CIAL  
 
 
MÁSTER EN NUEVOS ALIMENTOS 
 
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE INGREDIENTES 
ALIMENTARIOS 
PRÁCTICA DE LABORATORIO  
El interés por los alimentos funcionales en la actualidad es cada vez mayor debido a su 
capacidad  de  satisfacer  las  necesidades  energéticas  y  nutricionales  básicas  del  organismo,  y 
aportar  beneficios  adicionales  a  la  salud.  Además,  existe  una  gran  tendencia  entre  los 
consumidores  dirigida  hacia  la  ingesta  de  alimentos  con  ingredientes  de  fuentes naturales  en 
oposición  a  los  obtenidos  de  forma  sintética.  Por  este  motivo,  la  práctica  se  enfoca  a  la 
OBTENCIÓN DE INGREDIENTES ALIMENTARIOS procedentes de fuentes naturales con el objetivo 
de poder utilizarlos en la elaboración de un “Nuevo Alimento”. 
 
Extracción de carotenoides de la espinaca y la caléndula  
 
CAROTENOIDES 
Los carotenoides fueron identificados por primera vez en 1907 y adquieren su nombre del 
pigmento más representativo del grupo, el β‐caroteno, descubierto por Wackenroder en 1831. 
Los carotenoides se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, se localizan en mayor 
concentración y variedad en los vegetales, aunque también se acumulan en algunas bacterias, 
algas  y  hongos.  Son  compuestos  isoprenoides  (tetraterpenos)  generalmente  de  40  carbonos. 
Tienen un grupo cromóforo es el responsable de que los carotenoides absorban energía lumínica 
en la región visible del espectro y, por tanto, de su fuerte capacidad colorante.  
Actualmente han sido aislados y caracterizados más de 600 carotenoides que, atendiendo 
a  su  composición  química,  se  pueden  dividir  en  dos  grupos:  carotenos  (menos  del  10%)  y 
xantofilas, que presentan oxígeno en su estructura, generalmente en los anillos terminales. 
Debido a su naturaleza, los carotenoides son solubles en disolventes apolares y su grado 
de solubilidad dependerá de los grupos sustituyentes de la molécula, propiedad que se utiliza 
para los procesos de extracción y purificación de los mismos. Los carotenos son muy solubles en 
éter de petróleo y hexano, mientras que las xantofilas se disuelven mejor en metanol o etanol. 
En general, los carotenoides son sensibles a la luz, oxígeno, calor, ácidos y peróxidos.  

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Figura 1. Estructuras químicas de algunos carotenoides. 
 
Los carotenoides presentan también diferentes actividades biológicas, entre las que se 
puede citar la actividad antioxidante y la capacidad de protección frente a la radiación UV y son 
los precursores de la vitamina A. Los carotenoides desempeñan en el organismo otras funciones 
importantes relacionadas con la visión y la piel, como prevenir la degeneración macular de la 
retina, disminuir el riesgo de formación de cataratas y la formación y proliferación de epitelios. 
Los carotenoides también se han relacionado, en los últimos tiempos, con una disminución del 
riesgo de padecer enfermedades degenerativas como cáncer o enfermedades cardiovasculares. 
 
ESPINACA Y CALÉNDULA 
La espinaca (Spinacia oleracea) es una planta anual, de la familia de las amarantáceas, 
subfamilia quenopodioideáceas, cultivada como verdura por sus hojas comestibles, grandes y de 
color verde muy oscuro.  
La espinaca se ha identificado desde hace décadas como fuente natural de hierro, pero 
actualmente  numerosos  estudios  están  demostrando  su  capacidad  como  anticancerígeno, 
antimicrobiano y una notable actividad antioxidante. Se ha comprobado que la ingesta de este 
alimento inhibe la aparición de ciertos tumores cancerosos, especialmente el cáncer de pulmón. 

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Estas  actividades  biológicas  se  deben  principalmente  a  una  serie  de  componentes  bioactivos 
identificados en la planta. Entre ellos se encuentran los carotenoides, entre los que destacan la 
luteína, el ‐caroteno, la violaxantina y neoxantina, los compuestos fenólicos y los flavonoides. 
La  caléndula  (Calendula  officinalis  L.)  es  una  hierba  de  la  familia  de  las  asteráceas. 
Procede del área mediterránea y se cree con toda probabilidad que es el resultado del cruce de 
otras especies del género Caléndula, quizás de Calendula arvensis, la maravilla silvestre, y alguna 
otra.  
En la composición de la caléndula también se encuentra gran cantidad de compuestos de 
interés a los que se le podrían atribuir muchas propiedades beneficiosas para la salud. Entre ellos 
se  pueden  citar:  carotenoides:  carotenos  (licopeno,  ‐,  ‐  y  ‐caroteno)  y  xantofilas  (luteína, 
flavoxantina,  auroxantina),  aceite  esencial,  flavonoides,  saponósidos  y  derivados  del  ácido 
oleanólico (calendulósidos) entre otros. 
La  flor  de  caléndula  tiene  una  acción  antiinflamatoria  y  fuertemente  cicatrizante.  Los 
extractos  de  la  flor  de  caléndula  muestran  una  acción  estimulante  de  la  epitelización  de  las 
heridas  y  una  actividad  antiinflamatoria  en  edemas  donde  interviene  la  prostaglandina  (los 
triterpenos,  sobre  todo  el  faradiol,  han  demostrado  ser  los  principios  antiinflamatorios  más 
importantes). Sin embargo, también se considera la planta una fuente de carotenoides, por lo 
que podría ofrecer una actividad antioxidante de notable interés. 
 
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 
1. Materia prima 
Como  fuentes  de  carotenoides  se  van  a  estudiar  la  espinaca  (Spinacia  oleracea)  en  hojas 
deshidratadas  y  una  mezcla  de  pétalos  y  tallos  deshidratados  de  la  caléndula  (Caléndula 
officinalis L.). Ambas plantas están molidas y tamizadas a tamaño de partícula < 500 μm. 
 
2. Procedimiento de extracción 
Se realizarán diferentes extracciones como se describe en la tabla:  

Técnica  disolvente  Técnica  disolvente 

   
PAREJA 1  SL  ETANOL  PAREJA 5  SL  ETANOL 
PAREJA 2  SL  HEXANO  PAREJA 6  SL  HEXANO 
PAREJA 3  UAE  ETANOL  PAREJA 7  UAE  ETANOL 
PAREJA 4  UAE  HEXANO  PAREJA 8  UAE  HEXANO 

 
Cada pareja realizará una extracción con diferente metodología y diferente disolvente, etanol o 
hexano: 
‐ extracción sólido/líquido (SL) 
‐ extracción sólido/líquido asistida con sonda de ultrasonidos (UAE)  
Para todas las extracciones:  
‐ Se pesan 5 g de la matriz sólida en un erlenmeyer de cristal y se añaden 50 ml de disolvente. 

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‐  Las  extracciones  SL  se  realizan  manteniendo  la  muestra  en  agitación  en  placa  durante  20 
minutos. Deberán estar tapadas para evitar la degradación de los compuestos por la luz (papel 
aluminio). 
‐ En las extracciones UAE se mantendrá la muestra sumergida en el baño de US durante 10 min. 
‐ Transcurrido el tiempo, la muestra se filtra con un FILTRO DE PLIEGUES sobre un embudo en un 
balón  de  100  mL  previamente  tarado  en  la  balanza  de  precisión  y  se  lleva  a  sequedad  en  el 
rotavapor a vacío. 
‐  Una  vez  que  este  seco,  se  vuelve  a  pesar  para  calcular  el  peso  del  extracto  obtenido  y  el 
rendimiento total de la extracción. 
 

Peso del extracto:  ___________mg 
Rendimiento de la extracción: _______% 
 

 El  sólido  obtenido  se  utilizará  para  la  determinación  de  carotenoides  totales  y  para  la 
saponificación de los extractos (NO TIRAR) 
 
El extracto seco se redisuelve en 10 ml de etanol procurando disolver todo lo que se encuentra 
en  las  paredes  del  matraz  utilizando  el  baño  de  ultrasonidos.  A  esta  disolución  se  la  llama 
EXTRACTO1.  
Se guarda en un vial con tapón 1 ml del EXTRACTO1 para determinar los carotenoides totales y 
para la práctica 3 de OCIA. 
 
Se calcula la concentración del EXTRACTO 1. 
CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO1____________(mg/mL) 
 
3. Método de Saponificación de los Extractos 
La saponificación de los extractos se realiza con dos objetivos: 
‐  Eliminar  las  interferencias  que  producen  las  clorofilas  en  las  determinaciones 
espectrofotométricas (sobre todo en la espinaca) e,  
‐  Hidrolizar  los  ésteres  de  carotenoides,  liberando  estos  compuestos  para  su  completa 
cuantificación (espinaca y caléndula) 
 
Procedimiento de saponificación de los extractos de espinaca y caléndula: 
‐ Al EXTRACTO1 se le añaden 5 ml de etanol 
‐ Se añade 4 mL de KOH al 40% en EtOH:H2O (50:50).  
‐ Se mantiene tapado, en agitación magnética, temperatura 40°C (controlar en la placa agitadora) 
y en oscuridad (tapado con papel aluminio) durante 30 minutos.  
(DURANTE ESTE TIEMPO DE ESPERA COMENZAR PUNTO 4) 
‐ en un tubo falcon de 50 ml se vuelca la muestra y se adicionan 10 mL de H2O.  
‐ Se agita fuertemente. 
‐ Se adicionan 10 ml de hexano y se agita. (Precaución: el hexano puede deshacer el tubo, hacedlo 
con cierta rapidez) 
‐ Se centrifuga la muestra a 3000 rpm durante 5 min.  
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‐ Se separa la fase orgánica en un vaso de precipitado tapado con papel aluminio. 
‐ Se vuelca la fase acuosa en otro tubo falcon y se repite el lavado con hexano y la centrifugación. 
‐  Se  unen  las  fases  orgánicas  y  se  añade  una  espátula  de  Na2SO4  anhidro  para  eliminar  la 
humedad. 
‐ Toda la fase orgánica se vuelca en un matraz de rotavapor (previamente tarado en balanza 
analítica) a través de un embudo con papel de filtro para que no caiga el Na2SO4.  
‐ Se elimina el disolvente en un rotavapor y se pesa el extracto seco saponificado. 
‐ El extracto seco se redisuelve en 5 ml de etanol procurando disolver todo lo que se encuentra 
en  las  paredes  del  matraz  utilizando  el  baño  de  ultrasonidos.  A  este  extracto  se  le  llama 
EXTRACTO2.  
EL  EXTRACTO2  SE  VA  A  UTILIZAR  EN  LA  PRACTICA  DE  EFIB.  NO  TIRAR.  NO  DESPERDICIAR. 
CONTROLAR LA CONCENTRACIÓN 
 
Peso del extracto seco saponificado:  ___________mg 
Rendimiento de la saponificación: _______% 
Concentración del EXTRACTO2:_______mg/ml 
 
4. Recta de calibrado de β‐caroteno 
 La cuantificación de los carotenoides totales de una muestra se obtiene por extrapolación con 
una recta de calibrado de β‐caroteno.  
Las diferentes concentraciones de la recta patrón se obtienen a partir de una disolución inicial de 
‐caroteno (10 g/mL) en cloroformo:etanol (1:1) preparada en el laboratorio. Hacer al menos 5 
puntos en un rango de la recta de 0 a 10 g/mL en tubos de ensayo de cristal pequeños. Utilizar 
cloroformo:etanol (1:1) para las diluciones. 
Se mide la absorbancia de las diluciones en un espectrofotómetro a 450 nm en los mismos tubos 
de ensayo. Se ajusta el blanco (cero) con el disolvente. La absorbancia de los diferentes puntos 
de la recta patrón debe ser inferior a 1 (si es mayor hay que diluir). 
Se representa la Absorbancia frente a la concentración de β‐caroteno y se obtiene la recta de 
calibrado. 
 
5. Determinación de carotenoides totales de los extractos de caléndula y espinaca (EXTRACTO1 
Y EXTRACTO2) 
Para la determinación de los carotenoides totales en el EXTRACTO1 y en el EXTRACTO2 se medirá 
la absorbancia de la muestra a 450 nm y se extrapolará con la recta de calibrado del ‐caroteno.  
En ambos casos se tomará una alícuota (200 l) y se mezclará con 2000 l de cloroformo:etanol 
(1:1).  Si  la  absorbancia  fuese  mayor  que  1  se  diluirá  la  muestra  hasta  que  la  absorbancia  sea 
inferior a 1. Será necesario conocer la concentración de la muestra en la que se ha medido la 
absorbancia, por lo tanto, apuntad las diluciones. Los resultados de la muestra se van a expresan 
como si todos los carotenoides fuesen β‐caroteno, de forma que el resultado se expresaría como: 
 
Contenido en carotenoides = g equivalentes de ‐caroteno/ g de extracto. 

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