Guía validación métodos analíticos

GUÍA DE VALIDACIÓ
DE MÉTODOS A ALÍTICOS
EDITADA POR EL COLEGIO NACIONAL DE QUÍMICOS FARMACÉUTICOS BIÓLOGOS MÉXICO, A. C.
OBJETIVO:
Establecer los lineamientos generales mínimos necesarios para llevar a cabo el proceso de
validación de métodos analíticos.
JUSTIFICACIÓ :
Un método analítico es la descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y

parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente
específico(analito) de una muestra.
La validación es el proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la
capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada; esta actividad
se justifica por los siguientes aspectos:
• Moral y Ética,
• Aseguramiento de calidad,
• Económica, y
• Regulatoria.
DEFI ICIO ES:
• Adecuabilidad del sistema.-Verificación de que el sistema opera con base a criterios que
permitan asegurar la confiabilidad de los resultados de un método analítico.
• Analito.-Componente específico de una muestra a medir.
• Calibración.-Conjunto de operaciones que determinan la relación entre los valores
indicados por un instrumento de medición y los valores conocidos correspondientes a
un patrón de referencia.
• Documentación.-Conjunto de información que sustenta una actividad realizada.
• Especificaciones.-Descripción del material que incluye la definición de sus propiedades
y características, con las tolerancias de variación de los parámetros de calidad.
• Especificidad.-Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida
únicamente al analito de interés.
• Estudio colaborativo.-Reproducibilidad realizada en distintos laboratorios, por
diferentes químicos.
• Exactitud.-Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor de
referencia.
• Estabilidad analítica de la muestra.-Propiedad de una muestra preparada, de conservar
su integridad fisicoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse por
un tiempo y condiciones determinadas.
• Intervalo.-Concentraciones incluidas entre la concentración superior e inferior del
analito (incluyendo éstas), para las cuales se ha demostrado que el método es preciso,
exacto y lineal.
• Límite de cuantificación.-Concentración mínima del analito que se puede determinar
con precisión y exactitud aceptables.
• Límite de detección.-Concentración mínima del analito que puede ser detectada, pero no
necesariamente cuantificada.
• Linealidad.-Habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por
una transformación matemática, son proporcionales a la concentración del analito.
• Metodología de prueba.-Procedimiento para determinar si un producto o materia prima
cumple con las especificaciones establecidas.
• Método analítico.-descripción de la secuencia de actividades, materiales y parámetros
que se deben cumplir para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la
muestra.
• Método analítico desarrollado internamente.-Método desarrollado por el propio
laboratorio.
• Método analítico indicativo de estabilidad.-Método cuantitativo capaz de detectar
variaciones en las propiedades del material evaluado, debido a las condiciones de
almacenaje.
• Método analítico oficial.-Método que aparece en la literatura oficial reconocida.
• Método analítico no oficial.-Método que no aparece en la literatura oficial reconocida.
• Muestra.-Porción del material a evaluar.
• Muestra analítica.-Porción del material a evaluar de acuerdo al método analítico.
• Muestra adicionada.-Porción representativa del material a evaluar, a la que se le
adicionan cantidades conocidas del analito.
• Parámetros de desempeño.-Parámetro específico a estudiar en un protocolo de
validación.
• Placebo analítico.-Muestra que contiene todos los componentes de un producto a
excepción del analito.
• Placebo adicionado.-Muestra e un placebo analítico al cual se le adiciona una cantidad
conocida del analito.
• Precisión.-Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el
procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra
homogénea.
• Precisión intermedia.-Precisión de un método analítico, expresada como la
concordancia relativa obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un
mismo laboratorio, por diferentes analistas, en distintos días.
• Proporcionalidad.-Relación establecida por una ecuación matemática entre los
resultados obtenidos por dos métodos analíticos.
• Protocolo de validación,.Descripción de pruebas específicas para demostrar que un
proceso da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera
consistente.
• Recobro.-Cantidad del analito determinada en el placebo adicionado, empleando el
método analítico.
• Repetibilidad.-Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia
obtenida entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando
los mismos instrumentos y métodos.
• Reproducibilidad.-.Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia
entre determinaciones independientes realizadas por diferentes laboratorios.
• Revalidación.-comprobación de que el método analítico mantiene su desempeño cuando
existen cambios en la composición del producto, en el método analítico.
• Robustez.-Capacidad del método analítico de mantener su desempeño al presentarse
variaciones pequeñas pero deliberadas, en los parámetros normales de operación del
método.
• Sustancia de referencia.-Sustancia de uniformidad reconocida destinada a utilizarse en
comprobaciones analíticas físicas, químicas o microbiológicas en el transcurso de las
cuales se comparan con la sustancia en evaluación.
• Sustancia de referencia primaria.-Sustancia que es designada por tener la más alta
calidad microbiológica, cuyas propiedades se aceptan sin referencia a otras sustancias.
• Sustancia de referencia secundaria.-Sustancia cuyas propiedades se asignan por
comparación con una sustancia de referencia primaria, o bien, cuando es certificada
mediante un procedimiento científicamente reconocido.
• Tolerancia.-Reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos por el análisis de la
misma muestra bajo diferentes condiciones normales de operación. La robustez y la
tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la influencia de
factores internos del método, mientras que la tolerancia se refiere a factores externos del
método.
• Validación del método analítico.-Proceso por el cual se demuestra, por estudios de
laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación
analítica deseada.
CLASIFICACIÓ DE MÉTODOS A ALÍTICOS:
Los métodos se clasifican bajo los siguientes criterios:

• En función de su estado regulatorio:
a) Métodos farmacopeicos
b) Métodos no farmacopeicos
• En función de su aplicación (-OM-059-SSA1 y -OM-073-SSA1):
a) Métodos para producto a granel,
b) Métodos para producto terminado,
c) Métodos para muestra primaria, y
d) Métodos indicadores de estabilidad.
• En función de la naturaleza de la respuesta analítica:
a) Métodos físico-químicos.- cuando la respuesta es de carácter físico
(absorción de luz, emisión de luz, voltaje, etc.) o químico(consumo de
iones –OH, consumo de un acomplejante, etc.)
b) Métodos biológicos.- cuando la respuesta es de carácter biológico
(crecimiento de microorganismos, protección, muerte, etc.)
• En función de su propósito analítico:
a) Métodos para cuantificar el analito(contenido o potencia)
b) Métodos para establecer la presencia del analito a un limite.
c) Métodos para identificar el analito.
Esta clasificación se utiliza para establecer los parámetros de desempeño a estudiar en la
validación del método analítico.
Cualquier método analítico puede estar constituido por técnicas de separación, extracción, etc.
, y por técnicas de medición (espectrofotometría, volumetría, colorimetría, potenciometría,
etc.) que permiten medir la respuesta del analito en la muestra. A esta técnica se le denomina
Sistema de Medición.
• En función de la naturaleza del sistema de medición:
a) Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta
analítica, permite medir una señal de ruido (cromatógrafo de
líquidos y de gases, espectrofotómetros, etc.)
b) Métodos en los cuales el instrumento de medición no permite medir
una señal de ruido (buretas, medidor de halos, potenciómetros, etc.)
PARÁMETROS DE DESEMPEÑO:
En función de la aplicación analítica de un método, se indican los parámetros de desempeño a

estudiar.
PRUEBAS DE IMPUREZAS
PARÁMETRO DE CO TE IDO/ CO TE IDO/ LIMITE IDE TIFICACIÓ
DESEMPEÑO POTE CIA / VALORACIÓ
VALORACIÓ
PRECISIÓN/ ADECUABILIDAD SÍ SÍ SÍ *
DEL SISTEMA
LINEALIDAD DEL SISTEMA SÍ SÍ NO NO
ESPECIFICIDAD2 SÍ SÍ SÍ SÍ
EXACTITUD Y REPETIBILIDAD SÍ SÍ NO NO
LINEALIDAD DEL MÉTODO SÍ SÍ NO NO
PRESICIÓN DEL MÉTODO O SÍ SÍ NO NO
PRECISIÓN INTERMEDIA2
ESTABILIDAD ANALÍTICA2 * * NO NO
DE LA MUESTRA
LIMITE DE DETECCION NO NO SÍ NO
LIMITE DE CUANTIFICACION NO SÍ NO NO
ROBUSTEZ * * * NO
TOLERANCIA * * * NO
*Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza del método.

1. La falta de especificidad de un método analítico, puede ser compensada por otra
alternativa analítica de soporte, como por ejemplo cromatografía de capa fina.
2. También es definido como un estudio de tolerancia.
3. Un método que es exacto y lineal, por definición es específico al placebo analítico o a los
otros componentes de la muestra.
DETERMI ACIO ES, METODOLOGÍA Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓ :
• Precisión del Sistema:

♣Metodología.- Preparar por lo menos un sextuplicado de soluciones a la
concentración del analito que represente la concentración de la solución de
referencia utilizada o en ciertos casos, la concentración que represente el 100%
de la muestra procesada para su medición; preparadas por dilución o por pesadas
independientes. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones.
Calcular S y CV de la respuesta analítica;
♣Criterios de aceptación:
CV ≤ 1.5% para métodos físico-químicos
CV ≤ 3% para métodos biológicos
Valores superiores u otro criterio de aceptación deben ser justificados.
Las formulas y el procedimiento se encuentra en el anexo 1.
• Adecuabilidad del sistema (Métodos cromatográficos):

♣Metodología.- Inyectar por quintuplicado la solución de adecuabilidad,
reportar la respuesta del analito, calcular el CV y para cada inyección:
Factor capacidad (K’), resolución (si procede, R), retención relativa (si procede,
Rr), factor de coleo (T), número de platos teóricos (N).
CV ≤ 2% para respuesta analítica.

Valores superiores deben ser justificados.
Para cada inyección, se recomienda:

K’>2 ; R>2 ; T<2
Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 2.
La evaluación de adecuabilidad del sistema permite verificar que el sistema de

medición funcione adecuadamente, independiente de las condiciones
ambientales.
Antes de la validación del método analítico deben establecerse los criterios para
la operación del sistema para ser evaluados en la validación y verificados de
manera rutinaria al emplear el método analítico. Por ejemplo en el caso de
método volumétricos, el volumen de la titulación de blancos y/o de un volumen
específico de la solución de referencia; en el caso de métodos fotométricos la
lectura de soluciones blanco.
• Linealidad del sistema:

♣Metodología.- Preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentración
(intervalo) de la solución de referencia ya sea por dilución o por pesadas
independientes. La concentración central debe ser igual a la que se prepara la
solución de referencia en el método o la que represente el 100% en la muestra
procesada para su medición.
Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones de medición, reportar la
relación concentración vs respuesta analítica.
Calcular b1, b0, r2, IC(β1).
El intervalo esta en función del propósito del método y se expresa como % de la
concentración de la solución de referencia o en función del contenido del analito
en la muestra.
Para contenido/potencia/valoración se sugiere un mínimo de ±20%
Para contenido/valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un 20%

por arriba de la especificación.
Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120%
Es critico que el intervalo no excluya valores de concentración que

potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra.
r2 ≥ 0.98
IC(β1), no debe incluir el cero
Otro criterio de aceptación debe ser justificado.

Es conveniente trazar la gráfica de la concentración (x) vs la respuesta analítica

(y), incluyendo en ella la ecuación, línea de ajuste y el coeficiente de
determinación.
• Especificidad:
♣Metodología.- Establecer las posibles sustancias interferentes y adicionar
cantidades conocidas de éstas, solas o combinadas a la muestra y evaluar su
respuesta bajo las mismas condiciones de análisis.
En métodos de identificación seleccionar sustancias que potencialmente

interfieran en la determinación con base en la estructura del analito.
Para métodos de contenido/ potencia/ valoración, se analizan placebos del

producto y cuando proceda sustancias relacionadas, precursores, homólogos y
una mezcla de ellos con el producto.
Para métodos de contenido/ valoración de impurezas, se adicionan éstas al

analito en niveles que incluya la especificación. Cuando no se dispone de las
impurezas, el analito se somete a condiciones que generen su inestabilidad
química y aplicar el método.
Para métodos de límite de impurezas se analizaran las muestras de impurezas

individualmente, el producto y la mezcla de éstos.
Para métodos indicadores de inestabilidad, si se cuenta con los productos de

degradación, preparar muestras con placebos adicionado de éstos, el placebo
adicionado de analito, el placebo adicionado de analito y productos de
degradación y se analizan con el método.
Si no se cuenta con los productos de degradación se puede favorecer la
inestabilidad del analito en la muestra:
1) Someter el analito, el placebo y la muestra a temperaturas de 20°C por debajo

del punto de fusión del analito de 2 a 4 semanas.
2) Exponer el analito, placebo y muestra a luz UV, fluorescente y/o humedad
relativa.
3) Hacer soluciones del analito, ajustando el pH de 1 a 2 y/o de 10 a 12 y
someterlas a 60°C – 80°C.
4) Adicionar peróxido de hidrógeno para favorecer la oxidación del analito.
El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a

niveles del 15 al 30%. Estos estudios no se realizan en analitos con propiedades
reactivas.
Para métodos no selectivos, la especificidad se sustenta con los resultados de

exactitud y linealidad, si el método cumple con los criterios de aceptación.
La respuesta del método solo se deberá al analito.
• Exactitud y Repetibilidad del método:

♣Metodología:
A)Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico.

A la cantidad de placebo analito equivalente a una muestra analítica por
sextuplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de
este en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e inferior de la cantidad por
sextuplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de
este en la muestra. El mismo analista analizara los placebos adicionados
utilizando de referencia la sustancia empleada en la adición al placebo analítico
en las mismas condiciones. Determinar la cantidad recuperada del analito.
B)Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina

el contenido del analito y se preparan 6 muestras adicionadas del analito hasta
completar el 100% de éste en la muestra. Las muestras adicionadas se analizan
usando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
La adición del analito debe ser en las primeras etapas del método.
Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo analítico, al obtener el

cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada
en porcentaje.
Calcular ŷ, S, CV e IC(µ) del porcentaje de recobro.
IC(µ) debe incluir el 100% o que el promedio aritmético del % de

recobro se incluya en el intervalo:
98-102% método cromatográfico
98-102% método volumétrico
97-103% método químico o espectrofotométrico
95-105% método microbiológico
CV del porcentaje de recobro:
No mayor de 2% en método cromatográfico
No mayor de 2% en método volumétrico
No mayor de 3% en método químico o espectrofotométrico
No mayor de 5% en método microbiológico
No mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la
especificación del analito en la muestra.
• Linealidad del método:
♣Metodología:
A) Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico.

A la cantidad de placebo analito equivalente a una muestra analítica por
triplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de este
en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e inferior de la cantidad del
analito (intervalo) y preparar el placebo adicionado por triplicado a cada nivel
manteniendo constante la cantidad de placebo analítico en los tres niveles. El
mismo analista analizara los placebos adicionados utilizando de referencia la
sustancia empleada en la adición al placebo analítico en las mismas condiciones.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
B) Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina

el contenido del analito y se preparan 3 muestras adicionadas del analito hasta
completar el 100% de éste en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e
inferior de la cantidad del analito (intervalo) y preparar la muestra adicionada
por triplicado a cada nivel manteniendo constante la cantidad de muestra en los
tres niveles Las muestras adicionadas se analizan usando como referencia la
sustancia empleada en la adición de la muestra. Determinar la cantidad
recuperada del analito.
La adición del analito debe ser en las primeras etapas del método.
El intervalo de la concentración del analito adicionado depende del propósito del

método y debe incluir la especificación. La siguiente tabla sugiere intervalos
para el estudio de linealidad, en la cual la especificación se maneja como
porcentaje, por ejemplo el 100% puede representar 100mg/g de muestra, 10ppm,
5mg/ml, etc.
PROPÓSITO ESPECIFICACIÓ I TERVALO MÍ IMO

CONTENIDO/ POTENCIA/ LÍMITE INFERIOR (LI) LI –10% A LS +10%
VALORACIÓN LIMITE SUPERIOR (LS)
EJEMPLO
80% a 120%
VALORACIÓN 90% - 110% Por lo tanto los niveles podrían
Ser 80%, 100% y 120%
60% a 140%
UNIFORMIDAD DE DOSIS 75% - 125% Por lo tanto los niveles podrían
Ser 60%, 100% y 140%
Q = 75% 40% a 130%

DISOLUCIÓN En el caso conservador de llegar Por lo tanto
a los niveles podrían
tercera etapa, ninguna unidad es menor
Ser 40%,
a 100% y 130%
Q –25%
CONTENIDO/ VALORACIÓN
PARA PRUEBAS DE LIMITE SUPERIOR (LS) LS – 20% a LS +20%
IMPUREZAS
EJEMPLO
80% a 120%
Sustancias Relacionadas No debe contener más de 100% Por lo tanto los niveles podrían
Ser 80%, 100% y 120%
Reportar la relación cantidad adicionada vs cantidad recuperada. Utilizar el
método de estimación por mínimos cuadrados y calcular b1, b0, r2, IC(β1), IC(β0)
y CVy/x.
Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo o muestra adicionada al
obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada
expresada en porcentaje. Calcular ŷ, S, CV, IC(µ) del porcentaje de recobro.
1) Cantidad adicionada vs cantidad recuperada:
r2 > 0.98
El IC(β1) debe incluir la unidad
El IC(β0) debe incluir el cero
El CVy/x del porcentaje de recobro:
No mayor de 2% en método es cromatográfico
No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación
del analito en la muestra.
2) Porcentaje de recobro:
El IC(µ) debe incluir el 100% o el promedio aritmético del % de recobro

se incluya en el intervalo:
98-102% método cromatográfico
98-102% método volumétrico
97-103% método químico o espectrofotométrico
95-105% método microbiológico
CV del porcentaje de recobro:
No mayor de 2% en método cromatográfico
No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación
del analito en la muestra.
Otro criterio de aceptación debe ser justificado.
Es conveniente trazar la gráfica de la cantidad adicionada (x) vs la cantidad

recuperada (y), incluyendo en ella la ecuación, línea de ajuste y el coeficiente de
determinación.
• Precisión del Método (Precisión Intermedia o Tolerancia interdía / analista):

♣Metodología.- Analizar por triplicado una muestra homogénea del producto
que tenga un nivel cercano o igual al 100% (para contenido/potencia/valoración)
o una muestra cuyo contenido este incluido en el intervalo lineal de
concentración de linealidad de método (para impurezas) en dos días diferentes y
por dos analistas diferentes. Reportar el contenido/potencia/valoración del
analito de todas las muestras.
Calcular ŷ, S, CV del contenido/potencia/valoración, utilizando todos los

resultados obtenidos.
CV ≤ 2% para métodos cromatográficos y volumétricos
CV ≤ 3% para métodos químicos o espectrofotométricos
No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del
analito en la muestra.
Valores superiores deben ser justificados.
Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos

apropiados que permitan sustentar que la precisión del método es aceptable.
Puede ser utilizado un modelo estadístico lineal de diseño experimental ya que
es de utilidad cuando se quiere determinar el grado de tolerancia del método a
fuentes de variación como estimar la variabilidad entre analistas o entre días.
• Estabilidad Analítica de la Muestra:

♣Metodología.- Establecer la etapa de análisis en la cual se desea evaluar la
estabilidad, determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras
dependientes) o no (muestras independientes) y las condiciones de almacenaje.
En muestras dependientes, determinar la estabilidad analítica procesando hasta la

etapa preestablecida por triplicado una muestra homogénea, fraccionar cada
preparación de acuerdo a las condiciones de almacenaje de interés. Terminar el
análisis de una de las fracciones de cada preparación
(contenido/potencia/valoración), seguir el análisis de cada una de las fracciones
al término de cada condición de almacenaje utilizando una solución de
referencia recientemente preparada. Reportar el contenido/potencia/valoración
de cada fracción.
En muestras independientes, determinar la estabilidad analítica a partir de una

muestra homogénea, analizando por triplicado (contenido/potencia/valoración
inicial). Simultáneamente y de la misma muestra, procesar el número de
muestras necesarias para cada condición de almacenaje hasta la etapa
preestablecida (preparaciones) por triplicado, seguir el análisis de cada una de
las preparaciones al término de cada condición de almacenaje utilizando una
solución de referencia recientemente preparada. Reportar el
contenido/potencia/valoración de cada preparación.
Calcular ŷ0, ŷ1, di.
di ≤ 2% métodos cromatográficos y volumétricos
di ≤ 3% para métodos químicos o espectrofotométricos
di ≤ 5% para métodos biológicos

Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado.
Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos como la
distribución t de Dunnett.
• Límite de Detección:
1)LD con base en señal de Ruido:

♣Metodología.- Se aplica en métodos que utilizan instrumentos para medir la
respuesta analítica y presentan una señal de ruido basal.
Determinar la respuesta de blancos (reactivos. Placebos analíticos, etc.) y la
respuesta de muestras analíticas (analitos, placebos adicionados, etc.) en un
intervalo del analito que incluya la especificación de la prueba de impureza
limite. Determinar la cantidad del analito que genere una respuesta con respecto
al blanco en una proporción de 3 a 1, lo que corresponde a la concentración
asociada al limite de detección.
El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite.
2)LD con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos:

♣Metodología.- Se aplica tanto a métodos instrumentales como no
instrumentales.
Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a
valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas
limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Simultáneamente
preparar 5 blancos. Medir las respuestas analíticas. Para la curva de calibración,
sin incluir los blancos, calcular b1, r2 e IC(β1).
Para los blancos, calcular Sb de los blancos.
Calcular el límite de detección:
LD=(3.3 × Sb) /b1
El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal

de ruido.
r2 ≥ 0.98
IC(β1), no debe incluir el cero.
3)LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de regresión:

instrumentales.
limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las
respuestas analíticas.
Calcular b1, r2, Sy/x, IC(β1).
LD=(3.3 × Sy/x) /b1

de ruido.
r2 ≥ 0.98
4)LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la

ordenada al origen:
instrumentales.
limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las
respuestas analíticas.
Calcular b1, r2, Sbo, IC(β1).
LD=(3.3 × Sbo) /b1

de ruido.
r2 ≥ 0.98
• Limite de cuantificación:
1)Señal de Ruido:
♣Metodología.- Se aplica en métodos que utilizan instrumentos para medir la
respuesta analítica y presentan una señal de ruido basal.
Determinar la señal de blancos (reactivos. Placebos analíticos, etc.) y la señal de
muestras analíticas (analitos, placebos adicionados, etc.) a concentraciones
conocidas del analito, inferiores o que incluya la especificación del contenido /
valoración de la prueba de impurezas. Determinar la cantidad del analito cuya
señal sea similar o mayor al blanco en una proporción de 10 a 1, lo que
corresponde a la concentración asociada al limite de detección. Verificar que
dicha cantidad corresponda al limite de cuantificación, evaluando la exactitud y
Repetibilidad del valor estimado.
El LC debe ser menor a la especificación del contenido/ valoración de la prueba

de impurezas.
2)LC con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos:

instrumentales.
valores menores o que incluya la especificación de contenido/ valoración de la
prueba de impurezas, ya sea por dilución o pesada independiente del analito.
Simultáneamente, preparar 5 blancos. Medir las respuestas analíticas. Calcular
b1, r2 e IC(β1).
Para los blancos, calcular Sb de los blancos.
Calcular el límite de cuantificación:
LD=(10 × Sb) /b1
Evaluar la exactitud y Repetibilidad del valor estimado del limite de

cuantificación.
♣Criterio de aceptación:
r2 ≥ 0.98
de impurezas.
3)LC con base en la curva de calibración en la desviación estándar de

regresión:
instrumentales.
Medir las respuestas analíticas.
Calcular b1, r2, Sy/x, IC(β1).
LC=(10 × Sy/x) /b1

cuantificación.
r2 ≥ 0.98
de impurezas.
4)LC con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la

ordenada al origen:
instrumentales.
Medir las respuestas analíticas.
Calcular b1, r2, Sbo, IC(β1).
LC=(3.3 × Sbo) /b1

cuantificación.
r2 ≥ 0.98
de impurezas.
• Robustez:
♣Metodología.- Establecer los factores instrumentales (temperatura y presión
de la columna) y/o no instrumentales (pH de fases) relacionados al método y
sean críticos. En condiciones normales y distintas de operación, analizar la
muestra por triplicado. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito en
la muestra de condiciones normal y distintas, expresadas como %.
Calcular ŷ0, ŷ1, di.
di ≤ 2% métodos cromatográficos y volumétricos
di ≤ 3% para métodos químicos o espectrofotométricos
di ≤ 5% para métodos biológicos

Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos como la
distribución t de Dunnett (para 3 o más condiciones) o t de Student (para 2
condiciones), incluyendo la condición normal.
• Tolerancia:
♣Metodología.- Establecer los factores ajenos al equipo (diferentes equipos,
lotes de reactivos) que se presentan al reproducir el método en otras condiciones
de uso. Fijar 2 condiciones de uso y analizar la muestra por triplicado a cada
condición. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito en todas las
muestras.
Calcular y, S y CV del contenido/potencia/valoración.
CV ≤ 2% métodos cromatográficos y volumétricos
CV ≤ 3% para métodos químicos o espectrofotométricos
Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos. Uno de
ellos es aplicar un análisis de varianza con un criterio de clasificación para
determinar si al menos una de las condiciones de uso es diferente, si se concluye
que si, se realiza una prueba estadística de comparaciones múltiples para
identificar aquellas condiciones que dan lugar a resultados diferentes.
SUSTA CIAS DE REFERE CIA:
Las sustancias de referencia constituyen un componente propio del método y una herramienta
en la evaluación de los parámetros de desempeño, lo que permite establecer la confiabilidad de
la metodología. Para su adquisición se debe contar con procedimientos para su manejo y
aplicación, así como registros del uso y con la documentación que avale una buena práctica de
manejo de dichas sustancias.
• Manejo.- Cada sustancia de referencia debe almacenarse, manejarse y utilizarse de

acuerdo con las especificaciones correspondientes. Cualquier condición especial de
almacenamiento debe indicarse en el marbete y (o) certificado analítico.
Todas las sustancias deben contar con su identificación y registro, teniendo como
mínimo las siguientes:
Para sustancias de referencia primarias:

A) Nombre de la sustancia de referencia,
B) Cantidad,,
C) Lote del producto,
D) Clave (para uso interno)
E) Fecha de adquisición,
F) Pureza (potencia),
G) Fecha de caducidad
H) Riesgo potencial de manejo, e
I ) Indicaciones especiales.
Para sustancias de referencia secundaria:
A) Nombre de la sustancia de referencia,
B) Cantidad certificada,
C) Lote interno,
D) Clave,
E) Fecha de certificación, y
F) Potencia en relación con la sustancia de referencia.
La información mínima para su registro es:
A) Nombre,
B) Lote,
C) Clave de identificación interna,
D) Procedencia (USP, BP, COSUFAR, etc.),
E) Fecha de adquisición,
F) Fecha de empleo,
G) Uso,
H) Cantidad empleada,
I) Cantidad remanente,
J) Analista que la utiliza, y
K) Caducidad
Para las sustancias de referencia secundaria, conviene además:
A) Nombre,
B) Lote,
C) Cálculos para obtener la potencia,
D) Gráficas,
E) Certificado de análisis del material
En la validación de métodos, estos registros son críticos.
Se debe contar con lineamientos que aseguren la no-utilización de sustancias de
referencia caducas.
• Tratamiento:
Cualquier tratamiento previo al que deba someterse la sustancia de referencia lo
debe contemplar la propia metodología, o en su caso, debe especificarse en su
marbete.
Si la sustancia de referencia debe secarse antes de utilizarse, se deberán seguir

las instrucciones de la etiqueta o certificado de análisis; se realizará en otro
envase al original y el excedente se desechará.
• Procedencia:
Algunos centros especializados que proveen sustancias de referencia son:
*British Pharmacopoeia (BP), European Pharmacopoeia (EP)
*European Pharmacopoeia Chemical Refernce Substances (EPCRS),
*Comité de Sustancias Farmacéuticas de Referencia (COSUFAR)
*Organización Mundial de la Salud (OMS)
*Secretaría de Salud (SSA), y
*United States Pharmacopeia (USP)
REVALIDACIÓ :
Se deben establecer y justificar criterios apropiados para revalidación de métodos analíticos, así
como mantener un control de cambios. Cualquier cambio crítico a un método analítico da lugar
a uno nuevo y por lo tanto requiere de una validación como tal.
La siguiente tabla establece cambios en el método, su impacto y el parámetro de desempeño a
revalidar:
CAMBIO IMPACTA PARÁMETRO A REVALIDAR

DISPOSITIVO DE MEDICIÓN VARIACIÓN EN SISTEMA PRECISIÓN DEL SISTEMA
DEL INSTRUMENTO DE DE MEDICIÓN ADECUABILIDAD DEL SISTEMA
MEDICIÓN
CONCENTRACIÓN DE LA EXACTITUD DEL MÉTODO LINEALIDAD DEL SISTEMA Y
SOLUCIÓN DE REFERENCIA EXACTITUD DEL MÉTODO
FORMULACIÓN DEL EXACTITUD DEL MÉTODO EXACTITUD Y REPETIBILIDAD
PRODUCTO DEL MÉTODO
LINEALIDAD DEL MÉTODO
ESPECIFICIDAD
EQUIPOS VARIACIÓN DEL MÉTODO TOLERANCIA
PROVEEDOR DE COLUMNAS VARIACIÓN DEL MÉTODO TOLERANCIA
COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS A ALÍTICOS:
Cuando se quieren comparar 2 métodos para aplicaciones de contenido/potencia/valoración, se

emplean los siguientes procedimientos:
• Estudio de Comparación de Parámetros de Desempeño:

Se utiliza cuando los dos métodos han sido validados y se quiere comparar sus
parámetros de desempeño. En función a su aplicación analítica se indican los
parámetros de desempeño a estudiar:
CAMBIO CO TE IDO/POTE CIA/VALORACIÓ PARÁMETRO A REVALIDAR

ESPECIFICIDAD
PARÁMETROS EXACTITUD Y REPETIBILIDAD
DE LINEALIDAD DEL MÉTODO
DESEMPEÑO PRECISION DEL MÉTODO O PRECISIÓN INTERMEDIA
Los parámetros analíticos a comparar, así como los criterios para establecer la igualdad
de dichos parámetros, son los siguientes:
1) Especificidad:
Debe cumplir para cada método analítico, demostrando su especificidad o
exactitud.
2) Repetibilidad en exactitud:
♣Metodología.- De los datos de exactitud y Repetibilidad utilizar la información
del porcentaje de recobro. Calcular S2 del porcentaje de recobro de cada
método.
El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1.
Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse.
3) Repetibilidad en Linealidad del Método:
♣Metodología.- De los datos de linealidad del método, utilizar la información
del porcentaje de recobro. Calcular la S2 del porcentaje de recobro de cada
método.
4)Exactitud:
♣Metodología.- De los datos de exactitud y Repetibilidad, utilizar la
información del porcentaje de recobro. Calcular la S2, ŷ del porcentaje de
recobro de cada método.
El intervalo de confianza para la diferencia de las 2 medias poblacionales del
porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero.
El análisis estadístico de los resultados, presenta 2 situaciones:
a)Los métodos tienen la misma Repetibilidad (varianzas iguales)
b)Los métodos tienen diferente Repetibilidad (varianzas diferentes);
por lo tanto se tiene que realizar el estudio de comparación de Repetibilidad de
ambos métodos.
5) Linealidad del Método:

♣Metodología.- De los datos de linealidad utilizar la información del porcentaje
de recobro así como la cantidad adicionada y la cantidad recuperada de cada
método. Calcular la
Anexo 15.
6) Precisión del Método:
♣Metodología.- De los datos de precisión del método, utilizar la información del
contenido/potencia/valoración del analito de cada método. Calcular S21 y S22.
Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo16.
• Estudio de Correlación:
Se utiliza cuando se comparan dos métodos cuyos resultados se expresan en
unidades diferentes.
Se aplica a métodos de contenido/valoración/potencia y los parámetros a evaluar
son:
1) Proporcionalidad:
No necesariamente establecen equivalencia de resultados, sino proporcionalidad,
ya que en muchas ocasiones la respuesta analítica es diferente.
a) Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo

analítico.
♣Metodología.-Preparar una cantidad suficiente de placebo analítico con los
componentes que están comúnmente en la muestra, de tal modo que pueda ser
analizado por ambos métodos en tres diferentes niveles del analito, que incluya
la especificación.
Del placebo analítico preparado adicionarle analito al nivel inferior. Fraccionar
en tres muestras y analizar cada muestra por ambos métodos bajo las mismas
condiciones de cada método para determinar el contenido/valoración/potencia.
Repetir este procedimiento con el nivel del 100% superior.
Reportar la relación contenido/valoración/potencia de cada método en cada
muestra del método a comparar (y), método de referencia (x). Calcular b1, b0, r2,
IC(β1), CVy/x.
b) No se conocen los componentes de la muestra.

♣Metodología.- Seleccionar 9 muestras del producto cuyo nivel del analito
cumpla con la especificación, fijar una etapa de los métodos analíticos en los
cuales transfiera una mayor o menor cantidad e la muestra con el objeto de poder
variar el nivel del analito. Tener 3 muestras con nivel bajo, 3 niveles
correspondientes al 100% y 3 con un nivel alto del analito. Las 9 muestras se
analizan por ambos métodos en las mismas condiciones analíticas de cada
método. Determinar el contenido/valoración/potencia de cada muestra.
Reportar la relación contenido/valoración/potencia del método a comparar (y), el
método de referencia (x). Calcular b1, b0, r2, IC(β1), CVy/x.
El IC(β1) no debe incluir el cero.
Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo17.
2) Precisión:
El método no oficial deberá tener una precisión igual a mejor que el método
oficial, o que su precisión sea aceptable para la aplicación analítica.
Inicialmente se debe establecer el método de referencia y el método a comparar.
♣Metodología.-Tanto con el método de referencia como el método a comparar,
dos analistas en dos días deben analizar por triplicado muestras independientes
(pesadas o alícuotas) de un lote homogéneo de producto, cuyo nivel de analito
esté incluido dentro de la especificación. Reportar el
contenido/potencia/valoración del analito de todas las muestras en % para ambos
métodos.
El intervalo de confianza unilateral inferior, para la razón de varianzas del
método a comparar respecto del método de referencia, no debe exceder el valor
de 1.
DOCUME TACIÓ :
Las actividades de la validación de un método analítico deben ser sustentadas por los siguientes
documentos:
a) Protocolo, cuyo contenido es:
1. Titulo
2. Propósito u Objetivo,
3. Responsabilidades,
4. Plan de prueba describiendo los parámetros de desempeño que permitan
verificar la aplicación analítica deseada,
5. Criterios de aceptación para cada parámetro,
6. Formato de registro de resultados.
b) Reporte, cuyo contenido es:
1. Titulo,
2. Resultados,
3. Análisis de resultados,
4. Confrontación contra los criterios de aceptación,
5. Conclusión
Es crítico documentar los registros analíticos; dicha documentación deberá estar ordenada y
disponible, en responsabilidad del área de calidad.
CO CORDA CIA CO GUIAS I TER ACIO ALES:
Esta guía es equivalente a:

Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures
ICH-Q2Q, March 1995
Guideline on the Validation of Analytical Procedures, Methodology,
Availability. Notice ICHQ2B.
USP24. Validation of Compendial Methods.
Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods CDER.
November 1994, CMC 3.
BIBLIOGRAFIA:
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 7a Ed. México (2000).

Métodos Analíticos Validación Guías Generales de Validación de la DGCIS,
SSA (1989).
Ley General de Salud (1997)
NMX-CC-1-1990 Sistemas de Calidad Vocabulario
NMX-CC-2-1990 Sistemas de Calidad- Gestión de Calidad, Guía para la
Selección, el Uso de Normas de Aseguramiento de Calidad.
Reglamento de Insumos para la Salud (1998).
Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-1993. Buenas prácticas de
fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica
dedicados a la fabricación de medicamentos.
NOM-177-SSA1-1998 “Que establece las pruebas y procedimientos para
demostrar que un medicamento es intercambiable”
Guidance for Industry Bioanalytical methods Validation for Human Studies,
December, 1998 FDA.
Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures ICH-Q2A,
March 1995.
Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods, CDER,
November 1994, CMC 3.
Guideline for Industry Analytical Procedures and Methods Validation, August
2000, FDA.
Guideline for submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation,
February 1987, FDA.
ICH Harmonised Tripartile Guideline Validation Analytical Procedures
Methodology 6 Nov 1996.
USP24, Validation of Compendial Methods.
Norma Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos.
Diseño y Análisis de Experimentos, Montgomery D. C., Grupo Editorial
Iberoamérica, 3ª Ed. México (1991).
A EXOS:
UMERO CO TE IDO
1 FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL SISTEMA
2 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ADECUABILIDAD DEL SISTEMA
3 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA
4 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA EXACTITUD Y Repetibilidad
DEL MÉTODO
5 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO
6 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISION DEL MÉTODO
(PRECISIÓN INTERMEDIA)
7 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ESTABILIDAD ANALÍTICA
DE LA MUESTRA
8 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE DETECCIÓN
9 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE CUANTIFICACION
10 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ROBUSTEZ
11 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA TOLERANCIA
12 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA REPETIBILIDAD Y EXACTITUD
PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
13 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA REPETIBILIDAD EN
LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
14 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN EXACTITUD PARA COMPARACIÓN
DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
15 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO
PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
16 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN PRECISIÓN DEL
MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
17 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PROPORCIONALIDAD DE
MÉTODOS EN ESTUDIOS DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE
2 MÉTODOS ANALÍTICOS
18 FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL MÉTODO
EN ESTUDIO DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS
19 TABLA ESTADÍSTICA DE LA DISTRIBUCIÓN t DE Student
20 TABLAS ESTADÍSTICAS DE LA DISTRIBUCIÓN F DE FISHER
21 COMENTARIOS RESPECTO A LOS CÁLCULOS Y REGLAS DE REDONDEO
A EXO 1. FÓRMULAS Y PROCEDIMEIT O DE CÁLCULO PARA PRECISIÓ

DEL SISTEMA.
A)FORMULAS:
Media Aritmética
y=
∑y
n
Desviación Estándar
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
Coeficiente de variación
S
CV = * 100
y
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO:
Tabular los resultados
Calcular Σy, Σy2 y determinar n.
Calcular ŷ y S
Calcular el CV
A EXO 2. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA

ADECUABILIDAD DEL SISTEMA.
A)FORMULAS:
Media Aritmética
y=
∑y
n
Desviación estándar
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
S
CV = * 100
y
Calcular ŷ y S
Calcular el CV
A EXO 3. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA LI EALIDAD

DEL SISTEMA.
A)FORMULAS:
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
Ordenada al origen
b0 =
∑ y−b ∑x1
n
Coeficiente de determinación
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2
r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
Intervalo de confianza para la pendiente
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
t0.975, n-2 = Referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de
Student.
Calcular Σx, Σy, Σx2, Σy2, Σxy, y determinar n.
Calcular b1, b0, r2
Calcular el Sy/x y Sb’
Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(β1)
A EXO 4. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA EXACTITUD

Y REPETIBILIDAD DEL MÉTODO.
A)FORMULAS:
Media aritmética
y=
∑y
n
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
S
CV = * 100
y
Intervalo de confianza para la media poblacional
S
IC ( µ ) = y ± t 0.975, n − 1
n
t0.975, n-1 Referirse al anexo 19 para determinar el valor de t de
Student
n = numero de recobros.
Calcular ŷ y S
Calcular el CV
Determinar en el anexo 19 t0.975, n-1 y calcular IC(µ)
A EXO 5. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA LI EALIDAD

DEL MÉTODO.
5.1 CANTIDAD ADICIONADA VS CANTIDAD RECUPERADA
A)FORMULAS:
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
Ordenada al origen
b0 =
∑ y − b1∑ x
n
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb’
1
Sb ' = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
t0.975, n-2 = Referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de
Student.
Intervalo de confianza para la ordenada al origen

IC(βo) = bo ± t0.975,n-2Sbo
Sbo = Sy / x
1
+
(x )2
n (∑ x )2
∑ x2 − n
x=
∑x
n
Coeficiente de variación de regresión
Sy / x
CVy / x = × 100
y
y=
∑y
n
Calcular b1, b0, r2
Calcular x y Sbo
Calcular IC(b0)
Calcular el CVy/x
5.2 PORCENTAJE DE RECOBRO
A)FORMULAS:
Media aritmética
y=
∑y
n
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
S
CV = * 100
y
Intervalo de confianza para la media poblacional
S
IC ( µ ) = y ± t 0.975, n − 1
n
Calcular ŷ y S
Calcular el CV
Determinar en el anexo 19 t0.975, n-1 y calcular IC(µ)
A EXO 6. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA PRECISIÓ

DEL MÉTODO (PRECISIÓ I TERMEDIA).
A)FORMULAS:
Media aritmética
y=
∑y
n
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
S
CV = * 100
y
Calcular ŷ y S
Calcular el CV

ESTABILIDAD A ALÍTICA DE LA MUESTRA.
A)FORMULAS:
Media aritmética del análisis inicial
y0 =
∑y 0
no
no = número de muestras del análisis inicial
Media aritmética del análisis de cada condición de almacenaje
y1 =
∑y 1
n1
n1 = número de muestras del análisis de la i-ésima condición de almacenaje
Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de

almacenaje respecto de la media aritmética del análisis inicial
di = y1 − y 0
Calcular Σy0, Σy1, Σy2, Σy3 y determinar no, n1, n2, n3
Calcular ŷo, ŷ1, ŷ2, ŷ3
Calcular di
A EXO 8. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA LIMITE DE

DETECCIÓ .
8.1 SEÑAL RUIDO
Tabular los resultados.
8.2 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADO EN LA DESVIACIÓN
ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS
A)FORMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACIÓN:
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x
1
n
t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de
Student
B)FORMULA PARA LOS BLANCOS

Desviación estándar de los blancos
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
Sb =
n(n − 1)
n = numero de blancos
C)FORMULA PARA EL LIMITE DE DETECCIÓN
3. 3 × Sb
LD =
b1
D)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACIÓN

Calcular b1, r2
Calcular el Sy/x y Sb1, bo
E)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS
Calcular Σy, Σy2, y determinar n.
Calcular Sb
Calcular el LD
8.3 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADA EN LA DESVIACIÓN

ESTÁNDAR DE REGRESIÓN
A)FORMULAS
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x 1
t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
Limite de detección
3. 3 × Sy / x
LD =
b1
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO
Calcular b1, r2
Calcular el Sy/x y Sb’, bo
Calcular el limite de detección
ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN
A)FORMULAS
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x 1
n
Desviación estándar de la ordenada al origen

Sbo = Sy / x
1
+
(x )2
n (∑ x )2
∑ x2 − n
x=
∑x
n
Limite de detección
3.3 × Sbo
LD =
b1
Calcular b1, r2
Calcular x y Sbo
Calcular el LD
A EXO 9. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA LIMITE DE

CUA TIFICACIÓ .
9.1 SEÑAL RUIDO
Tabular los resultados.
ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS
A)FORMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACIÓN:
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x
1
n
B)FORMULA PARA LOS BLANCOS

Desviación estándar de los blancos
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
Sb =
n(n − 1)
n = número de blancos
C)FORMULA PARA EL LIMITE DE CUANTIFICACIÓN
10 × Sb
LC =
b1
D)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACIÓN

Calcular b1, r2
E)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS
Calcular Σy, Σy2, y determinar n.
Calcular Sb
Calcular el LC
9.3 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADA EN LA DESVIACIÓN
ESTÁNDAR DE REGRESIÓN
A)FORMULAS
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x1
n
Limite de cuantificación
10 × Sy / x
LC =
b1
Calcular b1, r2
Calcular el LC

ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN
A)FORMULAS
Pendiente
n ∑ xy − ∑ x∑ y
b1 =
n∑ x 2 − (∑ x )2
(n(∑ xy ) − (∑ x )(∑ y ))2

r2 =
(n(∑ x2) − (∑ x )2)(n(∑ y 2) − (∑ y )2)
IC(β1) = b1 ± t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 = Sy / x
(∑ x )2
∑ x2 − n
Sy / x =
∑ y 2 − b ∑ xy − b ∑ y
1 o
n−2
b0 =
∑ y−b ∑x 1
n
Desviación estándar de la ordenada al origen
Sbo = Sy / x
1
+
(x )2
n (∑ x )2
∑ x2 − n
x=
∑x
n
Limite de cuantificación
10 × Sb
LC =
b1
Calcular b1, r2
Calcular x y Sbo
Calcular el LC
A EXO 10. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CÁLCULO PARA ROBUSTEZ.
A)FORMULAS:
Media aritmética de la condición de operación.
yo =
∑ y0
n0
no = numero e muestras de la condición normal de operación
Media aritmética del análisis de cada condición de operación diferente a

la condición normal
y1 =
∑ y1
n1
n1 = numero de muestras de la i-esima condición de operación
Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición respecto de

la media aritmética de la condición normal.
di = y1 - y0
Calcular Σy0, Σy1, Σy2, y determinar no, n1, n2.
Calcular ŷo, ŷ1, ŷ2.
Calcular di

TOLERA CIA
A)FORMULAS:
Media aritmética
y=
∑y
n
n(∑ y 2 ) − (∑ y )2
S=
n(n − 1)
S
CV = * 100
y
Calcular ŷ y S
Calcular el CV

REPETIBILIDAD E EXACTITUD PARA COMPARACIÓ DE 2
MÉTODOS A ALÍTICOS.
A)FORMULAS:
Varianza
n∑ y 2 − (∑ y )2
S2 =
n(n − 1)
Nota: Calcular la varianzas de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza
para la razón de varianzas, se debe establecer.
S12= varianza menor
S22= varianza menor
Intervalo de confianza para la razón de varianzas.
S 22
× F 0.025, n 2 − 1, n1 − 1 ≤ σ 22 ≤
S 22 × F 0.975, n 2 − 1, n1 − 1
S 12 σ 12 S 12
F0.025,n2-1, n1-1 y F0.975, n2-1, n1-1 = Referirse al anexo 20 para determinar el valor de la F de Fisher
n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados
de libertad del numerador; y n1-1 son los grados de libertad de la varianza
menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
.n1 = numero de recobros del método de varianza menor
.n2 = numero de recobros del método de varianza mayor
Calcular Σy, Σy2 y determinar n para cada método analítico
Calcular la varianza de cada método
Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12)
Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1
Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas.

REPETIBILIDAD E LI EALIDAD DEL MÉTODO PARA
COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS A ALÍTICOS.
A)FORMULAS:
Varianza
n∑ y 2 − (∑ y )2
S2 =
n(n − 1)
S12= varianza menor
S22= varianza menor
S 22
× F 0.025, n 2 − 1, n1 − 1 ≤ σ 22 ≤
S 22 × F 0.975, n 2 − 1, n1 − 1
S 12 σ 12 S 12
Calcular el porcentaje de recobro de cada muestra en cada método (y), al
obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad
adicionada expresada en porcentaje.
Calcular Sy, Sy2 y determinar n para cada método analítico
Determinar en el anexo 20 F0.025 n2-1, n1-1y y F0.925, n2-1, n1-1y
A EXO 14. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO E EXACTITUD

PARA COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS A ALÍTICOS.
14.1 COMPARACIÓN DE Repetibilidad DE AMBOS MÉTODOS:
A)FORMULAS:
Varianza
n∑ y 2 − (∑ y )2
S2 =
n(n − 1)
S12= varianza menor
S22= varianza menor
S 22
× F 0.025, n 2 − 1, n1 − 1 ≤ σ 22 ≤
S 22 × F 0.975, n 2 − 1, n1 − 1
S 12 σ 12 S 12
14.2 IGUAL REPETIBILIDA (VARIANZAS EQUIVALENTES):
A)FORMULAS:
Media aritmética del método 1.
y1 =
∑y 1
n1
y2 =
∑y 2
n2
Varianza del método 1.
n1∑ y12 − (∑ y1)2

S 12 =
n1(n1 − 1)
n 2∑ y 22 − (∑ y 2 )2
S 22 =
n 2(n 2 − 1)
Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales.
IC (µ 1 − µ 2 ) = (y1 - y2 ) ± t 0.975 n1 + n 22
Tabular otra vez los resultados.
Calcular Σy1, Σy2, Σy12, Σy22, y determinar n1 y n2.
Calcular ŷ1, ŷ2
Calcular S12, S22
Determinar en el anexo 19 t0.975, n1+n2 y calcular IC(µ1-µ2)
14.3 DIFERENTE REPETIBILIDAD (VARIANZAS DIFERENTES):
A)FORMULAS:
Calcular ŷ1, ŷ2
Calcular S12, S22
Calcular gl
Determinar en el anexo 19 t0.975, gl y calcular IC(µ1-µ2)
A EXO 15. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO E LI EALIDAD

DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS
A ALÍTICOS.
15.1 CANTIDAD ADICIONADA (x) VS CANTIDAD RECUPERADA (y):
A)FORMULAS:
Sumatorias
Pendiente del método 1.
Pendiente del método 2.
Ordenada al origen del método 1.
Ordenada al origen del método 2.
Desviación estándar de regresión.
Intervalo de confianza para la diferencia de las 2 pendientes.
Intervalo de confianza para la diferencia de las ordenadas al origen
Calcular Σx1, Σx12, Σx2, Σx22, Σy1, Σy12, Σxy1, Σy2, Σy22, Σxy1 y
determinar n1 y n2.
Calcular b11, b12, b01, bo2
Calcular Sx/y y Sb11 – Sb12
Determinar en el anexo 19 t0.97523, y calcular IC(β1-β2)
Calcular x1, x2, Sbo1-Sbo2
Calcular IC(β01-β02)
15.2 PORCENTAJE DE RECOBRO:
15.2.1 COMPARACIÓN DE Repetibilidad DE AMBOS MÉTODOS
A)FORMULAS:
Varianza
15.2.2 IGUAL Repetibilidad (VARIANZAS EQUIVALENTES)
A)FORMULAS:
15.3 DIFERENTE REPETIBILIDAD (VARIANZAS DIFERENTES):
A)FORMULAS:

Calcular ŷ1, ŷ2
Calcular S12, S22
Determinar en el anexo 19 t0.975, gl y calcular IC(µ1-µ2)
A EXO 16. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO E PRECISIÓ DEL

MÉTODO PARA COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS A ALÍTICOS.
A)FORMULAS:
Varianza

PROPORCIO ALIDAD DE MÉTODOS E ESTUDIO DE
CORRELACIÓ PARA COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS
A ALÍTICOS.
A)FORMULAS:
Pendiente
Ordenada al origen
Coeficiente de variación de regresión.
Tabular los resultados (datos primarios)
Calcular b1, b0, r2
A EXO 18. FÓRMULAS Y PROCEDIMIE TO DE CALCULO PARA PRECISIÓ

DEL MÉTODO E ESTUDIOS DE CORRELACIÓ PARA
COMPARACIÓ DE 2 MÉTODOS A ALÍTICOS
A)FORMULAS:
Varianza del método oficial.
Varianza del método no oficial.
Limite unilateral inferior de confianza para la razón de varianzas.
Tabular los resultados (datos primarios)
Calcular la varianza del método oficial y del método no oficial.
Determinar en el anexo 20 F0.05
Calcular el limite unilateral inferior de confianza para la razón de
varianzas.
A EXO 19. TABLA ESTADÍSTICA DE LA DISTRIBUCIÓ t DE Student.
GRADOS DE t0.975 GRADOS DE t0.975 GRADOS DE t0.975

LIBERTAD LIBERTAD LIBERTAD
1 12.706 26 2.056 51 2.008
2 4.303 27 2.052 52 2.007
3 3.182 28 2.048 53 2.006
4 2.776 29 2.045 54 2.005
5 2.571 30 2.042 55 2.004
6 2.447 31 2.040 56 2.003
7 2.365 32 2.037 57 2.002
8 2.306 33 2.035 58 2.002
9 2.262 34 2.032 59 2.001
10 2.228 35 2.030 60 2.000
11 2.201 36 2.028 61 2.000
12 2.179 37 2.026 62 1.999
13 2.160 38 2.024 63 1.998
14 2.145 39 2.023 64 1.998
15 2.131 40 2.021 65 1.997
16 2.120 41 2.020 66 1.997
17 2.110 42 2.018 67 1.996
18 2.101 43 2.017 68 1.995
19 2.093 44 2.015 69 1.995
20 2.086 45 2.014 70 1.994
21 2.080 46 2.013 71 1.994
22 2.074 47 2.012 72 1.993
23 2.069 48 2.011 73 1.993
24 2.064 49 2.010 74 1.993
25 2.060 50 2.009 75 1.992

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GUÍA DE VALIDACIÓ

Un método analítico es la descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y

DEFI ICIO ES:

CLASIFICACIÓ DE MÉTODOS A ALÍTICOS:

Los métodos se clasifican bajo los siguientes criterios:

En función de la aplicación analítica de un método, se indican los parámetros de desempeño a

*Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza del método.

DETERMI ACIO ES, METODOLOGÍA Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓ :

• Precisión del Sistema:

Calcular S y CV de la respuesta analítica;

Las formulas y el procedimiento se encuentra en el anexo 1.

• Adecuabilidad del sistema (Métodos cromatográficos):

CV ≤ 2% para respuesta analítica.

Para cada inyección, se recomienda:

Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 2.

La evaluación de adecuabilidad del sistema permite verificar que el sistema de

• Linealidad del sistema:

Para contenido/potencia/valoración se sugiere un mínimo de ±20%

Para contenido/valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un 20%

Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120%

Es critico que el intervalo no excluya valores de concentración que

Otro criterio de aceptación debe ser justificado.

Es conveniente trazar la gráfica de la concentración (x) vs la respuesta analítica

En métodos de identificación seleccionar sustancias que potencialmente

Para métodos de contenido/ potencia/ valoración, se analizan placebos del

Para métodos de contenido/ valoración de impurezas, se adicionan éstas al

Para métodos de límite de impurezas se analizaran las muestras de impurezas

Para métodos indicadores de inestabilidad, si se cuenta con los productos de

1) Someter el analito, el placebo y la muestra a temperaturas de 20°C por debajo

El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a

Para métodos no selectivos, la especificidad se sustenta con los resultados de

• Exactitud y Repetibilidad del método:

A)Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico.

B)Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina

Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo analítico, al obtener el

Calcular ŷ, S, CV e IC(µ) del porcentaje de recobro.

IC(µ) debe incluir el 100% o que el promedio aritmético del % de

A) Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico.

B) Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina

El intervalo de la concentración del analito adicionado depende del propósito del

PROPÓSITO ESPECIFICACIÓ I TERVALO MÍ IMO

Q = 75% 40% a 130%

El IC(µ) debe incluir el 100% o el promedio aritmético del % de recobro

Otro criterio de aceptación debe ser justificado.

Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 5.

Es conveniente trazar la gráfica de la cantidad adicionada (x) vs la cantidad

• Precisión del Método (Precisión Intermedia o Tolerancia interdía / analista):

Calcular ŷ, S, CV del contenido/potencia/valoración, utilizando todos los

Valores superiores deben ser justificados.

Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 6.

Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos

• Estabilidad Analítica de la Muestra:

En muestras dependientes, determinar la estabilidad analítica procesando hasta la

En muestras independientes, determinar la estabilidad analítica a partir de una

Calcular ŷ0, ŷ1, di.

No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del

Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 7.

1)LD con base en señal de Ruido:

El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite.

2)LD con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos:

LD=(3.3 × Sb) /b1

El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal

3)LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de regresión: