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Descifrando la red de señalización hormonal detrás de la resistencia sistémica inducida por Trichoderma

harzianum en tomate

La colonización de raíces por aislados de Trichoderma seleccionados puede activar en la planta una respuesta de
defensa sistémica que es efectiva contra un amplio espectro de patógenos de plantas. Diversas hormonas vegetales
desempeñan un papel fundamental en la regulación de la red de señalización de defensa que conduce a la inducción
de resistencia sistémica desencadenada por organismos beneficiosos [resistencia sistémica in ducida (RIS)]. Entre
ellos, las vías de señalización de ácido jasmónico (JA) y etileno (ET) son generalmente esenciales para ISR. Sin
embargo, se cree que Trichoderma ISR (TISR) implica una variedad más amplia de rutas de señalización,
interconectadas en una compleja red de rutas de hormonas que se comunican entre sí. Utilizando el tomate como
modelo, se realizó un análisis integrativo de los principales mecanismos implicados en la resistencia sistémica
inducida por Trichoderma harzianum frente al patógeno foliar necrotrófico Botrytis cinerea. Colonización de raíces
por T. harzianum hizo que las hojas fueran más resistentes a B. cinerea independientemente de los efectos principales
sobre la nutrición de las plantas. El análisis del desarrollo de la enfermedad en brotes de líneas mutantes de tomate
con alteración en la síntesis de las hormonas clave relacionadas con la defensa JA, ET, ácido salicílico (SA) y ácido
abscísico (ABA) y el péptido prosistemín (PS) puso de manifiesto el requisito de vías de señaliza ción de JA, SA y ABA
intactas para una TISR funcional. El análisis de expresión de varios genes marcadores relacionados con hormonas
apunta al papel del cebado para respuestas de defensa dependientes de JA mejoradas sobre la infección de
patógenos. En conjunto, nuestros resultados indican que aunque TISR inducida en tomate contra necrótrofos se basa
principalmente en respuestas dependientes de JA potenciadas, las vías reguladas por las hormonas vegetales SA y
ABA también son necesarias para el desarrollo exitoso de TISR.

Palabras clave: Botrytis sp., Resistencia sistémica inducida, ácido jasmónico, fitohormona, cebado, señalización,
tomate, Trichoderma sp.

INTRODUCCIÓN

Se ha informado que la colonización de raíces por aislados de Trichoderma seleccionados aumenta la resistencia a
diferentes tipos de patógenos en diversas especies de plantas, tanto por debajo como por encima del suelo (revisado
en Harman et al., 2004). Este control biológico se puede lograr mediante un efecto directo de Trichoderma sobre los
patógenos de las plantas (revisado en Vinale et al., 2008); o indirectamente a través de efectos mediados por la
planta al mejorar el estado nutricional de la planta (Shoresh y Harman, 2008) o mediante la activación parcial del
sistema inmune de la planta (revisado en Shoresh et al., 2010). De hecho, algunas cepas de Trichoderma competentes
pueden colonizar las raíces de las plantas sin dañar los tejidos de las plantas pero induciendo cambios en la fisiología
de las plantas y el sistema de defensa de las plantas (Yedidia et al., 1999; Alfano et al., 2007; Chacón et al., 2007).
Brotman et al., 2012; Mathys et al., 2012). Como en otras interacciones benéficas planta-microbio, estos cambios
podrían estar asociados con una estrategia reguladora de la planta para limitar la colonización microbiana del
"invasor bene fi cioso" (Zamioudis y Pieterse, 2012).

Aunque se carece de una clara comprensión del proceso de reconocimiento de la planta Trichoderma, se han descrito
varios elicitores que pueden activar la inmunidad basal de la planta en Trichoderma, incluida la xilanasa inductora de
etileno (ET) (Hanson y Howell, 2004); el inductor proteináceo no enzimático Sm1 (Djonovic et al., 2006, 2007); o los
peptaibols de 18mer (Viterbo et al., 2007). Solo un número limitado de receptores de reconocimiento de patrones
capaces de reconocer algunos de estos patrones moleculares asociados a microbios relacionados con Trichoderma
(MAMP) se han caracterizado hasta ahora (Ron y Avni, 2004; Petutschnig et al., 2010). Durante la infección
"asintomática" de las raíces, la planta limita la colonización endofítica de Trichoderma mediante la activación de
ciertas respuestas de defensa de las plantas, incluyendo el refuerzo de la pared celular y la acumulación de
compuestos antimicrobianos y especies reactivas de oxígeno (Yedidia et al., 1999). , 2000; Chacón et al., 2007;
Contreras-Cornejo et al., 2011; Salas-Marina et al., 2011). Después de la limitación exitosa de la penetración de los
hongos a las primeras capas de células corneales, la expresión de algunos genes relacionados con la defensa y la
actividad antimicrobiana vuelven a los niveles previos a la infección (Yedidia et al., 1999, 2003; Masunaka et al. .,
2011). Es probable que Trichoderma sea capaz de "cortocircuitar" la señalización de defensa de la planta,
posiblemente a través de la secreción de efectores fúngicos aún desconocidos, que suprimen la defensa de la planta
para que permanezca acomodada por la planta como un simbionte avirigido. La interacción entre la planta y
Trichoderma debe ser finamente regulada, asegurando beneficios a ambos socios, con la planta recibiendo
protección y más nutrientes disponibles y el hongo obteniendo compuestos orgánicos y un nicho para el crecimiento.

La colonización de Trichoderma desencadena, por lo tanto, una amplia gama de respuestas vegetales que pueden
dar como resultado una capacidad defensiva mejorada de la planta (Bailey et al., 2006; Marra et al., 2006; Alfano et
al., 2007; Morán-Diez et al., 2012). Con frecuencia, los efectos de Trichoderma en el sistema de defensa de la planta
no se restringen a la raíz, sino que también se manifiestan en tejidos vegetales sobre el suelo (Martínez -Medina et
al., 2010, 2011a; Salas-Marina et al., 2011; Mathys et al., 2012), lo que hace que la planta sea más resistente a un
amplio espectro de patógenos de plantas. Esta resistencia sistémica es probablemente el resultado de la modulación
de la red de defensa de la planta que puede traducir los eventos de señalización temprana inducidos por Trichoderma
en una activación más eficiente de las respuestas de defensa. Es bien sabido que las fitohormonas ácido jasmónico
(JA), ácido salicílico (SA), ácido abscísico (ABA) y ET actúan como señales primarias dominantes en la regulación de
las respuestas de defensa locales y sistémicas en las plantas (revisado en Pieterse et al., 2009), y en consecuencia,
juegan un papel central en los fenómenos de resistencia inducida. Generalmente, la resistencia sistémica adquirida
(SAR) inducida por patógenos depende de la vía de señalización regulada por SA (Durrant y Dong, 2004), mientras
que la ISR por microorganismos beneficiosos generalmente depende de la señalización de JA (Pieterse et al., 1996;
Van Loon et al. al., 1998; Pozo et al., 2008; Van Wees et al., 2008; Van der Ent et al., 2009). Sin embargo, a medida
que se caracterizan más agentes inductores de la resistencia, la implicación de otras vías de señalización en la
inducción de la resistencia se hace evidente. De hecho es la diafonía entre las diferentes vías de señalizaci ón lo que
proporciona a la planta una poderosa capacidad para regular finamente su respuesta inmune a invasores específicos
(Pieterse et al., 2009), y como la resistencia inducida suele ser una mejora de la basal. defensas, la implicación de
múltiples hormonas en la formación de ISR es probable. La resistencia inducida puede ser el resultado de la activación
directa de los mecanismos de defensa, incluido el aumento de los niveles basales de hormonas relacionadas con la
defensa, o del aumento de la capacidad defensiva de la planta. En este último, se produce una activación más
eficiente de los mecanismos de defensa tras el ataque, y puede no estar relacionado con cambios en el contenido de
hormonas, sino en la susceptibilidad de los tejidos a estas hormonas ( Conrath et al., 2006).

Los estudios de expresión sobre genes marcadores vinculados a las principales vías de señalización de defensa
sugirieron que la resistencia sistémica inducida por Trichoderma (TISR) podría implicar la activación directa de vías
relacionadas tanto con SA como con JA (Alfano et al., 2007; Salas-Marina et al. , 2011; Mathys et al., 2012; Morán-
Diez et al., 2012). A pesar de esta posible activación directa de las defensas, la mayoría de los ejemplos apuntan a
una activación potenciada de las defensas tras el ataque de varios patógenos (Segarra et al., 2009; Perazzolli et al.,
2011; Brotman et al., 2012; Mathys et al., 2012). ) Sin embargo, la activación de una vía no prueba su papel en la
resistencia. El requisito de una vía de señalización específica en TISR solo puede abordarse mediante estudios
fenotípicos del desarrollo de la enfermedad en líneas mutantes dañadas en esas vías, sin embargo, solo un número
limitado de estudios en la planta modelo Arabidopsis han abordado esta cuestión. El estudio pionero de Korolev et
al. (2008) utilizando múltiples líneas mutantes de Arabidopsis mostraron que la inducción de resistencia por
Trichoderma harzianum Rifai T39 contra Botrytis cinerea requiere señalización de JA, ET y ABA, mientras que no se
requirió SA. Usando diferentes cepas de Trichoderma y la misma Arabidopsis-B. cinerea pathosystem otros autores
han confirmado el requerimiento de JA para TISR, mientras que la necesidad de una vía de señalización intacta de SA
y ET es más controvertida (Segarra et al., 2009; Mathys et al., 2012). En resumen, en Arabidopsis, JA ha sido
sistemáticamente informado como esencial para TISR contra B. cinerea y otros patógenos, pero el requerimiento de
SA y ET puede depender de la cepa Trichoderma (Korolev et al., 2008; Segarra et al. 2009; Mathys et al., 2012).

De acuerdo con los datos informados, es probable que la inducción de resistencia contra patógenos específicos en
diferentes huéspedes pueda requerir diferentes vías de señalización. Aunque la inducción de TIS R en tomate se ha
demostrado contra patógenos bacterianos y fúngicos (Alfano et al., 2007; Tucci et al., 2011), las vías de señalización
implicadas aún no se han investigado. Aquí pretendemos obtener más información sobre el papel de las principales
vías de señalización de defensa que operan en TISR en tomate contra el patógeno fúngico principal

B. cinerea (Dean et al., 2012). Primero tratamos de desacoplar el papel de los mecanismos de defensa de las plantas
de la posible contribución de los aspectos nutricionales. Luego analizamos las vías de señalización necesarias para el
establecimiento de TISR eficiente a través del análisis fenotípico de la enfermedad en mutantes de señalización de
tomate. Finalmente, exploramos la respuesta de defensa de la planta de sencadenada por el ataque de patógenos en
plantas inducidas mediante el control de la expresión de genes marcadores relacionados con la defensa.

En resumen, presentamos un análisis integrativo de los principales mecanismos implicados en la resistencia sistémica
inducida por T. harzianum T-78 en un cultivo agronómicamente importante, el tomate, frente al agente causal del
moho gris B. cinerea. Las vías relacionadas con hormonas implicadas en TISR se han analizado con el fin de
proporcionar información sobre la red de señalización que regula la resistencia sistémica inducida por el
tchichoderma del tomate.

MATERIALES Y MÉTODOS

CEPAS MICROBIANAS Y PREPARACIÓN DE INOCULA

El inóculo Trichoderma harzianum T-78 (CECT 20714, colección española de tipos de cultivo) se preparó utilizando un
medio sólido específico, obtenido mezclando avena comercial, bentonita y vermiculita de acuerdo con Martínez -
Medina et al. (2009). El hongo necrotrófico utilizado en este estudio fue B. cinerea CECT2100 (colección española de
cultivos tipo) amablemente proporcionado por el Dr. Flors (Universidad de Valencia). Para la producción de esporas,
B. cinerea se cultivó en agar dextrosa de patata (PDA; Difco Laboratories, Detroit) complementado con hojas de
tomate a 40 mg ml-1 a 24 ° C (Vicedo et al., 2009). Se recogieron esporas de B. cinerea de cultivos de 15 días de edad
y se incubaron en medio B5 de Gambor (Duchefa, Haarlem, Países Bajos) suplementado con sacarosa 10 mM y
KH2PO4 10 mM para 2 h en la oscuridad sin temblores, de acuerdo con Vicedo et al. (2009).

MATERIAL VEGETAL

Diez diferentes genotipos de tomate (Solanum lycopersicum) se utilizaron en nuestros estudios, incluidos los cuatro
cultivares wild-type Castlemart, Moneymaker, UC82B y Betterboy y las siguientes líneas mutantes relacionadas con
la defensa: el mutante def1 JA-deteriorado (Howe et al., 1996 ) en el fondo Castlemart (proporcionado por G. Howe,
Universidad Estatal de Michigan). Las líneas dañadas SA y ABA NahG (Brading et al., 2000) y sitiens (Taylor et al.,
1988), respectivamente, en el fondo Moneymaker (proporcionado por J. Jones, John Innes Center y C. Hanhart,
Wageningen Universidad, respectivamente). ET-mutante alterado ACD (Klee et al., 1991), en el fondo UC82B
(proporcionado por H. Klee, Universidad de Florida). La línea antisentido de prosistemina PS- (Orozco-Cárdenas et
al., 1993) y la línea de sobreexpresión PS (McGurl et al., 1994) ambas en el fondo Betterboy (proporcionado por C.
Ryan y G. Pearce, Universidad Estatal de Washington) . Las semillas se esterilizaron superficialmente en hipoclorito
de sodio al 4% que contenía Tween-20 al 0,02% (v / v), se enjuagaron concienzudamente con agua estéril y
germinaron durante 1 semana en vermiculita estéril a 25 ° C en la oscuridad.

DISEÑO EXPERIMENTAL Y ESTADO DE CRECIMIENTO

Las plántulas individuales se transfirieron a macetas de 0,25 l con una mezcla de arena estéril: suelo (4: 1) que
contenía el inóculo de Trichoderma. El inóculo de T. harzianum se mezcló a través del suelo hasta una densidad final
de 1 106 conidias por gramo de suelo antes de trasplantar las plántulas de tomate. Se añadió la misma cantidad de
arena: mezcla de suelo pero libre de T. harzianum para controlar las plantas. Para cada tratamiento, se usaron un
total de seis plantas. Las plantas se distribuyeron al azar y se cultivaron en un invernadero a 24/16 ° C con un
fotoperíodo de 16/8 h y 70% de humedad, y se regaron tres veces a la semana con solución de nutrientes de Ashton
largo (Hewitt, 1966). Después de 5 semanas, se cosecharon las plantas y se dete rminaron las raíces y se dispararon
los pesos frescos. La cuarta y la quinta hojas de cada planta se desprendieron para la inoculación con el patógeno, y
el resto de los brotes se reservó para análisis nutricionales. Las muestras de raíces de cada planta i ndividual se
enjuagaron a fondo y se recolectaron para análisis microbiológicos. El sustrato unido al sistema radicular se consideró
sustrato rizosférico y se reservó para análisis microbiológicos.

Botrytis cinerea BIOASSAY

La cuarta y la quinta hojas de cada planta individual se separaron de la planta con una cuchilla y se desafiaron con el
patógeno aplicando gotas de 5 μl de una suspensión de esporas de B. cinerea a 5 106 ml -1, previamente incubadas
en medio B5 de Gambor complementado con sacarosa (0.1 mM) y fosfato (0.1 mM) por 4 h (Vicedo et al., 2009). Se
recogieron una hoja de cada hoja desprendida de control y plantas inoculadas con T. harzianum y se congelaron
inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a 80 ° C hasta su uso en análisis moleculares como controles
no infectados (tiempo 0). Se aplicaron dos gotas de 5 μl en cada una de las hojas restantes, una a cada lado del nervio
central. Se colocaron hojas separadas inoculadas con Botrytis en papel mojado dentro de bandejas de plástico
cubiertas con película transparente para mantener condiciones de alta humedad relativa, y se mantuvieron a 15-20
° C con un fotoperíodo de 16 h de luz. Las hifas fúngicas crecieron concéntricamente desde el sitio de inoculación,
resultando en necrosis visible a las 48 h después de la inoculación. Los síntomas de la enfermedad se puntuaron 72
y 96 horas después de la inoculación (hpi) al determinar el diámetro promedio de la lesión en 12 ho jas por genotipo
y tratamiento.

ANÁLISIS DE CONTENIDO DE NUTRIENTES VEGETALES

El contenido de nutrientes de los brotes se midió en CEBAS-CSIC (España). Las hojas se enjuagaron brevemente con
agua desionizada y se secaron al horno a 60 ° C durante 72 h, y se molieron hasta obtener un polvo fino. Las muestras
se digirieron mediante una técnica de microondas, utilizando un instrumento de digestión de microondas Milestone
Ethos I, de acuerdo con Martínez-Medina et al. (2011b). Se digirió una alícuota estándar (0,1 g) de material vegetal
seco y finamente molido con ácido nítrico concentrado (HNO3, 8 ml) y peróxido de hidrógeno (H2O2, 2 ml).
Posteriormente, el contenido de elementos de nutrición de la planta, incluyendo fósforo y potasio, se analizaron
simultáneamente usando ICP (Iris Intrepid II XD2 Thermo). El contenido de nitrógeno se determinó usando un
analizador de carbono / nitrógeno de la serie Flash 1112 EA. Seis repeticiones biológicas de seis plantas
independientes se midieron para cada tratamiento.

Trichoderma CUANTIFICACIÓN EN LA RHIZOSFERA

Diluciones seriadas de la arena: se usaron muestras de mezcla de suelo en solución de ringer estéril de un cuarto de
resolución para cuantificar unidades formadoras de colonias de T. harzianum (ufc) mediante una técnica de recuento
en placa usando PDA modificado con 50 mg de L-1 rosa de bengala y 100 mg L-1 sulfato de estreptomicina, de acuerdo
con Martínez-Medina et al. (2011b). Las placas se incubaron a 28 ° C y se contaron ufc después de 5 días. Los datos
se expresaron por gramo de suelo seco.

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA POR RT-qPCR

El ARN total de las hojas de tomate se extrajo usando Tri-reactivo (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. El ARN se trató con RQ1 DNasa (Promega), se purificó a través de una columna de sílice ut ilizando el
kit de limpieza NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel) y se almacenó a 80 ° C hasta su uso. Se recogió tejido foliar de
hojas de tomate 96 h después de la infección del patógeno. La segunda hoja de las hojas también se recogió como
control no infectado. La síntesis complementaria de ADN (ADNc), las condiciones de los experimentos de RT-qPCR
(reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa) y la cuantificación relativa de los niveles de ARNm
específico se realizaron de acuerdo con López-Ráez et al. (2010) y utilizando los cebadores genéticos específicos
descritos en la Tabla 1. Los valores de expresión se normalizaron utilizando el gen de mantenimiento SlEF, que
codifica el factor de alargamiento del tomate-1α. Los experimentos se repitieron independientemente y cada
reacción se realizó por duplicado.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS, versión 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.). Los datos sobre
el diámetro de la lesión en diferentes genotipos de tomate se sometieron a un análisis de varianza de dos vías
(ANOVA). La significación estadística de los resultados se determinó mediante la realización de la prueba de rango
múltiple de Tukey (P <0.05). Para los datos sobre el contenido nutricional de las plantas, se realizaron comparaciones
por pares para cada genotipo entre plantas inoculadas con Trichoderma y control con la prueba t de Student (P
<0.05). Con respecto a la cuanti fi cación de T. harzianum en el suelo, los tratamientos no inoculados se excluyeron
de los análisis ya que T. harzianum no se detectó en ninguno de los tratamientos no inoculados, y se realizaron
comparaciones por pares entre cada mutante afectado y su correspondiente tipo salvaje con Prueba t de Student (P
<0.05). Para los análisis de expresión génica en el Moneymaker de tipo salvaje, se realizaron comparaciones por pares
para cada gen entre plantas inoculadas con Trichoderma y control con la prueba t de Student (P <0,05). También se
realizaron comparaciones por pares con la prueba t de Student (P <0,05) para el análisis de expresión entre plantas
inoculadas con Trichoderma y control para cada gen en los genotipos def1 y Moneymaker. Todos los experimentos
se repitieron al menos 2 veces, con resultados similares.

Tabla 1 | Primer secuencias utilizadas en el análisis de expresión génica. Los genes monitorizados se usan como
marcadores para las rutas indicadas. Jasmonato (JA), ácido salicílico (SA), ácido abscísico (ABA) y etileno (ET).
ID T arget Gen Related pathw ay Primer (5j –3j )

AF083253 Multicysta tin 1 (MC) JA inducible GAGAATTT CA A GGA A GTT CAA


GGCTTTATTTCA CA CA GA GATA

K03291 Inhibidor de prote ina sa s II1 (PI II) JA inducible GAAAATCGTT AA TTT AT CCCA C

ACATACAA A CTT T CCAT CT TT A

M84801 Prosys te min2 ( PS) JA and ABA inducible AATTTGT CT CCCGT TA GA


AGCCAAAA GAA A GGA A GCA AT

M69247 proteina relaicona da con la patogenis is PR1a3 (PR1)SA inducible GTGGGAT CGGA TT GA TAT CCT

CCTAAGC CA C GA T A CCAT GA A

M83314 fenilalanina amonio liasa 2 (PAL) SA biosynthe sis CGTTATGCTCTCCGAACATC

GAAGTT GCCA CCA T GTA A GG

X51904 Proteína protectora de desecación3 (Le4) ABA inducible ACTCAAGGCA T GGGT A CT GG

CCTTCTTTCTCCTCCCACCT

NM001247876 β-1,3-glucanasa2 (gluB) ET inducible CCATCACAGGGTT CATTTA GG

CCATCCA CT CT CT GA CA CA A CT

X14449 Factor de elongación 1α 4 (SlEF) Housekee ping GATTGGTGGTATT GGAACTGT C

AGCTTCGT G GT G CA T CT C

XM_001560987.1 β-tubulin5 Quantification of B. cinérea CCGTCAT GT CC GGT GTT A CCA C

tubulin mRNA levels CGACCGT T A CGGA AA T CGGA A

RESULTADOS

Trichoderma harzianum INDUCE LA PROTECCIÓN SISTÉMICA CONTRA LA INFECCIÓN DE Botritis cinerea

Las plantas de cinco semanas de edad de dos diferentes cultivares de tomate (Castlemart y Moneymaker) inoculados
con T. harzianum fueron desafiados con el patógeno foliar B. cinerea. Se registró el progreso de la enfermedad y se
muestran los datos correspondientes a 96 hpi. Las plantas inoculadas con T. harzianum dieron como resultado una
reducción estadísticamente significativa del diámetro de la lesión en ambos cultivares, en comparación con las
plantas de control no tratadas (Figuras 1A, B).

LA PROTECCIÓN SISTÉMICA TRIGGERADA POR Trichoderma harzianum EN TOMATE NO SE RELACIONA CON LA


PROMOCIÓN MEJORADA DE LA NUTRICIÓN O EL CRECIMIENTO

Con el fin de determinar el efecto de T. harzianum en planta desa- rrollo, disparan y se evaluaron las raíces pesadas
frescas y nitrógeno, fósforo, y el contenido de rodaje de potasio se midieron en las l íneas de tomate Castlemart y
Moneymaker 5 semanas después de la inoculación con T. harzianum. No hubo diferencias significativas en el
crecimiento asociado con la inoculación de T. harzianum en ninguna de las líneas de tomate (Tabla 2). Excepto por
una disminución moderada de los niveles de potasio en Castlemart, los análisis de nutrientes en brotes no mostraron
diferencias en los principales macronutrientes nitrógeno y fósforo entre plantas inoculadas con Trichoderma y
control, lo que sugiere que los efectos de Trichoderma sobre el desarrollo de l a enfermedad no pueden considerarse
una consecuencia de mejora en el crecimiento de las plantas o mejora de la nutrici ón.

Trichoderma harzianum-LA RESISTENCIA SISTÉMICA INDUCIDA ES DEPENDIENTE DE LAS FITOFORMONAS JA, SA y


ABA
Con el fin de analizar la participación de diferentes vías relacionadas con la defensa en ISR mediada por Trichoderma,
investigamos el efecto de T. harzianum sobre la infección por B. cinerea en diferentes líneas mutantes de tomate y
sus correspondientes antecedentes. Se seleccionaron los mutantes afectados en la biosíntesis de hormonas
específicas relacionadas con la defensa, incluyendo el indefenso1 de JA (def1), el NahG deficiente en SA, el sitiens
deficiente en ABA y el ET-subproducto de deaminasa de ACC ACD. Además, también analizamos el desarrollo de la
enfermedad en las líneas de tomate que sobreexpresan el gen de la prosistemina en el sentido (PS) y la orientación
antisentido (PS). Prosystemin es el precursor de la hormona de defensa peptídica systemin, un regulador positivo de
la señalización de JA. La ación eva- de las lesiones sobre Botrytis inoculación reveló que el desarrollo de la enfermedad
fue significativamente afectada por el genotipo de la planta (P <0,001; F = 7,43), el tratamiento de hon gos (P <0,001;
F = 10,98) y su interacción (P <0.01; F 2.82), confirmada por el análisis ANOVA bidireccional. Como se muestra en la
Figura 2A el efecto supresor sobre la enfermedad B. cinere a observado en las plantas Castlemart de tipo salvaje
provocada con T. harzianum estuvo ausente en la fi ciente mutante DEF1 JA -de, indicando que se requiere la vía
regulada-JA para TISR contra B. cinerea . De forma similar, las líneas mutantes dañadas en la acumulación de SA
(NahG) y ABA (sitiens) no mostraron la TISR frente a B. cinerea observada en su Moneymaker de fondo
correspondiente (Figura 2B). En la línea transgénica NahG, la acumulación de SA se bloquea mediante la
transformación de SA en catecol. Curiosamente, observamos una menor susceptibilidad de las plantas de control
NahG hacia la infección por B. cinerea en comparación con su parental salvaje Moneymaker (P <0.1), lo que apoya la
idea de que SA afecta negativamente la resistencia basal contra este necrótrofo en tomate (Figura 2B). En contraste
con Castlemart y Moneymaker, las plantas silvestres de UC82B no pudieron desarrollar T. harzianum ISR (Figura 2C).
En los mutantes de desaminasa de ACC (ACD) subproductores de ET, T. harzianum ligerament e, pero no redujo
significativamente la lesión del patógeno (más del 20%). Respecto a systemin, las plantas de la línea mutante PS
sobreexpresante, producida y no provocada con T. harzianum fueron más resistentes al necrótrofo que cualquier
otro cultivar probado (P <0.05), confirmando la participación de esta molécula en la resistencia basal del tomate
contra B. cinerea. Aunque la resistencia inducida por T. harzianum en el tipo salvaje Betterboy, la colonización con
Trioderma no pudo reducir el desarrollo de la enfermedad de B. cinerea en PS. Sorprendentemente, T. harzianum
también fue capaz de inducir ISR en la línea de tomate silenciada en la expresión de prosistemina PS- (Figura 2D).
FIGURA 1 | Trichoderma harzianum induce protección sistémica contra el patógeno Botrytis cinerea en plantas de tomate. (A) La s hojas de plantas de
tomate de 5 semanas de edad (cultivadas por Castlemart y Moneymaker) cultivadas en suelo que contenía o no T. harzianum fueron desafiadas con
una suspensión conidial de B. cinerea. El diámetro de la lesión se determinó 96 h después de la inoculación del patógeno. Los datos muestran el
diámetro de la lesión (mm) ± SE (n = 12). Los datos que no comparten una letra en común difieren significativamente (P <0.05) según la prueba de
rango múltiple de Tukey. (B) Desarrollo de síntomas de B. cinerea en T. harzianum inoculadas y no inoculadas (control) plantas (cv. Moneymaker).

Tabla 2 | Efecto de Trichoderma harzianum en el desarrollo de la planta de tomate. Dispare y arrastre el peso fresco
(en gramos) y dispare el contenido de nitrógeno, fósforo y potasio (g / 100 g de peso fresco) de las líneas de tomate
de 5 semanas de antigüedad Castlemart y Moneymaker inoculadas con T. harzianum.

T omate Cv. T ratamiento S hoot fresh Peso de raiz Disparo de N Disparo de P Disparo de K
f resco (g) f resca (g) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g)

Castlemart Control 9.90 ± 0.46 1.63 ± 0.16 2.69 ± 0.20 0.243 ± 0.054 2.54 ± 0.13
T. harzianum 8.20 ± 0.30 1.67 ± 0.35 2.43 ± 0.21 0.174 ± 0.012 2.05 ± 0.09*
Moneyma ke r Control 10.15 ± 0.57 1.77 ± 0.15 1.90 ± 0.14 0.164 ± 0.045 2.30 ± 0.09
T. harzianum 10.05 ± 0.69 1.32 ± 0.19 2.02 ± 0.34 0.124 ± 0.008 2.66 ± 0.24
Los datos son el medio de seis réplicas ± SE. Para cada genotipo de tomate, los asteriscos indican diferencias estadísticamen te significativas entre plantas inoculadas y no
inoculadas de T. harzianum (prueba t de Student, P <0.05).

Trichoderma harzianum COLONIZA EFECTIVAMENTE LA RIZOSFERA Y LAS RAÍCES DE LAS LÍNEAS DE TOMATE DE TIPO
SILVESTRE Y MUTANTE

El efecto de biocontrol de Trichoderma está asociado a su colonización eficiente de la rizosfera. Para analizar si la
incapacidad de los mutantes para montar TISR está relacionada con una colonización de Trichoderma deficiente,
probamos la capacidad de T. harzianum para colonizar la rizosfera de las diferentes l íneas mutantes de tomate y sus
antecedentes correspondientes. El número de unidades formadoras de colonias de Trichoderma (ufc) en la rizosfera,
determinada después de 5 semanas, fue similar a los valores iniciales de inoculaci ón en todas las líneas evaluadas.
No encontramos diferencias signi fi cativas (P <0.05) en el número de ufc en la rizosfera de las diferentes líneas
mutantes de tomate en comparación con sus correspondientes antecedentes genéticos. Además, la colonización
endofítica también se confirmó para todas las líneas. La incubación de raíces esterilizadas en superficie en
condiciones apropiadas reveló que Trichoderma podría crecer más allá de las raíces independientemente del
genotipo de la planta. Los resultados indicaron que el deterioro en la producci ón de las hormonas JA, SA, ABA, ET o
systemin no afecta la capacidad de T. harzianum para la rizosfera y la colonizaci ón de la raíz.
Trichoderma harzianum IMPULSA LAS DEFENSAS DEMASADAS DE JASMONATO

La resistencia sistémica inducida por microbios beneficiosos comúnmente no se asocia con cambios importantes en
la expresión génica relacionada con la defensa. En cambio, se desencadena una reacción inmune sistémica
relativamente leve que a menudo se asocia con cebado para una mejor defensa. Para establecer si la resistencia
mejorada inducida por T. harzianum en el tomate se asoció con el inicio de la defensa de la planta, se comparó la
respuesta de la planta a B. cinerea en Trichoderma y no provocó plantas. Analizamos mediante RT-qPCR la expresión
de genes marcadores conocidos para las vías principales relacionadas con la defensa de plantas en B. cine rea
desafiadas. No se encontraron diferencias significativas para los genes marcadores de las rutas modificadas por SA-
(PR1a y PAL) o ET- (gluB) entre plantas inducidas y no inducidas por Trichoderma (datos no mostrados). Por el
contrario, una expresión mejorada de los genes sensibles a JA PI II, MC y PS, que codifica inhibidor de proteinasa II,
multicystatin y prosistemina, respectivamente, se encontró en T. harzianum en comparación con plantas no elicitadas
(Figura 3A). Curiosamente, las plantas inoculadas con T. harzianum mostraron una inducción nula o leve de esos
genes en ausencia del patógeno (Figura 3B), lo que apunta a la sensibilización de las respuestas de defensa
dependientes de JA como el mecanismo subyacente a la inducci ón de resistencia contra B. cinerea . Las plantas
colonizadas por T. harzianum también mostraron mayores niveles de expresión del gen marcador Le4 responsante
ABA (que codifica una proteína protectora de la desecación) después de la exposición al patógeno, pero se observó
un aumento similar en las plantas inducidas por T. harzianum en ausencia del patógeno (Figuras 3A, B).

Figura 2 | La resistencia sistémica inducida por Trichoderma requiere JA, SA y ABA. El diámetro de la lesión se midió 96 h después d e la exposicióncon
el patógeno en (A) las plantas de tomate de tipo salvaje cv. Castlemart y el mutante deteriorado JA def1; (B) en el cv. Moneymaker y los mutantes
deteriorados SA y ABA NahG y sitiens, respectivamente; (C) en el cv. UC82B y en la ACD mutante afectada por ET; y (D) en el c v. Betterboy y en la línea
mutante sobreexpresiva PS + y la línea silenciada prosystemin PS-. Los datos muestran el diámetro de la lesión (mm) ± SE (n = 12). Los datos que no
comparten una letra en común difieren signi fi cativamente (P <0.05) según la prueba de rango múltiple de Tukey.
Confirmamos además el cebado de las respuestas de defensa dependientes de JA contra B. cinerea con el an álisis de
la proliferación de patógenos y la inducción de respuestas de JA en hojas de Castlemart de tipo salvaje y el def1 de
JA-deficiencia. Los niveles de expresión de un gen constitutivo de B. cinerea en hojas confirmaron que las diferencias
observadas en el desarrollo de síntomas (Figura 2) se debieron a diferencias en la proliferación de patógenos en los
tejidos, y confirmaron que las plantas def1 no pudieron desarrollar resistencia inducida por Trichoderma en contraste
con el Castlemart salvaje (Figura 4A). La incapacidad de las plantas def1 para desarroll ar TISR se correlacionó con la
falta de cebado de la expresión de PI II (Figura 4B), lo que respalda aún más el papel esencial de las respuestas de JA
cebada en la resistencia sistémica potenciada por Trichoderma.

Figura 3 | Trichoderma prepara respuestas reguladas por JA. La expresión de diferentes genes marcadores relacionados con la defensa se analizó en
plantas inoculadas y no inoculadas (control) de T. harzianum (variedad Moneymaker) 96 horas después de la infección del patógeno (A) y antes de la
infección (B). Niveles de expresión de los genes marcadores relacionados con JA PI II, MC y PS; y se muestra el gen marcador Le4 relacionado con ABA.
Los resultados se normalizaron a los niveles de expresión del gen SlEF. Los niveles de expresión se informan como el aumento del pliegue con relación
al de las plantas de control no tratadas con T. harzianum ± SE (n = 5). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las plantas
inducidas y no inducidas por Trichoderma (prueba t de Student, * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001).

DISCUSIÓN

Las especies seleccionadas de Trichoderma colonizan las raíces de las plantas y establecen relaciones simbióticas con
la planta. Como consecuencia, la resistencia de las plantas contra los patógenos se mejora con frecuencia, incluso en
los tejidos superiores (Segarra et al., 2009; Fontenelle et al., 2011; Perazzolli et al., 2011; Brotman et al., 2012;
Yoshioka et al., 2012). ) En este estudio analizamos la efectividad de la colonización de raíces de T. harzianum T-78
en la mejora de la resistencia del tomate contra el patógeno necrotrófico foliar B. cinerea. T. harzianum T-78 es un
agente eficaz de control biológico en el suelo (Martínez-Medina et al., 2011b), con alta capacidad micoparasitaria
(López-Mondéjar et al., 2011), pero su capacidad para inducir resistencia de las plantas no era previa probado .
Figura 4 | El cebado de las defensas con Trichoderma harzianum requiere la señalización de JA. El gen constitutivo de Botrytis cinerea, Bc-Tubulin (A), y
el gen marcador PI relacionado con JA, PI (B) se analizaron en hojas de las plantas de tomate de tipo salvaje cv. Castlemart y el mutante afectado por JA
def1 tras 96 h de infección por B. cinerea. Los resultados se normalizaron a la expresión del gen SlEF en las mismas muestras. Los datos muestran el
nivel de expresión relativa (± SE). Para cada genotipo de tomate, los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas entre las plantas
inducidas y no inducidas por Trichoderma (prueba t de Student, P <0.05, n = 5).

Encontramos que el tratamiento de las raíces de tomate con T. harzianum T-78 redujo claramente el desarrollo de la
enfermedad tras la inoculación con el patógeno necrotrófico B. cinerea en tres de los cuatro cultivares evaluados
(Castlemart, Moneymaker y Betterboy). Examinamos la presencia de Trichoderma aislado T-78 en los brotes y no
pudimos detectar su presencia en ninguno de los cultivares de tomate (datos no presentados). Por lo tanto,
Trichoderma y el patógeno permanecen físicamente separados, y en consecuencia, se puede concluir que T.
harzianum T-78 activa una respuesta sistémica mediada por plantas que es efectiva para restringir el desarrollo de
B. cinerea. La dependencia del genotipo de la planta de TISR contra Botrytis, también mostrada para otros cultivares
de tomate (Tucci et al., 2011), confirma además que la protección depende de los mecanismos mediados por la
planta. Otros estudios han demostrado la capacidad de diferentes cepas de Trichoderma para i nducir un efecto
mediado por la planta contra este necrotropo, principalmente en Arabidopsis (Korolev et al., 2008; Contreras -Cornejo
et al., 2011; Mathys et al., 2012) pero también en otras plantas de cultivo (De Meyer et al., 1998; Tucci et al., 2011).

Se informa que la colonización con Trichoderma mejora la nutrición y el crecimiento de las plantas en varias especies
de plantas (Martínez-Medina et al., 2011b; Salas-Marina et al., 2011; Tucci et al., 2011). Como la mejora de la
nutrición de las plantas se considera uno de los mecanismos responsables de la bioprotecci ón contra los patógenos
por microorganismos beneficiosos (Whipps, 2001) tratamos de analizar la contribuci ón de este efecto a la resistencia
mejorada observada. En nuestras condiciones experimentales, no hubo un aumento en el crecimiento de la planta
ni en el contenido de nutrientes asociado a la colonización por Trichoderma, probablemente porque las plantas se
cultivaron en condiciones óptimas (Martínez-Medina et al., 2011b). Por lo tanto, nuestro sistema experimental
permite desacoplar efectos nutricionales y de defensa, y se puede concluir que el efecto protector observado en las
plantas inoculadas con Trichoderma T-78 se relacionó con mecanismos distintos de una nutrición mejorada, muy
probablemente relacionada con las defensas de las plantas.

En cuanto a ISR por rizobacterias no patógenas seleccionadas (Van Wees et al., 1999; Verhagen et al., 2004; Pozo et
al., 2008), algunos estudios han demostrado que la resistencia sistémica desencadenada por Trichoderma requiere
capacidad de respuesta a JA y ET (Shoresh et al., 2005; Segarra et al., 2009; Perazzolli et al., 2011; Tucci et al., 2011).
Sin embargo, el análisis fenotípico de la enfermedad en mutantes de señalización de Arabidopsis reveló que otras
hormonas de moléculas pequeñas como SA o ABA también podrían jugar un papel fundamental en la regulación de
esta red (Korolev et al., 2008; Mathys et al., 2012; Yoshioka et al. al., 2012). Para determinar las principales v ías de
señalización involucradas en la resistencia sistémica inducida por T. harzianum T-78 en tomate contra B. cinerea, se
evaluó la capacidad de diferentes mutantes de tomate con alteración hormonal para el desarrollo de TISR. El análisis
fenotípico del desarrollo de la enfermedad en los mutantes dañados JA (def1) - y SA (NahG) demostró que la
resistencia sistémica inducida por T. harzianum contra B. cinerea requiere no solo las vías de señalización de JA sino
también de SA, ya que las líneas mutantes desarrollaron un nivel de enfermedad similar al de las plantas de control
no inducidas. De manera similar, un estudio reciente mostró un papel de la vía SA en T. hamatum T-382-ISR inducido
contra B. cinerea en Arabidopsis, ya que TISR estaba bloqueado en los mutantes SA -deteriorados NahG y sid2 (Mathys
et al., 2012). ) En contraste, la resistencia inducida por Trichoderma asperellum en Arabidopsis contra el pat ógeno
foliar hemibiotrófico Pseudomonas syringae parece ser independiente de SA, ya que TISR se expresó completamente
en el mutante sid2 con alteración del SA (Segarra et al., 2009). Así, las evidencias experimentales respaldan que la
resistencia inducida es un proceso fl exible que puede implicar diferentes v ías de señalización según el modo de
acción del patógeno, como se ha demostrado para algunos compuestos químicos que inducen resistencia (Flors et
al., 2008). Nuestros resultados demuestran que en el tomate, se requieren vías de señalización de SA y JA para el
desarrollo de TISR frente a B. cinerea. Los patógenos necrotróficos suelen controlarse mediante respuestas de
defensa de JA (Glazebrook, 2005), y la señalización de JA se ha mostrado clave para la resistencia basal a Botrytis en
tomate (AbuQamar et al., 2008; El-Oirdi et al., 2011). Por lo tanto, no es sorprendente el requisi to de la vía de
señalización hormonal intacta relacionada con JA para las defensas de las plantas potenciadas contra Botrytis por
Trichoderma. El papel de la señalización SA en la resistencia de las plantas contra B. cinerea es, sin embargo, más
complejo (Ferrari et al., 2003). Recientemente se ha demostrado que SA juega un papel regulador en el equilibrio
entre enfermedad y resistencia, ya que Botrytis induce la señalización SA para promover la enfermedad en tomate a
través de su interacción negativa con la vía dependiente de JA (El-Oirdi et al., 2011). En relación con ET, dado que las
plantas silvestres UC82B no pudieron desarrollar ISR inducido por T. harzianum, no se pudo determinar si se requiere
señalización ET para TISR frente a B. cinerea. En contraste con los hallazgos anteriores en ISR mediada por
rizobacterias (Pieterse et al., 1998; Knoester et al., 1999), Mathys et al. (2012) observaron un papel limitado de la vía
ET en la resistencia inducida por T. hamatum T382. Nuestros resultados, aunque no son concluyentes, están en línea
con este hallazgo ya que se observó un desarrollo reducido de la enfermedad en ET-mutantes (ACD). Es notable que
las plantas no inducidas de tipo salvaje UC82B mostraron la menor susceptibilidad a B. cinerea entre todos los
cultivares evaluados, y probablemente T. harzianum no pudo aumentar aún más la resistencia de las plantas.
Además, el análisis del desarrollo de la enfermedad en los sitiens mutantes deficientes ABA mostró que la
interrupción de la señalización ABA da como resultado la pérdida de la capacidad de desarrollar TISR contra B.
cinerea. Aunque ABA se asocia comúnmente con el desarrollo de plantas y el estrés abiótico, su función en la
inmunidad de las plantas ahora es clara, ya que se ha demostrado que esta hormona está conectada a la red SA-JA-
ET (Anderson et al., 2004; Mauch- Mani y Mauch, 2005). El papel del ABA en la resistencia al tomate contra patógenos
es controvertido, y se han dado indicaciones tanto para un papel en la susceptibilidad como en la resisten cia (Flors
et al., 2008; Sánchez-Vallet et al., 2012). En tomate, se ha propuesto un papel regulador negativo de ABA en la
resistencia a B. cinerea, ya que el mutante de sitiens mostró una susceptibilidad reducida que las plantas de tipo
salvaje (Audenaert et al., 2002; Asselbergh et al., 2007, 2008). En nuestro sistema, las plantas de sitiens no mostraron
resistencia basal mejorada en comparación con las plantas silvestres, lo que indica que ABA no es un jugador
importante en la resistencia basal, pero es importante para la resistencia inducida por Trichoderma. De acuerdo con
estas observaciones, Vicedo et al. (2009) encontraron que los mutantes deficientes en ABA no se vieron afectados
en la resistencia basal contra B. cinerea, pero se vieron perjudicados en la protección mediada por ácido hexanoico
contra este patógeno, también basada en respuestas de JA cebada.

Finalmente, se ha demostrado que systemin desempeña un papel en la resistencia contra B. cinerea en tomate (Díaz
et al., 2002; El-Oirdi et al., 2011). El examen de la enfermedad en la línea mutante que sobreexpresa confirmó un
papel del polipéptido en la resistencia basal contra B. cinerea, ya que los mutantes PS + que sobreexpresan eran
altamente resistentes al necrótrofo. Probablemente debido a esta alta resistencia, Trichoderma no pudo aumentar
la resistencia en esta línea. Sorprendentemente, el análisis de la línea silenciada en la expresión de prosistemina PS-
mostró que TISR se expresó completamente en los mutantes PS, lo que sugiere que la resistencia sistémica mediada
por T. harzianum contra B. cinerea no se basa en la señalización de sistemina.
Los efectos de Trichoderma sobre las defensas vegetales se han relacionado con la capacidad f úngica para la
colonización de raíces intercelulares (Yedidia et al., 2000; Chacón et al., 2007; Djonovic et al., 2007; Velázquez-
Robledo et al., 2011). Se confirmó la rizosfera exitosa y la coloración endofítica de la raíz por T. harzianum T-78 para
todos los genotipos. Por consiguiente, el defecto en TISR observado en algunos de los mutantes no est á relacionado
con defectos en la colonización, sino con el requerimiento de la hormona en la regulación de la respuesta de la planta
al patógeno. Los hallazgos anteriores demuestran que la resistencia mediada por T. harzianum contra B. cinerea
requiere las rutas reguladas por JA, SA y ABA. La intercomunicación entre las vías de señalización relacionadas con
hormonas actúa como un mecanismo de regulación eficiente en función del costo para las respuestas de defensa
inducibles (revisado en Pieterse et al., 2009), y nuestros resultados sugieren que la intercomu nicación entre las vías
de señalización JA, SA y ABA es esencial para la inducción de mecanismos de resistencia por Trichoderma T-78 en
tomate. Sin embargo, queda por determinar si otras hormonas, como la auxina, la giberelina, la citoquinina y los
brasinoesteroides, también pueden contribuir a la red reguladora detrás de la resistencia a B. cinerea inducida por
Trichoderma.

Una vez que se identificaron los elementos clave en la regulaci ón de la respuesta durante TISR, nuestro objetivo es
identificar las respuestas de defensa reales que subyacen a la resistencia en las plantas inoculadas con Trichoderma.
Para eso, comparamos la respuesta de defensa de la planta a la infección de Botrytis en Trichoderma y no provocó
plantas a través del análisis de expresión de los genes de defensa conocidos, marcadores de las principales v ías
relacionadas con la defensa. La coloración de T. harzianum de las raíces dio como resultado la sensibilización de los
tejidos vegetales de la superficie para una expresión génica que responde a JA mejorada, como una expresión
potenciada de los genes marcadores regulados por JA PI II, PS y MC que codifican e l inhibidor de proteinasa II ( Farmer
y Ryan, 1992), la prosistemina, el precursor de la hormona sistémica (Farmer y Ryan, 1992) y multicystatin (Girard et
al., 2007) se observó en plantas inducidas por Trichoderma, tras la infección por B. cinerea. Recientemente se ha
informado que el inhibidor II de proteinasa codificado para PI II juega un papel importante para la resistencia del
tomate contra B. cinerea (El-Oirdi et al., 2011). La inducción de esos genes en los brotes de plantas por Trichoderma
fue relativamente débil antes de la infección por Botrytis, lo que apunta a la sensibilización de las respuestas de
defensa dependientes de JA como el mecanismo que subyace a la inducci ón de resistencia contra B. cinerea. La
activación de un estado de cebado relacionado con JA en plantas por Trichoderma se ha observado previamente en
plantas de Arabidopsis, tomate y vid (Segarra et al., 2009; Tucci et al., 2011; Brotman et al., 2012; Perzzolli et al. al.,
2012) sin costos evidentes para la planta. De hecho, la sensibilización con microorganismos beneficiosos ofrece
protección de amplio espectro siempre que sea necesario (Van der Ent et al., 2009), sin costos de energía
significativos para el metabolismo y crecimiento de las plantas (Walters y Heil, 2007; Van Wees et al., 2008) . La
elicitación con Trichoderma, sin embargo, no estimuló las respuestas de defensa relacionadas con SA o ET contra B.
cinerea, ya que no se encontraron variaciones en los genes del marcador SA PR1a y PAL ni en el gluB regulado por ET
en nuestro estudio, en contraste con estudios anteriores (Yedidia et al., 2003; Shoresh et al., 2005). Sin embargo,
como la resistencia a B. cinerea es dependiente de JA (AbuQamar et al., 2008) y la se ñalización SA es el objetivo del
patógeno de interferir con la señalización de JA y promover la enfermedad (El-Oirdi et al., 2011), cebado de
respuestas de SA en esta interacción sería perjudicial para la planta. En particular, la inoculación de Trichoderma
indujo la expresión del gen Le4 del marcador ABA antes de la infección por B. cinerea, lo que sugiere una activación
directa moderada de la señalización de ABA que podría participar en la defensa contra el patógeno.
FIGURA 5 | Modelo de resistencia inducida por Trichoderma (TISR) contra Botrytis cinerea en tomate. L a colonización de raíces con Trichoderma
ceba los tejidos de las hojas para una activación mejorada de las respuestas de defensa reguladas por JA que conducen a una m ayor resistencia al
necrótrofo. Para el desarrollo de TISR se requieren vías de señalizaci ón JA, SA y ABA intactas.

La identificación de las respuestas JA preparadas como el mecanismo de control subyacente a TISR en el pathosystem
de tomate B. cinerea se corroboró adicionalmente en el mutante def1 afectado por JA a través de la cuantificación
de la biomasa del patógeno y la inducción de defensas de las plantas. El fracaso de las plantas def1 para desarrollar
TISR se correlacionó con la falta de cebado para la expresión de PI II. Estos resultados confirman el papel esencial de
la expresión potenciada de las respuestas de JA en la mejora de la resistencia por Trichodermaagainst B. cinerea.

En resumen, este estudio proporciona evidencia de que T. harzianum induce resistencia sist émica contra B. cinerea
en tomate a través de una respuesta de defensa dependiente de JA potenciada, que reduce la proliferación de
patógenos y el desarrollo de enfermedades en las hojas de las plantas. La regulaci ón de la respuesta requiere no solo
JA sino también al menos señalización SA y ABA (Figura 5). En general, nuestros resultados apoyan el papel central
constante de JA en la inducción de resistencia por diferentes cepas de Trichoderma, e ilustran el requerimiento de
otras vías de señalización que probablemente moldeen la respuesta final adaptada al patógeno desafiante.

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