Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

UNIVERSIDAD NACIONAL
AGRARIA LA MOLINA

INFORME N°3
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS

Práctica 2
Tinción diferencial ácido resistente

CURSO: Laboratorio de Microbiología

PROFESORA: Yvette Ludeña
GRUPO: C*
HORARIO: miércoles de 11:00 a.m. – 01:00 p.m.
INTEGRANTES:

 Bustamante Vásquez, Leonela - 20150091

 Osorio Díaz, Julissa Daniela - 20150358
 Rivadeneira Espinoza Angela - 20100389
 López Trujillo Jheffrzon Josbet - 20140414

LIMA-PERÚ
2018-II
INTRODUCCION:

El presente ensayo de tinción con ácido resistente pretende reconocer estructuras

resistentes como las endosporas bacterianas; para ello se utilizó las técnicas de Dorner
y Schaeffer & Fulton.
En la primera técnica se empleó carbolfucsina para teñir la espora y nigrosina como
agente decolorante; la espora se tiñe de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la
estructura aparece sobre un fondo oscuro. La técnica de Schaeffer y Fulton emplea
carbolfucsina para teñir la espora, alcohol acido como decolorante y verde de malequita
como colorante de contraste, la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde.
Las observaciones con el agente coadyuvante se dan para las especies del género
Bacillus y Clostridium que han formado esporas bajo condiciones ambientales difíciles
como la falta de nutrientes.

OBJETIVOS:

- Observar las esporas y diferenciarlas del cuerpo vegetativo correspondiente.

- Aplicar correctamente los métodos de Writz; Dorner; Schaeffer y Fulton.

MATERIALES Y METODOS

 Técnica de Dörner
Para hacer el procedimiento, en un tubo pequeño con unas cuantas gotas de
agua destilada se hechó una muestra concentrada del organismo (Bacillus sp.)
con la ayuda de un asa de kolle esterilizada, seguidamente se añadió
carbolfucsina y luego se llevó a baño María por 10 minutos, luego del baño se
transfirió una gota de la muestra a una placa porta objetos seguidamente
agregando nigrosina, luego extendió con la ayuda de otra lamina hasta obtener
una delgada película y secándolo suavemente con la ayuda del mechero,
finalmenete se llevó la lámina para la observación en el microscopio con la ayuda
del aceite de inmersión.
  Técnica de Schaeffer y Fulton

Para continuar con la segunda técnica se preparó una muestra fija del
microorganismo proporcionado con la ayuda del aza de kolle esterilizado, luego
se agregó carbolfucsina hasta cubrirla totalmente, continuando con la técnica
con ayuda de una pinza se calentó la lámina con el colorante haciéndolo pasar
ligeramente por la llama del mechero hasta que solo se pudo observar
desprendimiento de vapores evitando el secado del colorante, luego lavando la
lámina con alcohol ácido hasta que volverla incoloro y seguidamente se enjuagó
con agua, y seguidamente se cubrió con unas gotas de verde malaquita por un
par de minutos y luego se enjuagó con agua, secando la lámina al aire libre, y
finalmente llevando la lámina para la observación al microscopio.

Procedimiento de la tinción Schaeffer y Fulton

RESULTADOS

Vistas en grado de aumento de: GA: 1000X

Tecnica de Dorner en inmersión

Tecnica de Schaeffer & Fulton en inmersión

Tecnica de Schaeffer & Fulton Alternativo en inmersion

 OBSERVACION:

Se observa las capsulas de la

bacteria BACILLUS a través de un
brillo rosa-rojo que comprende a la
espora correspondiente. La
nigrosina por ser un colorante
aniónico de color negro es repelido
por las cápsulas de la bacteria, por
lo que imposibilita su penetración
dentro de los microorganismos.

OBSERVACION:

Se puede observar buena cantidad de tinte

Verde lo que corresponde a la parte vegetati-

Va de la bacteria. Cada bacillus esta compren-

dido por dos extremos de color verde y uno

Central de color rojo que corresponde a la

espora.

OBSERVACION:

Se observó la tinción con

Schaeffer & Fulton alternativa;
visualizándose la forma de bacillus
pintados en sus dos extremos de
color rojo (parte vegetativa) y su
centro de color verde
(correspondiente a la espora)
CONCLUSIONES:

Se distinguió las endosporas bacterianas del cuerpo vegetativo del bacillus sp.
Mediante dos técnicas, la primera la técnica de DORNER, en la cual se observó las
endosporas de un color brillante debido a que la nigrosina no pudo teñirla y la
técnica de SHAEFFER Y FULTON, en donde la endospora se encontraba teñida de
color verde debido a la adhesión térmica del verde malaquita y el cuerpo vegetativo
de color rosa, gracias a la safranina.

CUESTIONARIO

1. Cual de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas

bacterianas ¿ A que atribuye la diferencia?

Se pudo observar mejor con el método de Schaeffer y Fulton, debido a que

este emplea una mayor cantidad de sustancias adicionales como el verde de
malequita que actua como contrastante; dándole una mejor visualización

2. ¿Qué efecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante

como el alcohol cetona?
Si reemplazamos el alcohol ácido por el alcohol cetona no encontraríamos el
mismo efecto de decoloración, ya que la estructura de la pared del
mycobacterium es más compleja, presenta una pared celular más gruesa que la
de muchas otras bacterias, es hidrofóbica, cerosa, y rica en ácidos
micólicos/micolatos. Mientras que el alcohol cetona decolora generalmente a
bacterias Gram negativas cuya pared celular es más delgada y de fácil
decoloración.

4. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las usadas en

este ejercicio.

 Tinción de Wirtz-Conklin
Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen
en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora
por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa
se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina
generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante
años.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La
tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas,
tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las
formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

 Tinción de Möeller

Las esporas permiten a las bacterias pasar a un estado latente en condiciones

ambientales adversas. Su principal componente es Ca2+ fijado a ácido dipicolínico.

El calor después de la tinción con carbol-fuscina con permite que rompa la estructura
que protege la espora para que así pueda penetrar el colorante.

Con el lavado de agua se retira todo tinte que se adhirió a la bacteria, para después
teñirse con azul de metileno.

Resalta de color rojo la espora y de color azul, la bacteria.

Bibliografía
Martín., C. V. (2010). Técnicas básicas de Microbiología. Reduca (Biología)., 24.

Nacional, I. P. (2017). MICROBIOLOGÍA GENERAL.