proteasa neutra OTR tasa de Las reacciones Anapleoric

164 Biotecnología y Bioingeniería, VOL. 64, NO. 2 20 de julio de 1999

+ CO 2 101. 7 AcCoA + 6 ATP + 12 NADPH → C14: 0 + 6 ADP

61. AcCoA + Cys + hSer + H 2 S + MTHF → Pyr + 2 Ac + 6 Pi

+ NH 3 + Met + THF 102. 7 AcCoA + 6 ATP + 11 NADPH → C14: 1 + 6 ADP

78. Gln + una KG + NADPH → 2Glu 117. CO 2 → exp

81. Su + THF → Glu + MeTHF 120. NH 3 → exp

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 165

133. ATP → ADP + Pi Reunió L- metionina

FADH adeninedinucleotide Flavine (reducido)

Glu L- Glutamato development for serine alkaline protease pro-

ÇALIK ET AL .: vía metabólica análisis para la proteasa FERMENTACIÓN 167

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