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Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco
cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los
casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la cocción completa de la carne
Invasiva
- - - +
Intiminas
- + + -
Enterohemolisina - - + -
FUNDAMENTO
MATERIAL Y EQUIPO
• Mechero, a,b,c,d,e.
• Propipetaa.
• Gradillaa,b,c,e.
• Balanza granatariaa.
• Stomachera
• Bolsas para stomacher .
• Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
• Lentes de seguridadc
• Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.
• Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.
• Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d
• Asa bacteriológicab,c,d,e
• Portaobjetosd
• Microscopio ópticod
• Termómetro calibradob
• Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b
• Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.
• Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
• Autoclavea
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
37°C
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37°C 44.5°C
24 – 48 h
24 – 48 h
1.0 mL 1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilución en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1 10-2 10-3
35°C
24 - 48 h
35°C 44.5°C
24 - 48 h 24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en
Caldo Lactosa verde tablas. NMP de coliformes Caldo EC o EC-MUG tablas. NMP de coliformes
brillante bilis 2% totales
Versión para/g de muestra
Administrador de Manuales y Documentos
9 fecales /g de muestra.
(AMyD). Facultad de Química, UNAM
Siembra de tubos positivos en
agar Mac Conkey para
búsqueda de Escherichia coli
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
• Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
• Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
• Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
• Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
• El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono,
también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil-β
β -D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
• A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de
gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de
confirmación EC-MUG.
• Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de
gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
• Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
• Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
2. Alimentos
• Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de
trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 ° C.
• Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
• Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
• Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Control de calidad
• Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
• Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales
biliares.
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
BIBLIOGRAFÍA
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL