Concepto básico

El concepto de imagen confocal fue patentado por Marvin Minsky en 1957.2

En un microscopio de fluorescencia convencional (p.ej., de campo amplio),

el especimen entero está sobresaturado de luz a partir de la fuente de
iluminación. Debido a la conservación de la intensidad de la luz en su
recorrido, todas las partes del especimen a lo largo de su ruta óptica serán
excitadas y la fluorescencia detectada por un fotodetector o una cámara.

El microscopio de fluorescencia Olympus BX61, acoplado con una cámara

digital.El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz
ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud
de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida
por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con
mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben
colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para
detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con
fluorocromos.

Por el contrario, un microscopio confocal utiliza iluminación puntual y un

"pinhole" en un plano óptico conjugado en frente del detector para eliminar
la información que está fuera del plano focal. Sólo la luz que está dentro
de este plano puede ser detectada, de modo que la calidad de
imagen es mucho mejor que las de campo amplio. Puesto que sólo se
ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal, se requiere una
exploración (scanning) sobre un raster regular

representa una rejilla rectangular de píxeles o puntos de color, denominada raster, que
se puede visualizar en un monitor de ordenador, papel u otro dispositivo de
representación.

en el espécimen para obtener imágenes bi o tridimensionales.

Existen tres tipos de microscopios confocales disponibles comercialmente:

El Microscopio confocal láser de barrido, el microscopio confocal de disco
giratorio (disco de Nipkow) y microscopios de matriz programable,
(Programmable Array Microscope, PAM).
La microscopía confocal de barrido por láser produce un mayor
rendimiento en la calidad de la imagen que los de disco o PAM, pero la
tasa de frames era muy lenta (menos de tres frames/segundo) hasta hace
poco.

Los microscopios de disco pueden lograr velocidades compatibles con la

creación de videos —un rasgo desable para observaciones dinámicas, como
pueden ser las imágenes de células vivas.

La microscopía confocal láser de barrido actualmente ha sido mejorada para

obtener tasas superiores a las del video (60 frames/segundo) utilizando
espejos de barrido.

β-tubulina en Tetrachimena, (un protozoo ciliado).

El nombre tubulina se refiere una familia de proteínas globulares

Reflection data for 1-Euro coin.

Los vectores de clonación

son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan
insertados. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con
el fragmento de ADN que transporta.

También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del
fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se

mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores

recombinantes.

Tipos de vectores

Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula

huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el
número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen,
entre otras.

Plásmidos

Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son
ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena
extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican
autónomamente dentro de las células bacterianas.

pUC18

Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy
beneficiosas:

- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente

grandes (de unos 10.000 pares de bases).

- Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de
ADN insertado por célula.

- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para

enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o sitio
de clonación múltiple.

- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un

fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un
fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color
blanco.
Bacteriófago lambda

El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser

utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN
foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas.

Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una
enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de
ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes
se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células
huesped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas
copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la
clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb
( kilobases).

Cósmidos

Los cósmidos son vectores hibridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de
plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento
del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias
plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los
cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.

YAC

Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus
extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a
genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar
ADN exógeno.

Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de

100 a 1000 kb.

BAC

Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad

( factor F ) de bacterias.

El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere

información genética durante la conjugación bacteriana.

Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.