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UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

"AÑO DEL BUEN SERVICIO AL CIUDADANO"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD: CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL: MEDICINA HUMANA

LABORATORIO 3:
“MÉTODOS DE FIJACIÓN Y COLORACIÓN DE
MUESTRAS”
 ALUMNA:
ERLINDA NOEMÍ PAZ VILLANUEVA

 CURSO:
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR Y TISULAR I
 DOCENTE:
Dra. VIOLETA MORÍN GARRIDO
Dr. CARLOS HOLGUÍN MAURICCI

 CICLO:
II CICLO

 FECHA DE ENTREGA:
MARTES 19 DE OCTUBRE
PIURA – 2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de


ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste entre
la célula y el medio que la rodea es la utilización de colorantes.
Estos pueden emplearse también para localizar estructuras específicas en la célula
o para distinguir entre tipos diferentes de células.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de


teñirlas, proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calor es lo más
corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehído, ácidos y alcoholes.
Después de la fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas
sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce generalmente el
encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las células
aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las
células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas
cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
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OBJETIVOS
 Presentación para conocimiento de métodos de fijación y
coloración.

 Preparación de muestras utilizando el microscopio para su


observación.

 Preparación de frontis sanguíneo y extensión.


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MARCO TEÓRICO
MÉTODOS DE FIJACIÓN Y COLORACIÓN DE MUESTRAS

FIJACION
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es Detener la vida de las células e
impedir las modificaciones postmorten que pueda sufrir la célula (procesos
autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que
ocurran cambios notables en ellos.
Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas
proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta
acción garantiza la integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante
agentes químicos denominados fijadores.
Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:

a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido


crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.

b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol


metílico.
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TINCIÓN O COLORACIÓN
Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para
mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.
Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y
medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados
con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.

Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y


examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido
conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo, clasificando diferentes células
sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.
 Coloración directa o sustantiva

Se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos se
ponen en contacto con la solución colorante, el resultado indica una verdadera
afinidad entre el tejido y el colorante. Ejemplo: la tinción de los núcleos por el azul
de metileno.
 Coloración indirecta o adjetiva

Para que lleve a efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo de


sustancias intermediarias que faciliten la adhesión del colorante en las estructuras
tisulares. La sustancia intermediaria que se utiliza se denomina “mordiente”. El
mordiente se aplica antes de la utilización de la solución colorante o puede formar
parte de ella. La combinación que se efectúa entre el mordiente y el colorante se
denomina “laca”.
 Coloración progresiva
Se refiere a la marcha misma de la coloración. Los tejidos se ponen en contacto con
la solución colorante para que, conforme transcurre el tiempo de coloración, el
tejido, de manera progresiva, alcance la intensidad de tinción deseada; en ese
momento se detiene la coloración mediante lavado y la eliminación del colorante
sobrante.
 Coloración regresiva

En este caso los tejidos se sobrecolorean con el colorante para someterlos después
a la acción de una sustancia denominada diferenciador, éste extrae parte del
colorante y, mediante la observación al microscopio, se detiene el proceso de
diferenciación cuando los componentes alcanzan la tinción deseada.
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 Coloración simple

Es el procedimiento en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún


componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina.
 Coloración compuesta o combinada

Consiste en la aplicación, a una muestra de tejido u órgano, de varios colorantes


con la finalidad de destacar, mediante colores diferentes, estructuras específicas
que forman parte de ella.
Puede ser:

Simultánea, cuando en una misma solución de coloración se mezclan varios


colorantes

Sucesiva, consiste en aplicar a los tejidos soluciones sucesivas de varios


colorantes, con la finalidad que ciertos componentes se tiñan con algunos de ellos.
 La tinción de Gram o coloración de Gram
Es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de
bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés
Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto
para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias
grampositivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a
las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
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COLORANTES
El termino colorante se da a las sustancias que se prefiere sean de origen orgánico
o de procedencia de especies vegetales o animales como la hematoxilina
procedente del “árbol mejicano”; el carmín, que se extrae de la hembra de la
cochinilla y la orceína y el tornasol que se extraen de “líquenes”; pero los hay
también de origen sintético y pueden proceder de la anilina, el alquitrán de hulla y
son derivados del benceno.

Por otro lado, de acuerdo a la necesidad o tipo de tejido se puede seleccionar el


colorante por el tipo de afinidad o pH y así se consideran 3 grupos: ácidos, básicos
y neutros.

COLORANTES COLORANTES COLORANTES


ÁCIDOS BÁSICOS NEUTROS
• Ácido pícrico • Tionina • Giemsa
• Nigrosina • Azul de • Wright
metileno • Leishman
• Verde de
• Cristal de • Lugol
malaquita violeta
• Verde de • Violeta de
Jano metileno
• Fucsina ácida • Hematoxilina
• Floxina • Safranina O
• Rojo neutro
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PRÁCTICA DE LABORATORIO
 MATERIALES

 Microscopio  Alcohol
 Glóbulos rojos  Laminas portaobjetos
 Lápiz de cera  Agua destilada
 Plumón o marcador de vidrio  Lanceta estéril
 Pinzas  Hisopos estériles
 Papel filtro absorbente  Goteros
 Algodón  Palitos mondadientes
 Laminas portaobjetos  Colorante Wright
 Frasco de enjuague  Set de coloración Gram.

Colorantes
 Azul de metileno 1%
 Eosina 1 %
 Lugol 1%

Tinción de Wright Tinción Gram


 Eosina azul  Cristal de violeta
 Alcohol metílico  Lugol
 Glicerina bidestilada  Alcohol-cetona
 Fucsina o Safranina
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 PROCEDIMIENTO
I.PREPARACIÓN DE FRONTIS SANGUÍNEO
1. Utilizar portaobjetos limpios, libres de grasa.
2. Marcar por el reverso de la lámina el número o código de la muestra, o
del grupo de trabajo.
3. Con las manos limpias o recién lavadas, limpiar con alcohol el extremo
del dedo y con ayuda de la lanceta estéril, pinchar y extraer una gota de
sangre y colocarla en el extremo del portaobjeto.
4. Con un segundo portaobjetos sostenido entre los dos dedos del pulgar e
índice, forme un ángulo de 30° con el primer portaobjetos.
5. Desplazar el segundo portaobjetos sobre el primero de derecha a
izquierda para que la sangre quede esparcida a lo largo detrás del
portaobjetos, luego levante y quite el portaobjetos.
6. Observar que al secarse quedará una capa muy delgada de sangre.
7. Introducir la lámina bien seca dentro de un frasco de enjuague para verter
sobre ella el colorante de Wright que se mantiene sobre la lámina por 2
min.
8. Agregar agua destilada suficiente para quitar la mayor parte del colorante
y dejar secar por tres minutos.
9. Eliminar el resto de colorante, introduciendo la l{amina en el frasco que
contiene agua destilada, sujetándolo cuidadosamente por los bordes por
espacio de 3 min.
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10. Extraer la lámina y escurrir el exceso de agua, puede airearse para secar
o ayudarse de papel absorbente, teniendo cuidado de no tocar la
superficie coloreada.

11. Cuando la lámina está completamente seca, colocarla en el microscopio


y observar a pequeño y Gram aumento y con aceite de inmersión, los
glóbulos rojos se observan rosáceos y los bancos son menos numerosos,
de mayor tamaño y el núcleo es característico, según el tipo de glóbulo
blanco y se colorea de azul.

OBSERVACIONES

En la muestra observada se pudo diferenciar los


glóbulos rojos y blancos, ya que el primero se notaba
un vacío en el centro, lo que demuestra que es
anucleado, por el contrario, los blancos se nota una
coloración azulada en el centro lo que es su núcleo.
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Actividad
Realizar el reconocimiento de los diferentes tipos de glóbulos
blancos y hacer un dibujo de cada uno de ellos.
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II. CÉLULAS PROCARIOTAS CON TINCIÓN GRAM.


1. Esterilizar un portaobjetos de vidrio para microscopio.
2. Coloca la muestra en el portaobjetos.
3. Fija la muestra.
4. Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción.
5. Colocar secuencialmente los colorantes, primero, CRISTAL DE VIOLETA,
tomando 1 minuto para cada uno de ellos, verter el excedente de colorante y
enjuagar a chorro continuo con agua.
6. Verter el LUGOL (mordiente-fijador) por 1 minuto, descartar y aplicar
ALCOHOL-CETONA (decolorante) con un movimiento de balanceo por 30
segundos debe ser rápido pues un mayor tiempo, decolora la lámina.
Descartar y agregar o verter la FUCSINA o SAFRANINA por 1 minuto
descartar y lavar a chorro continuo.
7. Secar agitando al aire la lámina o con un secador.
8. Luego colocar al microscopio y enfocar a inmersión, colocando una gota de
aceite de cedro.

OBSERVACIONES

 Las bacterias Gram positivas se observan violetas debido al cristal violeta


atrapado en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas
se ven rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de las delgadas
paredes celulares y luego ingresó a ellas el colorante secundario rosado.
 En la muestra que utilizamos, pudimos observar BACILOS, los cuales se
colorearon de morado, lo que nos lleva a concluir que eran GRAM+.
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CONCLUSIONES

 Con la ayuda de la coloración se puede observar mejor las muestras en el


microscopio, pudiéndose distinguir sus partes.

 La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que
los microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este
procedimiento no mueren todas las bacterias.

 La coloración de Wright nos ayuda a diferenciar los tipos de células de la


sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre para ser
examinadas en el microscopio. Debido a que ayuda a distinguir fácilmente
las células de la sangre es una técnica muy usada para el conteo de los
glóbulos blancos.

 La tinción de GRAM resulta de gran importancia para poder identificar el tipo


de bacteria de acuerdo a la clasificación dada por la composición de sus
paredes, de esta manera podemos tener una mejor visualización para las
bacterias. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular
bacteriana como para poder realizar diferencias entre las bacterias,
considerando Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de
color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.
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BIBLIOGRAFÍA

 http://seramix.blogs.uv.es/2013/05/08/preparacion-y-tincion-de muestras/

 https://prezi.com/uio5lty6pz8s/tecnicas-de-fijacion-y-tincion/

 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

 http://histologiaunam.mx/descargas/ensenanza/portal_

recursos_linea/apuntes/3_tecnica_histologica.pdf

 http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdeti

ncion.pdf

 http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020082552/1020082552_019.pdf

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