Fmoc-OASUD: Un nuevo reactivo para la preparación de Fmoc-aminoácidos libres de impurezas

resultantes de la transposición de Lossen

abstract

Se describe un nuevo reactivo, éster de 9-fluorenilmetoxi-carbonil-N-hidroxi-3-azaspiro [5,5]

undecano-2,4-diona (Fmoc-OASUD) para la preparación de aminoácidos Fmoc. El Fmoc-OASUD
reacciona con aminoácidos a temperatura ambiente en presencia de una base y da Fmoc-
aminoácidos con altos rendimientos y pureza. Los Fmoc-aminoácidos preparados usando Fmoc-
OASUD están libres de impurezas debido al reordenamiento de Lossen, que están generalmente
presentes cuando se usa Fmoc-OSu. Esto se debe principalmente a la mayor estabilidad de Fmoc-
OASUD en comparación con Fmoc-OSu.

introoo

El grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) se introdujo por primera vez por Carpino, como un
grupo protector de amino lábil de base.1,2 La ventaja de Fmoc es que se escinde bajo condiciones
básicas muy suaves, pero estable bajo condiciones ácidas.3 Debido a esto Ventaja ortogonal, el
grupo Fmoc se utiliza ampliamente en la síntesis de péptidos, especialmente en la síntesis en fase
sólida.

El método inicial para la introducción del grupo Fmoc se basó en el uso del cloroformiato de 9-
fluorenilmetoxilo.4 Sin embargo, se descubrió que los Fmoc-aminoácidos preparados utilizando
Fmoc-Cl estaban contaminados con niveles significativos de fosfocéptidos y tripéptidos
correspondientes.5,6 Como una alternativa, se desarrolló el éster Fmoc-N-hidroxisuccinimida
(Fmoc-OSu) como un reactivo para la preparación de Fmoc-aminoácidos.7 Los Fmoc-aminoácidos
preparados usando Fmoc-OSu estaban libres de impurezas peptídicas. En la actualidad, Fmoc-OSu
se considera como el reactivo de elección para la preparación de Fmoc-aminoácidos.8 También se
prefiere para la preparación a gran escala de Fmoc-aminoácidos.9

Sin embargo, se encontró que los Fmoc-aminoácidos preparados usando Fmoc-OSu contenían
Fmoc-b-alanina y Fmoc-b alanil dipéptido como principales impurezas.10,11 Dado que estas
impurezas pueden tomar parte más en la síntesis de péptidos, dicho Fmoc-amino contaminado
Ácidos producen serios problemas en la fabricación de fármacos peptídicos.

El origen de tales impurezas relacionadas con la b-alanina se atribuye a la descomposición de Fmoc-

OSu seguida por la transposición de tipo Lossen (Esquema 1) .8 Zalipsky también informó la
formación de impurezas de b-Alanina a partir de carbonatos de succinimidilo a través de la
transposición de Lossen.

Nuestros estudios anteriores demostraron que el uso de diciclohexilamina da lugar a la supresión

de las impurezas de b-alanina y dipéptido de Fmoc-aminoácidos preparados a partir de Fmoc-
OSu.13 Recientemente, se informó N-hidroxi-3-azaspiro [5,5] undecano- 2,4-diona (OHASUD 1),
como una alternativa a la N-hidroxisuccinimida, para preparar péptidos. El 1, reacciona con
aminoácidos N-protegidos y da ASUD activó ésteres de aminoácidos, que son útiles en la síntesis de
péptidos.14,15
En el presente documento, se informa que el éster de 9-fluorenilmetoxi-carbonil-N-hidroxi-3
azaspiro [5,5] undecano-2,4-diona (Fmoc-OASUD, 2) es un nuevo reactivo para preparar Fmoc-
aminoácidos con altos rendimientos Y la pureza. El 2 reacciona con aminoácidos, a temperatura
ambiente, en presencia de una base, para dar Fmoc-aminoácidos 3 (Esquema 2).

Resultados y discusión

El reactivo 2 se prepara convenientemente con altos rendimientos haciendo reaccionar 1 con Fmoc-
Cl en presencia de una base en acetona acuosa (Esquema 3).

El 2 es un sólido cristalino que es estable y puede almacenarse a temperatura ambiente en un

recipiente hermético durante varios meses sin ninguna degradación

Como reacción modelo, se estudió la síntesis de Fmoc-L-alanina a partir de L-alanina y 2 en presencia

de una base en diversas condiciones experimentales. L-alanina se hizo reaccionar con 2 en presencia
de carbonato de sodio como base en un sistema de agua-dioxano (1: 2) a temperatura ambiente. La
reacción se completó en aproximadamente una hora. La acidificación de la mezcla de reacción da
Fmoc-L-alanina en buenos rendimientos. Sin embargo, contenía 2 como una impureza menor que
se elimina por lavado con metil terc-butiléter antes de la acidificación. A veces, los rastros de 1
también se observaron como impureza. Aunque la mayor parte de 1 permanece en fase acuosa, una
pequeña cantidad se extrae en la capa de acetato de etilo. Sin embargo, esto también se elimina en
la recristalización de acetona-agua.

Se estudiaron varios disolventes (Tabla 1). Aparte de solubilizar 2 parcialmente o completamente,

los disolventes desempeñaron un papel importante en la reacción. Los mejores resultados se
obtuvieron a partir de 1,4-dioxano y acetonitrilo. Otros disolventes tales como acetona, THF y DMF
dieron bajos rendimientos. También se estudiaron varias bases. Los mejores resultados se
obtuvieron a partir de carbonato sódico y trietilamina. El carbonato sódico dio mejores
rendimientos cuando se usó con dioxano, en comparación con acetonitrilo, mientras que la
trietilamina con acetonitrilo dio rendimientos más altos. La reacción fue más rápida y se completó
en 0,5 h cuando se utilizó trietilamina con acetonitrilo o dioxano. El uso de otras bases tales como
hidróxido de sodio, bicarbonato de sodio, diisopropilamina y diisopropiletilamina dio como
resultado rendimientos más bajos.
En todas las reacciones, el análisis por HPLC del producto mostró una alta pureza sin formación
detectable de impurezas que pudiera resultar del reordenamiento de tipo Lossen.

Esto es principalmente debido a una mayor estabilidad de 2 en comparación con Fmoc-OSu. No se

observó hidrólisis de 2 en el medio de reacción hasta 3 h, que es el tiempo de reacción máximo
estudiado. Cuando se agita 2 en medio alcalino acuoso durante 5 h, se observa aproximadamente
0,12% de una impureza. Se encontró que la impureza era Fmoc-gabapentina, resultante de la
transposición de Lossen (Esquema 4)

La Fmoc-gabapentina fue confirmada por su LCMS y por comparación con la muestra estándar
preparada como se describe por Wu et al. Algunas de las muestras de Fmoc-L-alanina, fueron
contaminadas con el dipéptido, Fmoc-Ala-Ala-OH en menos del 0,1% de nivel. Su presencia
también se confirmó comparando con la muestra estándar. Si es necesario, una segunda
recristalización con acetona-agua eliminará la impureza Fmoc-Ala-Ala-OH dando como resultado
una pureza de casi 100%, pero con una pérdida de rendimiento del 1-2%.
Utilizando las condiciones de reacción optimizadas, se preparó el derivado Fmoc de otros
aminoácidos (Tabla 2). En todos los casos se obtuvieron altos rendimientos y pureza. Ninguna de
las muestras mostró ninguna impureza que pudiera formarse debido a la transposición de Lossen,
mientras que las muestras preparadas a partir de Fmoc-OSu mostraron aproximadamente 0,14-
0,5% de Fmoc-b-Ala-Ala-OH como impureza resultante de la transposición de Lossen

En algunos casos, se detectaron impurezas dipeptídicas correspondientes, pero fueron menores

que 0,1%. En algunos casos, se detectó 2 como impureza y se eliminó fácilmente mediante lavado
con metil terc-butil éter. En el caso de la glicina, la alanina y la fenilalanina, los correspondientes
derivados de Fmoc se obtuvieron después de la acidificación, directamente por filtración, sin más
elaboración. En el caso de la prolina, serina, tritilcistina y tritylhistidina, se obtuvo un material
gomoso después de la acidificación, que requirió un tratamiento adicional que implicó la
extracción con acetato de etilo. Cuando la mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, una
cantidad de 1 estuvo presente como impureza y se eliminó por recristalización en el sistema
acetona-agua. En todos los casos, la pureza quiral de la muestra permaneció sin cambios.

Conclusión

En conclusión, el presente estudio ha demostrado que el éster de 9-fluorenilmetoxicarbonil-N

hidroxi-3-azaspiro [5,5] undecano-2,4-diona (Fmoc-OASUD, 2) es un nuevo y excelente reactivo
para preparar Fmoc - aminoácidos. El reactivo 2 es un sólido cristalino estable que puede
prepararse con altos rendimientos y pureza haciendo reaccionar 1 con cloruro de Fmoc. El reactivo
2, reacciona con aminoácidos de una manera fácil a temperatura ambiente, en un tiempo corto,
para dar Fmoc-aminoácidos en buenos rendimientos. Los Fmoc-aminoácidos ası preparados
presentan elevada pureza quımica y quiral. Las impurezas observadas debido a la reordenación de
tipo Lossen en el caso del Fmoc-OSu ampliamente utilizado, estaban ausentes en el presente caso.
Esto se debe principalmente a la mayor estabilidad de 2 en medio acuoso básico, en comparación
con Fmoc-OSu.