1.

_OBJETIVO

 Aprender a usar las técnicas microscópicas para diferenciar bacterias

morfológicas y tintorialmente.
 Que el alumno aprenda a clasificar las bacterias aplicando una técnica
diferencial como es la tinción de Gram.

2._MARCO TEORICO

Las bacterias solo pueden ser vistas con ayuda del microscopio con gran poder de
resolución en la mayoría de las veces son necesarias 400 o1000aumentos para ver a
estos microorganismos como pequeños cuerpos puntiformes y además se deben
aplicar ingeniosas técnicas de coloración para resaltar algunas estructuras de sus
célula y contrastarlo con el medio.

Por lo menos se deben distinguir dos tipos de observaciones microscópicas

a) observaciones al estado fresco que se hacen con células vivas sin ayuda de
colorantes

b) observaciones de prelaciones coloreadas que se hacen con bacterias muertas y

teñidas con ciertos colorantes que confieren su color al reaccionar con algunas
estructuras de la célula.

Determinación de la movilidad bacteriana

La determinación de la movilidad bacteriana es uno de

los parámetros que se utiliza en la identificación de
bacterias. Esta capacidad usualmente se debe a la
presencia de flagelos; sin embargo, algunas bacterias
no flageladas son capaces de moverse a lo largo de
superficies solidas por desplazamiento asociado a
fimbrias polares muy largas; también, algunas bacterias
acuáticas pueden regular su posición y moverse
mediante vesículas de gas. En cualquier caso, la
movilidad capacita a la célula bacteriana para
alcanzar diferentes regiones en su microambiente, lo
que representa una ventaja, pero ese desplazamiento
tiene un costo energético.
Fig.1 Movilidad bacteriana – Salmonella typhi

(Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio – Rodríguez Cavallini,

Evelyn. Editorial Universidad de Costa Rica .Año: 2004)
2.1_Observaciones microscópicas de bacterias al estado fresco

Se hacen para determinar la movilidad de los microorganismos vivos.

TECNICA DE GOTA PENDIENTE

 Ponga un poco de vaselina en las cuatro equinas de la lámina cubreobjetos.

 Deposite una pequeña gota de agua
en el centro del cubre objetos.
 Emulsione en el agua una pequeña
porción de masa microbiana.
 Adherir una lámina portaobjetos
excavado haciendo coincidir el centro
de la gota con la parte más profunda
de la depresión.
 Voltear la preparación llevarla al
microscopio y observarla con el objeto
de 40X en seco o con el objeto de 100X
previa adición de una gota aceite de Fig. 2 técnicas de la gota pendiente
inversión.

Considerar a los microorganismos con movilidad positiva si se desplazan rápidamente

saliendo del campo del microscopio y con movilidad negativa o inmóvil si solamente
giran en su mismo lugar por el movimiento browniano que le confiere el líquido.

OBSERVACION ENTRE LAMINA PORTAOBJETOS Y LAMINA CUBREOBJETOS

Se realiza para determinar el tamaño la forma y agrupación de las bacterias se siguen

los siguientes pasos:

 Prepare una emulsión de bacterias en la superficie de una lámina

portaobjetos.
 Coloque una lámina cubreobjetos en el centro de la emulsión.
 Observe al microscopio con el objeto de inmersión y sacar la máxima
información acerca del tamaño forma y agrupación de los microorganismos.

2.2 TINCION NEGATIVA

Se realiza tiñendo la superficie de la lámina portaobjetos con un colorante que no

entre en reacción con los microorganismos y por lo tanto los deje como estructuras
transparentes que resalten en un fondo oscuro.

La tinción negativa sirve para obtener una imagen más exacta del tamaño real de las
células bacterianas y a veces para determinar la presencia de capsulas.

Fig.3 tinción negativa

OBSERVACIONES MICROSCOPICAS DE PREPARACIONES COLOREADAS

Se hacen con ayuda de colorantes que son sustancias químicas que al entrar en
reacción con las células imparten su color y le dan mayor constaste para la
observación.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS

Antes de que puedan teñir los microorganismos se debe preparar una capa de células
lo suficientemente delgada como para permitir al paso de la luz han la observación
microscópica la cual debe fijar para mantener los detalles morfológicos y a la vez
pueda resistir los pasos de coloración y lavado posteriores a esto se llama preparación
de un frotas.

2.3 COLORACION GRAM

Es una coloración diferencial que permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos:
las gran-positivas que fijan el cristal violeta; y las gran –negativas que no le fijan en un
proceso de coloración con varios pasos de coloración sucesivos.

La técnica de gran se hace siguiendo el siguiente procedimiento:

 Preparar un frotis
 Agregar con solución colorante de cristal violeta durante un minuto
 Lavar con agua corriente
 Agregar con lugol durante
un minuto
 Lavar con agua corriente
 Decolorar con alcohol –
acetona por 30 segundos
 Lavar con agua corriente
 Dejar secar
 Observar en el
microscopio con el objeto
de inversión

Fig. 4 coloraciones GRAM

Los organismos que se tiñen de color violeta reciben el nombre de gram-positivos y los
que se tiñen de color rojo gram-negativos
4.-RESULTADOS

 Bacteria usada: Salmonella Typhi

- Formado por bacilos Gram negativos, anaerobios

facultativos, con flagelos perítricos que rodean al
microorganismo y no desarrolla cápsula ni espora.

Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno.

No fermentan ni lactosa sacarosa.

 PRUEBA DE LA GOTA PENDIENTE

COMO DEBIÓ DE OBSERVARSE COMO SE OBSERVÓ

 RECONOCIMIENTO DE BACTERIAS GRAM (+) Y (-)

COMO DEBIÓ DE OBSERVARSE COMO SE OBSERVÓ

- La salmonella typhi es Gram - Se observó la coloración

negativa. característica de una bacteria
Gram negativa: rojo por la
safranina.
5.-DISCUCIONES

- Según Calva: “Las salmonellas son bacterias Gram-negativas, lo cual significa

que no se tiñen de azul con el colorante aplicado en la prueba diseñada por
Gram. Esto se debe a que dicho colorante tiñe la pared celular, que en estos
casos está cubierta por una membrana externa. Es así que estas bacterias
están envueltas por varias capas: la membrana externa, la pared celular (que
es diez veces más delgada que en las bacterias Gram-positivas), y la
membrana interna. La membrana externa e interna delimitan al periplasma. La
apariencia de las bacterias en el microscopio es de bacilos, o cilindros con
puntas redondeadas.”

Lo cual concuerda con nuestra practica: Salmonella typhi  Gram negativa

- Según Calva: “Estos bacilos no producen esporas. La mayoría de las cepas son
móviles debido a que poseen flagelos peritricos, que rodean a la célula.”

En la prueba de la gota pendiente de la práctica se logró observar la movilidad de

esta enterobacteria, esto porque posee flagelo.

- Según “la tinción negativa no se trata de una tinción propiamente dicha ya que
no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción
entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace con
una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos
particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo
de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y
se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro”.

Según lo realizado en la práctica; al agregar tinta nigrosina, no se logran observar a los

microorganismos

6.-CONCLUCIONES

 Se usaron correctamente las técnicas microscópicas para diferenciar bacterias

morfológicas y tintorialmente.
 Se aprendió a clasificar las bacterias aplicando una técnica diferencial como
es la tinción de Gram.
7.-ACTIVIDADES

 Observar en el microscopio las diferentes bacterias dibujarlas y compararlas

con las referencias bibliográficas

Gram Positivo: Staphyloccocus aureus Gram Negativo: Escherichia coli bacillis subtillis

 Investigar las diferencias entre bacterias gran positivas y gran negativas

investigar sobre cada una de las bacterias sembradas en el laboratorio

DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN POSITIVA Y OTRA GRAN

NEGATIVA.

BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Poseen una pared celular
interna y una pared de
peptidoglucano.
*Peptidoglucano: es un
exoesqueleto que da
consistencia y forma esencial
para replicación y
supervivencia de la bacteria.
No tiene membrana externa
Poseen una pared celular más
compleja:
-pared celular interna
-pared de peptidoglucano
- bicapa lipídica externa
Membrana externa: forma un
saco rígido alrededor de la
bacteria, mantiene estructura
y es barrera impermeable a
macromoléculas, ofrece
protección en condiciones
adversas

No tiene espacio
periplasmático
La red de mureína está muy
desarrollada y llega a tener
hasta 40 capas
La penicilina mata a las gram
positivas, ya que bloquea la
formación de enlaces
peptídicos entre las diferentes
cadenas del peptidoglucano
Espacio periplasmático:
espacio entre la superficie
externa de la membrana
citoplasmática y la interna de
la membrana externa.
La red de mureína presenta
una sola capa
La penicilina no mata a las
Gram negativas, a causa de la
capa de
lipopolisacáridos situada en la
parte externa de la pared
 celular.

En la tinción de Gram, retienen Quedan decoloradas.

la tinción azul

Conservan el complejo yodo Pierden el complejo yodo

colorante colorante

8.-BIBLIOGRAFIA

Calva, E. Salmonella typhi y la fiebre tifoidea: de la biología molecular a la salud

pública. Instituo de Biotecnología UNAM. En: http://www.biblioweb .tic.unam.mx/li
bros/microbios /Cap4/. Leído el 09 de junio de 2015.

Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007. Introducción a la Microbiología, 9ª Ed.

Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE OCEANOGRAFIA, PESQUERIA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA ALIMENTARIA

TEMA: