RESUMEN: La saliva generalmente se deposita en marcas de mordiscos encontradas en muchos

homicidios, agresiones y otros casos criminales. En el presente estudio, la saliva obtenida de

voluntarios se depositó en la piel y se recuperó para extracción y tipificación de ADN con el fin
de evaluar su utilidad para la investigación de casos prácticos y discutir la contribución de la
odontología forense a la tipificación de ADN de saliva. Veinte muestras de saliva fueron
recolectadas de diferentes donantes y utilizadas como muestras de sospechosos. Cinco de estas
muestras se seleccionaron al azar y se depositaron (250 μl) en la piel del brazo. La saliva se
recogió de la piel con la técnica de hisopado doble. El ADN de saliva y muestras de saliva
depositadas en la piel se extrajeron mediante el método de fenol-cloroformo. Las muestras de
ADN se amplificaron mediante PCR para tipificación de ADN usando un conjunto de 15 STR. La
recuperación de ADN de la saliva depositada en la piel fue de 14 a 10 veces menor que la
cantidad de ADN de las muestras de saliva. La tipificación del ADN se demostró en 4 de 5
muestras de saliva depositadas, los índices de probabilidad estimados para estas muestras en
base a los datos de la población brasileña fueron 1:11, 1: 500, 1: 159.140 y 1: 153.700.123.
Nuestros resultados indican que los procedimientos estandarizados utilizados para la
recolección y extracción de ADN de la saliva depositada en la piel pueden usarse como un
método para recuperar ADN salival en casos criminales. Sin embargo, es importante observar
que la recuperación de ADN en muestras forenses puede ser difícil. Este estudio sugiere que el
análisis de la saliva depositada en la piel se incorpore a una investigación criminal ya que puede
tener un gran poder discriminatorio. DESCRIPTORES: ADN; Odontología forense; Saliva.

INTRODUCCIÓN
El campo forense dental incluye la investigación de identidades o desastres. También incluye la
ficación de restos humanos desconocidos como parte de un análisis de manchas y líquidos
orgánicos del buc cavidad calórica o su contenido, comparación de marca de mordida,
investigación de traumatismos y lesiones orales tales como casos de lesiones personales y
negligencia dental5. En investigaciones criminales, uno de los requisitos fundamentales es que
la víctima y el agresor sean identificados positivamente. La odontología forense contribuye al
proceso forense mediante una comparación directa de la dentición del difunto con la de los
registros dentales conocidos o mediante la habilitación de un perfil del individuo con respecto a
la edad de fallecimiento, sexo y posible ascendencia racial para reducir la búsqueda de una
posible víctima5,8. La saliva se puede encontrar en víctimas de varios crímenes violentos29. Se
ha demostrado que la saliva puede recuperarse y tipificarse a partir de marcas de mordiscos3-
5,25, colillas de cigarrillos, estampillas postales, sobres y otros objetos9,22,24. Las manchas de
saliva seca son invisibles, dificultando su reconocimiento y recolección24. Sin embargo, la
presencia de saliva puede confirmarse mediante un ensayo de amilasa9.
En una marca de mordida, el diente, en combinación con otras piezas bucales, causa una marca
en la piel de las víctimas o algún objeto, que puede ser comparado con las características únicas
de la dentición de un mordedor sospechoso mediante varias metodologías3,5,29. No hay
acuerdo entre los dentistas forenses sobre la individualidad (singularidad) de la dentición o el
comportamiento de la piel humana durante la mordedura. Sin embargo, las distorsiones pueden
modificar, complicar o hacer imposible la interpretación de una marca de mordida. Distintas
distorsiones pueden ocurrir en diferentes etapas de la acción de morder, como las distorsiones
dinámicas y de los tejidos, y durante el examen y el registro de la evidencia25.
Además de la evidencia física presente en una marca de mordida, hay evidencia biológica que
puede ayudar a la investigación. Durante el proceso de mordedura, la saliva se deposita en la
piel o en la superficie del objeto en una cantidad suficiente como para permitir la tipificación del
ácido desoxirribonucleico (ADN) 23,25. Para este propósito, el área de la marca de mordida se
limpia con los procedimientos estándar de marca de mordida, y se puede extraer ADN y
analizado22,25.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la replicación de miles de copias de una
secuencia de ADN específica in vitro, lo que permite el estudio de pequeñas cantidades de
DNA20. La reparación polimórfica de repeticiones cortas en tándem (STR) principalmente en
fragmentos pequeños también permite evaluar el ADN de muestras con un grado de
degradación significativo. Un paso muy importante de este procedimiento es obtener ADN a
partir de esta pequeña cantidad9,14,22,26
En el presente estudio, la saliva obtenida de voluntarios se depositó en la piel y se recuperó para
extracción y tipificación de ADN con el fin de evaluar su utilidad para la investigación de casos
prácticos y discutir la contribución de la odontología forense a la tipificación de ADN de saliva.

MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras
Se recogieron muestras de saliva de 20 voluntarios no relacionados (11 hombres y 9 mujeres,
de 24 a 47 años) pidiéndoles que escupieran en recipientes de prueba de plástico estériles (STLU
Ind. E Com. De Artefatos Plásticos Ltda. - Me, São Paulo, SP , Brasil). Luego, se transfirieron 1,5
ml de muestra de saliva de cada donante a dos criotubos de 1,5 ml (Axygen Scientific, Union
City, CA, EE. UU.) Y se congelaron a -20 ° C. Las muestras se recogieron al menos 30 minutos
después de comer, beber, fumar o besarse para minimizar la contaminación del ADN o los
inhibidores de la PCR21.
Cinco muestras de los 20 donantes fueron elegidas al azar para depositar parte de la saliva en la
piel. Para este propósito, las muestras de saliva se depositaron individualmente en uno de los
brazos de los investigadores. La saliva fue recolectada de este investigador para establecer su
tipificación de ADN para ser comparado con los perfiles de los donantes de saliva.
Las muestras se obtuvieron luego del consentimiento informado de donantes brasileños, luego
de que el protocolo de estudio fuera aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la
Facultad de Odontología de la Universidad de São Paulo (proceso número 41/01).

Deposición experimental de saliva en la piel

Doscientos cincuenta microlitros de cada muestra de saliva se colocaron en cinco áreas
delimitadas del brazo del investigador y las áreas de la piel se delimitaron con un rotulador.
Harvey 8 (1976) estimó que se depositan 0,3 ml de saliva al hacer una marca de mordida; en
este estudio, utilizamos 0.25 ml para simular la recuperación menor de la mancha de saliva.
Después de 10 minutos, la saliva seca se extrajo de la piel mediante la técnica de hisopado doble
con un hisopo de algodón húmedo (Vacutest Kima s.r.l., Arzergrande, PD, Italia) seguido de un
hisopo de algodón seco23, y el ADN se extrajo inmediatamente.

Extracción y cuantificación de ADN

Las muestras de saliva (1,5 ml) se centrifugaron (CELM LS-3, São Paulo, SP, Brasil) a 3.000 rpm
durante 10 minutos a temperatura ambiente para separar solo los sedimentos celulares. Los
hisopos de piel se rompieron y solo sus partes de algodón se dispusieron en un tubo de propileno
de 1,5 ml (Axygen Scientific, Union City, CA, EE. UU.); se hidrataron con agua estéril antes de la
extracción de ADN. Después de esta preparación inicial, las muestras se digirieron con 700 μl de
tampón de lisis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU.) (Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH
8,0; NaCl 0,1 M; 2%). SDS) que contiene 35 μl de proteinasa K (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.)
(20 mg / ml). La extracción de ADN se llevó a cabo mediante el método de fenol-cloroformo10
(Fenol: Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; Cloroformo: Merck, Darmstadt, Alemania).

Después de la precipitación con etanol (Merck, Darmstadt, Alemania); El ADN de muestras de

saliva e hisopos de piel se resuspendieron en 100 μl y 30 μl de TE (Sigma-Aldrich Co., St. Louis,
MO, EE. UU.) (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0), respectivamente. El ADN se
cuantificó usando el Beckman DU 640 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton,
TABLA 1 - (continuación) Resultados de tipado de ADN de 15 STR para muestras de saliva de
donantes (14-20) e investigador

EE.UU.) espectrofotómetro y la pureza se verificó a una relación de 260/280 nm.

Tipificación de ADN
Quince STR del ADN genómico humano se amplificaron mediante PCR. Los conjuntos de
cebadores para D3S135812, D5S818, D7S820, D13S31710, D16S53913, D18S51, D19S253,
FGA28, D21S11, F13A01, TH0127, F13B16, FES / FPS19, SE - 33 o ACTBP218 y VWA15 se
marcaron con Cy5 (Cy5 - bis - OSU, N, N'-biscarboxipentil-5,5'-disulfonatoindodicarbocianina) en
el extremo 5 '(Synthegen, Houston, TX, EE. UU.). PCR se estandarizaron previamente para los 15
STR usando MgCl2 25 mM (GE Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido), 10 mM de cada
dNTP (GE Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido), 80 nM de cada cebador , 1 U Taq ADN
polimerasa (GE Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido) y 200 ng a 500 ng de ADN genómico
hasta un volumen final de 25 μl. Los fragmentos de ADN se amplificaron en el termociclador
modelo PTC-100 (MJ Research, Watertown, MT, EE. UU.) Con el siguiente programa:
desnaturalización previa a 98 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 56 ° C durante
1 minuto, y 72ºC durante 2 minutos; y extensión final de 72 ° C durante 10 min. Estas condiciones
de PCR se usaron para todos los 15 STR.

Los productos de PCR se diluyeron con 40% de tampón de colorante de carga (GE Healthcare,
Chalfont, St. Giles, Reino Unido) (100% formamida y Dextran blue al 0,05% 2000) y se cargaron
1,0 μl en gel de poliacrilamida al 20% (GE Healthcare , Chalfont, St. Giles, Reino Unido) en
condiciones desnaturalizantes (acrilamida / bis: 19/1) en tampón TBE (SigmaAldrich Co., St.
Louis, MO, EE. UU.) (Tris base 9 mM, ácido bórico 9 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se sometió a
electroforesis a 1.500 voltios, 60 mA, a 55 ° C, durante 2 h utilizando el sistema ALF Express (GE
Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido). La separación de la electroforesis y el análisis de
fragmentos con patrones de pico se analizaron utilizando ALF win Instrument Control Versión
2.00 y Allele Locator Software (GE Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido). La escalera ALF
Express Sizer 50-500 (GE Healthcare, Chalfont, St. Giles, Reino Unido) y la escalera alélica se
utilizaron como estándar para determinar el tamaño alélico de los STR.
La frecuencia alélica de la población brasileña2,7,17 se utilizó como referencia y la coincidencia
entre las muestras se calculó sobre la base de la razón de verosimilitud (LR) 6.

RESULTADOS
La cuantificación del ADN de 20 muestras de saliva dio como resultado un promedio de 58.9 ±
43.2 μg. La cantidad de ADN de las 5 muestras, denominadas "A", "B", "C", "D" y "E", depositadas
en la piel (250 μl) dio como resultado un promedio de 4,2 ± 0,9 μg. La recuperación de ADN de
la saliva depositada en la piel fue de 14 a 10 veces menor que el ADN de las muestras de saliva
(p <0,05). El ADN extraído de muestras de saliva recogidas de la piel presentó una relación A260
/ A280 de A = 1.4476; B = 1.8466; C = 2.0751; D = 2.2118 y E = 1.5737. La tipificación de ADN de
todas las muestras de saliva y control y los hisopos de piel se muestra en la Tabla 1. Los STR se
amplificaron en 4 de 5 muestras de ADN extraídas de saliva depositada en la piel.
A pesar del pequeño número de loci amplificados en las muestras de saliva recogidas de la piel,
fue posible hacer coincidir los alelos de estos loci en las 20 muestras de saliva, A con 5, B con 6,
C con 7, E con 3 o 13 o 20 Las razones de probabilidad basadas en datos de la población brasileña
fueron A 1: 500; B 1: 153.700.123; C 1: 159.140; y E 1:11.

DISCUSIÓN
Todos los perfiles de ADN se obtuvieron de las 20 muestras, que se podrían comparar con las
otras cinco muestras depositadas en la piel. Los RTS se amplificaron en 4 de las 5 muestras de
ADN extraídas de la saliva depositada en la piel, y eso probablemente esté relacionado con la
menor recuperación de ADN de la saliva depositada en la piel.
La amplificación de loci único se utilizó en esta investigación; sin embargo, la amplificación de
múltiples loci también podría haber sido utilizada. El Grupo de Trabajo Español y Portugués de
la Sociedad Internacional de Genética Forense (SPWG-ISFG), que desarrolla pautas y analiza el
programa de aseguramiento y control de calidad en genética forense, acepta la tipificación
manual o semiautomática de STR y la amplificación de loci únicos o múltiples1. En un sistema
multiplex, es probable que se amplifiquen más loci22, pero esto no se probó.
Para controlar la contaminación entre muestras de ADN, las preparamos en habitaciones
separadas, con lámparas germicidas UV que dañan cualquier ADN que quede en las superficies
expuestas. Las soluciones se autoclavaron, los reactivos se dividieron en alícuotas y se mezclaron
antes de dividirse en alícuotas; Se añadió DNA en otra habitación y se usaron controles positivos
y negativos. Este procedimiento fue muy importante para evitar falsos positivos con PCR11.
Otro aspecto relevante ocurre cuando la cantidad de evidencia disponible es mínima22, porque
la muestra de ADN puede no ser suficiente para realizar la tipificación del ADN. Sin embargo, en
el presente estudio, la cantidad de ADN de muestras depositadas en saliva fue suficiente para la
amplificación y tipado de PCR. Sin embargo, en la muestra D no se amplificaron los alelos. La
proporción A260 / A280 de ADN extraído de muestras de saliva recolectadas de la piel no puede
justificar la amplificación de loci de muestra D negativa. Quizás, los inhibidores desconocidos de
la enzima PCR podrían estar presentes en muestras de saliva26, o el ADN salival no se extrajo en
cantidad suficiente para permitir la amplificación. Tenemos que considerar que la saliva puede
tener microorganismos4 que pueden ser fuente de ADN que puede extraerse y cuantificarse. Se
demostró que la recuperación de ADN de la saliva depositada en la piel no era
proporcionalmente equivalente a la cantidad de ADN encontrada en las 20 muestras de saliva.
La deposición de saliva, la recolección de células salivales y los procedimientos de extracción de
ADN probablemente reducen la cantidad de ADN.

A pesar del pequeño número de loci amplificados en las muestras de saliva recogidas de la piel,
fue posible hacer coincidir los alelos de estos loci en las 20 muestras de saliva (A con 5, B con 6,
C con 7, E con 3 o 13 o 20). Las razones de probabilidad basadas en datos de la población
brasileña que variaron de 1:11 a 1: 159.140 sugieren que el análisis de STR en muestras de ADN
de saliva depositada en la piel puede usarse como evidencia sólida para ayudar al proceso
criminal22,26 por exclusión o inclusión de sospechosos Sin embargo, la solución de un caso
forense requiere otros estudios importantes, como la marca de mordedura física y otras
evidencias encontradas en la escena del crimen, que los investigadores deberían abordar bien.
En este estudio experimental, es importante considerar que no hay contacto entre los labios y
los dientes y la piel, como ocurre en un caso real, donde las células bucales se impregnan en la
piel, lo que puede aumentar la cantidad de células. En un caso real, hay invasión de tejido, con
la posibilidad de mezclar el ADN de la víctima y del agresor27. Cuando hay mezclas, la
contaminación puede ser reconocida durante la investigación del caso, comparando el ADN de
la víctima y el ADN del sospechoso. Sin embargo, en esta investigación, los resultados mostraron
que las muestras de ADN de la saliva depositada en la piel no se mezclaron con el ADN de control,
lo que corrobora los resultados de otro estudio previo similar 26.

CONCLUSIÓN
Nuestros resultados indican que los procedimientos estandarizados para la recolección y
extracción de ADN de la saliva depositada en la piel pueden ser muy útiles para ayudar a resolver
casos criminales, ya que se pueden obtener datos importantes mediante el análisis de ADN
salival. Por lo tanto, el análisis de la saliva depositada en la piel puede incorporarse en una
investigación criminal y tener un gran poder discriminatorio.