Este documento describe un experimento para detectar la actividad de la enzima deshidrogenasa succínica en extractos de hígado de pollo y determinar qué sustancias pueden inhibir su actividad. Se utilizaron malonato de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio como posibles inhibidores. Los resultados mostraron que la azida fue el inhibidor más efectivo experimentalmente, aunque teóricamente el cianuro es más efectivo. También se observó que la actividad enzimática disminuye a temperaturas más altas. El documento
Este documento describe un experimento para detectar la actividad de la enzima deshidrogenasa succínica en extractos de hígado de pollo y determinar qué sustancias pueden inhibir su actividad. Se utilizaron malonato de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio como posibles inhibidores. Los resultados mostraron que la azida fue el inhibidor más efectivo experimentalmente, aunque teóricamente el cianuro es más efectivo. También se observó que la actividad enzimática disminuye a temperaturas más altas. El documento
Este documento describe un experimento para detectar la actividad de la enzima deshidrogenasa succínica en extractos de hígado de pollo y determinar qué sustancias pueden inhibir su actividad. Se utilizaron malonato de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio como posibles inhibidores. Los resultados mostraron que la azida fue el inhibidor más efectivo experimentalmente, aunque teóricamente el cianuro es más efectivo. También se observó que la actividad enzimática disminuye a temperaturas más altas. El documento
Universidad Autónoma de Chiriquí, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Escuela de Química,
Bioquímica (código: Qm 382), Ciudad universitaria-El cabrero, David, Chiriquí, Panamá, ID: 4-782-20721, 4-742-9122, 4-748-11363; E-mail: sharyanc.18@gmail.com1, andy42_1987@hotmail.com2, m2marinmorales31@gmail.com3 Resumen Esta experiencia se realizó con la finalidad de detectar la actividad presentada por la enzima deshidrogenasa succínica y determinar la capacidad inhibidora que presentan los diferentes tipos de inhibidores, en este caso se utilizó malonato de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio. La enzima en estudio que fue la deshidrogenasa succínica, es una enzima que se encuentra asociado a la membrana interna de la mitocondria; en este laboratorio la fuente de mitocondrias fue el hígado de pollo. El sustrato en este caso es el succinato de sodio 0.2M. Se dispusieron de seis tubos de ensayo en los cuales se agregó la misma cantidad de homogenizado (enzima), amortiguador y azul de metileno variando entonces sustrato, agua destilada agregada y los inhibidores de azida, malonato y cianuro de sodio. En los tubos que contenían los inhibidores de malonato, azida y cianuro de sodio se obtuvo un tiempo de decoloración de >60 minutos, aproximadamente en una hora y >60 minutos respectivamente y para los tubos que no contenía sustrato, y que contenían el homogenizado a temperatura ambiente y a 52°C se obtuvo que en ninguno de los dos se observó decoloración. Con los resultados se infiere que el inhibidor que presentó mejor inhibición de la actividad enzimática experimentalmente fue la azida, sin embargo teóricamente se sabe que el cianuro es un inhibidor altamente efectivo. Por otro lado se observó el efecto que ejerce la temperatura sobre la actividad enzimática, debido que se observó una mayor disminución de la actividad al someter el homogenizado a una temperatura de 52°C comparado al homogenizado que se encontraba a temperatura ambiente. Podemos concluir que la activad enzimática puede verse afectada en una disminución de sus funciones enzimáticas, debido al efecto de pH, temperatura y también podrá verse afecta por la presencia de inhibidores.
Objetivos: hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a
Detectar la actividad enzimática de la otro, según la reacción general: deshidrogenasa succínica en extractos de hígado utilizando indicadores redox como aceptores artificiales de electrones. Establecer que sustancias pueden actuar como inhibidores de la deshidrogenasa succínica. Figura 1. Reacción general para de óxido reducción de la succinato deshidrogenasa. Marco teórico: Una oxidorreductasa es una enzima que De acuerdo con (Sierra, 2013) dice que las cataliza la transferencia de electrones desde células de la gran mayorías de los organismos una molécula donante (el agente reductor) a vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones otra aceptora (el agente oxidante). Según de óxido reducción mediante la cual la gran (González, 2010) nos dice que las enzimas cantidad de energía liberada a través de la oxidorreductasas catalizan reacciones de degradación de moléculas orgánicas es oxidorreducción, es decir, transferencia de almacenada en moléculas de alto nivel energético (ATP). La succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del grupo de Gradilla - 1 las oxidorreductasas, cataliza una reacción Licuadora - 1 muy importante en el metabolismo oxidativo de Baño termostático - 1 Plancha - 1 la célula: la conversión del succinato en Hígado - 50 g fumarato. Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial Cuadro 2. Reactivos. interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante Reactivo Cantidad Toxicidad susceptible como el azul de metileno que al Provoca ligera irritación cambiar su estado redox pasa de coloreado a Fosfato en los ojos, se 3 mL monobásico desconocen otros incoloro o viceversa. (González, 2010) explica efectos adversos. que la coloración de la oxidación y reducción del Este reactivo no azul de metileno al cambiar su estado redox. Succinato 2.5 mL produce ningún efecto de sodio perjudicial a la salud Acción de los inhibidores humana ni al ambiente. Los inhibidores son sustancias que impiden la Por contacto en los ojos actividad de las enzimas por combinarse con y piel puede provocar radicales indispensables para el funcionamiento Malonato irritación leve a grave. 500 µL enzimático o por ser agentes desnaturalizantes. de sodio No se conoce efectos por aspiración e El inhibidor posee una estructura similar a la del ingesta. sustrato y compite por situarse en el sitio del sustrato para formar un complejo enzima- Por ingesta irritación al inhibidor, disociable, dificultando la formación tracto digestivos y del complejo enzima-sustrato y por lo tanto la mucosas, por Azida de aspiración irritación actividad enzimática. La enzima no tiene acción sodio 500 µL aguda a vías sobre el inhibidor, ni el inhibidor competitivo respiratorias. Provoca desnaturaliza a la enzima; sólo impide su ligera irritación tras función. (Alvarado, 2013). contacto en ojos y piel.
Ejemplo de ello es la Deshidrogenasa succínica En la mayoría de los
en presencia de succinato y de un aceptor de casos, una intoxicación hidrógenos adecuado, convierte el succinato en por cianuro causa en la piel un cambio de color fumarato y reduce simultáneamente el aceptor de normal a rojo. Sin de H. embargo, si se trata de un daño físico o falta de Factores que afectan a la actividad enzimática oxígeno, el color de la Diferentes factores ambientales pueden afectar piel puede ser azulado. a la actividad enzimática. Como lo son el pH, la Por aspiración el temperatura y la presencia de inhibidores. producto es corrosivo Cianuro de 500 µL para las vías Materiales y reactivos sodio respiratorias. La sustancia inhibe la Cuadro 1. Materiales. respiración celular y Instrumento Capacidad Cantidad puede provocar 250 mL 4 cambios en la sangre, Vasos químicos sistema nervioso 100 mL 2 Micropipetas y central y en la tiroides. 1000 µL 2 Por ingesta es puntas Tubos de ensayo - 6 altamente tóxico e Balanza semi- irritante tras contacto en 3 kg 1 los ojos y piel. analítica Procedimiento La succinato deshidrogenasa es una enzima I. Se cortó una porción de 50 g de hígado fresco clasificada dentro del grupo de las en trozos pequeños y se homogenizó en una oxidorreductasas, cataliza una reacción muy licuadora con 100 mL de agua destilada. importante en el metabolismo oxidativo de la II. Se midió 40 mL del homogenizado y se diluyó célula: la conversión del succinato en fumarato. hasta 200mL de agua destilada. Se agitó la Esta enzima se localiza en eucariontes en la mezcla vigorosamente. membrana mitocondrial interna. El H2 cedido III. Se dispusieron de 6 tubos de ensayo en los por el succinato puede ser transferido del cuales se les añadió las siguientes cantidades de reactivos en mL, como se muestra a FADH2 a un colorante susceptible como el azul continuación: de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa. Tubo 1 2 3 4 5 6 Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Sustrato 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agua 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0 destilada Azul de 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 metileno Malonato de - - - 0.5 - - sodio Azida de sodio - - - - 0.5 - Figura 3. Reacción entre la succinato Cianuro de - - - - - 0.5 deshidrogenasa y el azul de metileno. sodio homogenizado 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 En los resultado del tubo 1 como podemos IV. El homogenizado se agregó de último. El observar no hubo reacción ya que no contenía homogenizado correspondiente al tubo 3 se sustrato además de que era nuestra sustancia calentó previamente a una temperatura de 52°C blanco por lo que no hubo inhibición. De esta por 15 minutos. forma no pudo realizar su conversión de V. Todos los tubos se agitaron y se les adicionó succinato a fumarato. En el tubo 2 podemos 5 gotas de aceite mineral a cada uno (para observar una decoloración el cual nos indica evitar interferencia ocasiona por el oxígeno del que hubo inhibición la cual se dio al cabo de aire). aproximadamente una hora, los que nos señala VI. Se pusieron posteriormente los tubos en un que succinato deshidrogenada pudo realizar la baño de agua a temperatura de 36°C, se conversión de succinato a fumarato. Según observaron los cambios en los diferentes tubos (Walla, 2000), esto se logra removiendo 2H+ y y se registró el tiempo en que se decoloraban. 2 electrones del succinato para formar fumarato Resultados y discusión y la coenzima reducida (FADH2), en este caso la enzima deshidrogenada succínica reduce al azul de metileno, ya que este actúa como aceptor y el azul de metileno reducido es incoloro. En el tubo 3 no podemos observar una decoloración por lo tanto nos asegura que no hubo inhibición, debido a que la reacción no procedió por el hecho de calentar previamente Figura 2. Decoloración de la enzima a temperatura de 520C lo cual un aumento de la deshidrogenasa succínica, por efecto de temperatura provoca la desnaturalización de la temperatura e inhibidores. enzima deshidrogenasa la cual trabaja Y por último en el tubo 6 se observó que no óptimamente a 37 °C. Se utiliza azul de metileno hubo una decoloración por lo tanto no hubo porque es un indicador redox apropiado para actividad inhibidora en el tiempo estipulado. Sin estas funcione. Se trata de una sustancia de embargo el cianuro es un inhibidor más efectivo color azul en su forma oxidada, que al aparecer según (Stryer, 2003). Se puede deducir que no átomos de hidrógenos del sustrato originan la hubo una actividad inhibidora debido a que no forma leuco, la cual es incolora (Marks, 2006). se le dejo reaccionar por más tiempo. La función del cianuro como inhibidor es actuar sobre el En el tubo 4 no se aprecia una decoloración Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su prominente, sin embargo si hubo inhibición interacción con el oxígeno. debido a que se observa una decoloración tenue. El malonato es un inhibidor de Conclusiones: la respiración celular, porque se une al sitio Por medio de la reacción de oxidación activo de la succinato deshidrogenasa en producida entre la deshidrogenasa y el azul el ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona, de metileno, que es un indicador redox compitiendo con el succinato. En la reacción apropiado para homogenizados de tejidos, de fosforilación oxidativa, el malonato es un se pudo evidenciar la actividad enzimática inhibidor del complejo II que, nuevamente, que presenta la deshidrogenasa succínica frente al efecto de la temperatura y a la contiene succinato deshidrogenasa. El presencia de sustancias inhibidoras como el malonato es un inhibidor competitivo de la malonato, azida y cianuro de sodio. deshidrogenasa succínica, de tal manera que la Podemos concluir que la actividad presencia de malonato detiene el ciclo de enzimática es de gran importancia debido a Krebs. La reacción que cataliza la enzima es la que estudia la velocidad de las reacciones de deshidrogenar al succinato para producir catalizadas por enzimas. Por lo que nos fumarato y FADH2. Detener el ciclo de Krebs proporcionan información directa acerca del implica parar la cadena respiratoria y por lo mecanismo de la reacción catalítica y de la tanto la maquinaria de producción de ATP. especificidad del enzima. Inferimos que la velocidad de reacción Cuando ocurre la inhibición de una enzima que observada en la reacción de oxidación del se encuentra dentro de una determinada vía azul de metileno y la deshidrogenasa metabólica, el sustrato de la enzima tiende a succínica es la velocidad máxima de acumularse, ya que no puede ser transformado reacción, es decir, la velocidad en que se da en un producto, (Gonzales, 2010). la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos. En el tubo 5 se observa una decoloración en un A través de los mecanismo de la acción trascurso de tiempo parecido al tubo 2 lo cual enzimática se puede aceleran la obtención nos indica que hubo reacción o inhibición. del equilibrio en un tiempo menor como Las azidas afectan a la cadena respiratoria. también la reacción ocurre de acuerdo al Son substancias que se enlazan a alguno de los número de moléculas con suficiente energía componentes de la cadena de transporte de cinética y adecuada orientación para electrones bloqueando su capacidad para sobrepasar la energía de activación de la cambiar de una forma reversible desde la forma reacción. oxidada a la forma reducida y viceversa. Esta inhibición resulta en una acumulación de los Bibliografía: componentes en sus formas reducidas antes -Alvarado, S. (2013). Bioquímica II. Recuperado del punto de inhibición, y la presencia de las el 7 de noviembre de 2017 de formas oxidadas de los componentes de la http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/ Cadena de Transporte de Electrones después media/users/10/523320/files/51871/Ma. del punto de inhibición. -González, J. (2010). Clasificación de las enzimas. Recuperado el 7 de noviembre de 2017 de: http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz 13.htm#c1 -González, M. (2010). Química. Indicador redox. Recuperado el 07 de noviembre de 2017 de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos- basicos/indicador-redox. -Marks, R., Collen S. & Lieberman, M. (2006). BIOQUIMICA BASICA. Un enfoque clínico. España: Mcgraw-hills. Interamericana. -Sierra, K. (2013). Actividad enzimática. Recuperado el 7 de noviembre de 2017 de http://www.medicina.uat.edu.mx/bioquimica/en zimas/Enzimas_y_coenzimas2.html -Stryer, L. (2003). Bioquímica. México: Ed. Reverté. -Walla, M. Marchuk, D. (2000). 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